謝思雨，李淼生，江峰樂，易 茜，楊 魏

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 廣州510515

肝癌是我國一種常見的惡性腫瘤，惡性程度較高，病情進展較快［1］，也是60歲以下男性癌癥死亡的主要原因［2］。其中，肝細胞癌（HCC）占原發(fā)性肝癌的70%～80%［3］。由于HCC通常被診斷為晚期，因此許多患者錯過了最佳的治療方法。HCC的發(fā)生機制還未研究透徹，且由于HCC是由多種致病因素引起的復(fù)雜疾病，有必要闡明HCC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制，特別是尋找潛在的分子生物學(xué)標記物來改善HCC患者的預(yù)后。既往研究鑒定了甲胎蛋白、Glypican-3等蛋白質(zhì)為HCC發(fā)生發(fā)展的重要生物標志物，但由于HCC的異質(zhì)性，其敏感性和特異度較低［4］。隨著基因測序技術(shù)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，人們將基因特征與臨床參數(shù)相結(jié)合，以期提高HCC患者的預(yù)后［5］。在生物信息學(xué)中，基因表達總覽（GEO）、腫瘤基因組圖譜（TCGA）、基因表達譜交互分析（GEPIA）、人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）等公共數(shù)據(jù)庫是常用的數(shù)據(jù)庫，Kaplan-Meier繪圖儀是分析基因預(yù)后價值的工具。通過這些技術(shù)，既往研究發(fā)現(xiàn)了與HCC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的Hub基因［6］。本研究通過運用GSEA篩選HCC組織與癌旁組織的差異通路，分析發(fā)現(xiàn)Hub基因Enoyl-CoA水合酶和3-hydroxyacyl CoA脫氫酶（EHHADH）作為重要分子參與到數(shù)條顯著改變的脂肪酸代謝相關(guān)通路中。

EHHADH是3-hydroxyacyl-CoA脫氫酶家族的成員，是過氧化體β氧化途徑的四種酶之一，催化長鏈二羧酸降解，在肝細胞過氧化物酶脂肪氧化通路中起到重要作用［7］。脂肪酸的β-氧化發(fā)生在線粒體和過氧化酶體中。在線粒體中，脂肪酸分子被分解成乙酰輔酶A，后者在檸檬酸循環(huán)中被氧化成二氧化碳以產(chǎn)生能量［8,9］。在超長鏈脂肪酸的分解、膽汁酸的合成和髓鞘脂類的合成中，都涉及到過氧化物酶的β-氧化［10,11］。最近，過氧化物體在人類健康方面受到了關(guān)注，它可能對許多疾病產(chǎn)生影響，如神經(jīng)退行性變、年齡相關(guān)疾病和癌癥［12］。過氧化物體功能障礙與HCC腫瘤細胞中多種代謝紊亂有關(guān)［13］。既往研究表明EHHADH與多種腫瘤例如骨肉瘤、卵巢癌等的發(fā)生發(fā)展及耐藥相關(guān)［14-16］。然而，該基因在HCC中的表達與作用尚未被闡明。

本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫、TCGA 數(shù)據(jù)庫、ICGC數(shù)據(jù)庫等，初步探討了HCC組織中EHHADH的表達水平及對HCC 的預(yù)后影響。推測TP53 突變可能與EHHADH上游基因PPARGC1A轉(zhuǎn)錄組水平異常相關(guān)，進一步導(dǎo)致EHHADH 轉(zhuǎn)錄組水平下調(diào)。并推測EHHADH參與阻止HCC細胞去分化及調(diào)控HCC細胞鐵死亡進程。過表達EHHADH可能可以阻止HCC細胞去分化進程以及可能可以促進HCC細胞鐵死亡；索拉菲尼治療可能對高表達EHHADH的HCC有效。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及篩選（表1）

表1 本研究中所使用的數(shù)據(jù)情況Tab.1 Data used in this study

基于腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA，https://cancergenome.nih.gov/），本研究收集了HCC數(shù)據(jù)集（LIHC）及癌旁組織的基因表達數(shù)據(jù)，同時整理了患者的臨床信息，共包括371 例HCC患者數(shù)據(jù)，其中50 例患者同時含有癌旁組織和腫瘤組織，并將數(shù)據(jù)集命名為HCC421。

基于國際癌癥基因組聯(lián)合會數(shù)據(jù)庫（ICGC，https://dcc.icgc.org/releases/current/Projects），本研究收集了240個HCC腫瘤組織樣本和202個癌旁樣本（ICGC-LIHC-JP），并將數(shù)據(jù)集命名為HCC442。

基于高通量基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO，https://www.ncbi.nlm.），本研究收集了247個HCC腫瘤組織樣本和241個癌旁樣本的基因表達數(shù)據(jù)（GSE14250），并將數(shù)據(jù)集命名為HCC488。

蛋白質(zhì)表達譜來自臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC，https://proteomics.cancer.gov/programs/cptac）和國際癌癥蛋白質(zhì)組聯(lián)盟（ICPC，https://icpc.global）數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)。

1.2 組織標本

石蠟組織樣本從南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院獲取。納入標準：術(shù)后病理明確診斷為HCC；手術(shù)時年齡≥18歲；能從病歷資料中獲取完整的人口學(xué)資料、病理診斷結(jié)果、腫瘤分期等信息，暫無隨訪信息。排除標準：調(diào)取蠟塊標本時，研究者判斷認為可切片的組織量較少；經(jīng)研究者判斷，存在其他可能影響存檔樣本完整性的情況；術(shù)前接受過肝動脈化療栓塞治療。符合條件的病例共30例。上述臨床樣本的獲取由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會審查并批準，倫理批件號為NFEC-2021-207。

1.3 GSEA

為初步篩選HCC發(fā)生發(fā)展中的驅(qū)動基因，本研究運用OmicShare（https://www.omicshare.com/tools）進行GSEA分析?；贖CC488數(shù)據(jù)集與GSEA算法，探索了HCC腫瘤組織相對于癌旁組織發(fā)生的通路改變。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Hiplot（https://hiplot.org）是一款用于科學(xué)數(shù)據(jù)可視化的綜合Web平臺。本研究基于Hiplot工具繪制了顯著改變的生物學(xué)通路及差異表達基因的韋恩圖及漸變柱狀圖，從而獲得重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)較多的Hub基因。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄組水平差異及生存曲線繪制

為確定EHHADH在HCC中的表達模式，本研究基于工具UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/），分析EHHADH在21種腫瘤、癌旁組織中的差異表達。同時探討了HCC細胞去分化程度、TP53突變與EHHADH表達之間的聯(lián)系。UALCAN是基于TCGA、CPTAC、ICPC數(shù)據(jù)庫的全面、用戶友好和交互的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)資源工具，可用于分析癌癥OMICS數(shù)據(jù)［17］。

為分析HCC421數(shù)據(jù)集與患者臨床信息之間的相關(guān)性，本研究在臨床生信之家平臺（www.aclbi.com）中，基于Malta等人構(gòu)建的OCLR算法來預(yù)測mRNAsi，基于HCC421數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)與Spearman相關(guān)［18,19］，并通過線性變換，將預(yù)測的腫瘤細胞干性指數(shù)映射到[0,1]范圍。基于單變量Cox回歸分析本研究分析了兩組數(shù)據(jù)之間的生存差異，P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

為確定EHHADH 獨立危險因素，基于HCC421、HCC488、HCC442 數(shù)據(jù)集與R 包“survminer”計算EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平最佳分箱值后，通過Hiplot在線可視化工具展示EHHADH高低表達組之間的生存差異。

1.5 基因突變瀑布圖及相關(guān)性分析

為研究EHHADH在腫瘤基因組層面突變情況，本研究基于HCC421數(shù)據(jù)集以及患者的臨床信息，利用R軟件中的maftools軟件包實現(xiàn)HCC患者的體細胞突變情況可視化。

為觀察上述研究推測的若干個基因與EHHADH之間的關(guān)系，作多個基因與EHHADH相關(guān)性熱圖，基因之間的相關(guān)性展示通過R軟件包ggstatsplot與pheatmap來實現(xiàn)，多基因相關(guān)性圖通過R軟件包pheatmap進行展示。Spearman相關(guān)分析用于分析不符合正態(tài)分布的定量變量之間的相關(guān)性，P<0.05為相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 差異基因的功能和通路富集分析

為觀察EHHADH與全部基因組間的關(guān)聯(lián)分析從而探索EHHADH潛在的功能，基于HCC421數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)，根據(jù)各個基因轉(zhuǎn)錄組水平，采用Spearman相關(guān)性分析評估兩兩基因間的相關(guān)性，分析獲得基因列表。兩基因相關(guān)性圖通過R軟件包ggstatsplot進行實現(xiàn)。

在線工具數(shù)據(jù)庫Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一個基于Web的門戶網(wǎng)站，旨在為實驗生物學(xué)家提供全面的基因列表注釋和分析資源［20］。使用Metascape，基于上述分析所得到的基因列表根據(jù)相關(guān)性從強到弱排序，選取前300個基因（剔除10個假基因后，最后獲得290個基因），將此290個基因加上EHHADH，共291個基因進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書KEGG通路富集分析，閾值為FDR<0.05。

1.7 鐵死亡標記基因表達差異

為了對高/低表達EHHADH的HCC樣本進行鐵死亡的差異分析，本研究基于HCC421數(shù)據(jù)集，評估患者腫瘤組織的鐵死亡相關(guān)基因的表達與EHHADH表達之間的聯(lián)系。結(jié)果通過R（v4.0.3）軟件包ggplot2 和pheatmap進行展示。鐵死亡相關(guān)基因是由Liu等［21］發(fā)現(xiàn)的一組在腫瘤細胞中發(fā)揮功能的基因集。

基于HCC421 數(shù)據(jù)集以及患者的臨床信息，EHHADH基因與各鐵死亡相關(guān)基因之間的相關(guān)性展示通過R軟件包ggstatsplot與pheatmap來實現(xiàn)Spearman相關(guān)分析用于分析不符合正態(tài)分布的定量變量之間的相關(guān)性，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.8 免疫組化分析

首先將石蠟包埋的肝癌組織或遠癌正常組織蠟塊以1.5 μm連續(xù)切片及烤干，使用二甲苯溶液和配制好的不同濃度的乙醇進行脫蠟，之后使用檸檬酸緩沖液或EDTA緩沖液和內(nèi)源性過氧化物酶進行抗原熱修復(fù)和阻斷，使用自配的PBS緩沖液沖洗兩次，完成以上步驟后再加入一抗4 ℃孵育過夜（EHHADH稀釋比1∶100，Shengon Biotech D222276），繼續(xù)加入新型酶標羊抗兔IgG聚合物Ⅲ，室溫1 h，接著使用DAB（中杉金橋有限公司）顯色1 min，之后使用蘇木精染核1 min，最后梯度脫水并進行封片鏡檢。

石蠟塊用石蠟切片機以1.5 μm連續(xù)切片。每1例蠟塊隨機抽取一張切片進行HE染色，使用二甲苯溶液和配制好的不同濃度的乙醇進行脫蠟，流水1 min后，蘇木素浸泡8 min，鹽酸酒精分化3 s，流水15 min反藍，伊紅3 min，最后梯度脫水并進行封片鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 脂肪酸氧化酶相關(guān)基因EHHADH下調(diào)在HCC最顯著下調(diào)信號通路中富集

基于HCC488數(shù)據(jù)集與GSEA分析，本研究在對247個HCC組織與相對應(yīng)的241個癌旁組織進行的差異分析中共找到了61條KEGG通路（P<0.05）。本研究分別選取上調(diào)與下調(diào)KEGG通路中NES值前20的通路（圖1A），并發(fā)現(xiàn)下調(diào)通路中，脂肪酸氧化酶相關(guān)基因EHHADH基因出現(xiàn)于5條通路中（圖1B），且其中4條（脂肪酸代謝、丁酸代謝、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸降解、色氨酸代謝）與HCC發(fā)展相關(guān)，從而確定EHHADH為下調(diào)通路中與脂肪酸氧化相關(guān)的Hub基因。

圖1 基于HCC488數(shù)據(jù)集的GSEA分析Fig. 1 GSEAanalysis based on HCC488 dataset.A:Gradient histogram consisting of the top 20 upregulated and down-regulated KEGG pathways in HCC tissues compared with non-tumor tissues based on the results of GSEA analysis.B:Intersection of the genes of the top 20 up/downregulated KEGG pathways show involvement of EHHADH in 5 down-regulated pathways.

基于上述研究支持，為確定EHHADH在HCC中的表達模式，基于UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析HCC 組織中EHHADH基因mRNA表達水平，UALCAN數(shù)據(jù)庫中TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平的中位數(shù)在遠癌正常肝組織以及HCC 組織分別是119.136、52.731 每百萬轉(zhuǎn)錄本（TPM），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<3.433，圖2A）。同時，HCC488數(shù)據(jù)集和HCC442數(shù)據(jù)集中，EHHADH的表達模式與HCC421一致（圖2B、C）。

圖2 EHHADH在遠癌正常組織和肝癌組織中的表達Fig. 2 Expression of EHHADH in non-tumor tissues and tumor tissues of HCC. A-C: EHHADH expression in HCC and non-tumor tissues from HCC421 dataset,HCC442 dataset and HCC488 dataset.D:Protein expression of EHHADH in HCC and non-tumor tissues in CPTAC dataset. E-H: Representative results of immunohistochemistry showing EHHADH expression in non-tumor and HCC tissues.****P<0.0001.

基于UALCAN數(shù)據(jù)庫分析HCC組織中EHHADH基因編碼的蛋白質(zhì)水平，UALCAN數(shù)據(jù)庫中CPTAC數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，EHHADH的蛋白水平在HCC組相較于遠癌正常組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<9.183，圖2D）。此外，免疫組化結(jié)果顯示，與遠癌正常組織相比，HCC組織中EHHADH的蛋白表達水平較低（圖2E～H）。

2.2 EHHADH表達下調(diào)與TP53移碼缺失或錯義突變顯著相關(guān)

本研究基于HCC421數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，應(yīng)用Oncoplot顯示HCC患者的體細胞突變景觀（圖3A）。結(jié)果表明在HCC患者的基因組中TP53突變率最高（突變率為28%）。在低表達EHHADH組中TP53基因發(fā)生移碼缺失或錯義突變情況占本組TP53所有突變情況的80%，在高表達EHHADH組中TP53基因發(fā)生移碼缺失或錯義突變情況占本組TP53所有突變情況的60%，經(jīng)卡方檢驗，在低表達EHHADH組中TP53基因發(fā)生移碼缺失或錯義突變較高表達組更為明顯（P<0.05）。

圖3 HCC隊列的體細胞景觀Fig. 3 Somatic landscape of HCC cohort.A:Oncoplot shows the somatic landscape of HCC cohort.Genes are ordered by their mutation frequencies,samples are ordered by disease histology,as indicated by the annotation bar(bottom).Side bar plot shows the-log10-transformed q-values,as estimated using MutSigCV.Waterfall plot shows mutation information for each gene for each sample.Color annotation of various cancer types are shown at the bottom.The barplot above the legend shows the number of mutation burden; B-F: EHHADH/PPARGC1B/PPARGC1A/PPARG/PPARD expression in TP53 Mutant tumor,TP53 Non-Mutant tumor and non-tumor tissues in TCGAdata;G:Aheatmap of the correlation between multiple genes and multiple genes.Blue represents positive correlation whereas red represents negative correlation,the darker the color,the stronger the relation

基于UALCAN數(shù)據(jù)庫中HCC421數(shù)據(jù)集分析，數(shù)據(jù)顯示EHHADH基因轉(zhuǎn)錄組水平的中位數(shù)在TP53突變組患者HCC組織以及TP53未突變患者HCC組織分別是44.222、56.033 TPM，P<2.532，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）。EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平在TP53突變組患者中較TP53未突變患者顯著下調(diào)。

由于EHHADH基因本身在HCC患者體細胞基因突變中占比僅約為1%，其轉(zhuǎn)錄組水平降低與其本身發(fā)生基因突變的關(guān)系不顯著。且目前暫未有研究說明TP53與EHHADH二者間有直接的相互作用關(guān)系，所以我們推測EHHADH上游作用因子受TP53調(diào)控進而影響EHHADH的轉(zhuǎn)錄組水平變化。

KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）中顯示EHHADH主要參與花生四烯酸代謝途徑及PPAR信號途徑等。為了進一步探究EHHADH與PPAR家族的關(guān)系，我們做了以下分析：

基于UALCAN數(shù)據(jù)庫分析HCC組織中上述基因mRNA 表達水平，HCC421 數(shù)據(jù)集顯示PPARG、PPARD、PPARGC1B基因轉(zhuǎn)錄組水平在TP53突變組患者HCC 組織較TP53 未突變患者HCC 組織中顯著上調(diào)，PPARGC1A 基因轉(zhuǎn)錄組水平在TP53 突變組患者HCC 組織較TP53 未突變患者HCC 組織中顯著下調(diào)（P<0.05，圖3C～F）?；谙嚓P(guān)性分析得出EHHADH與PPARA、PPARGC1A、PPARGC1B 在轉(zhuǎn)錄水平顯著相關(guān)R 值分別 為0.64、0.22、0.11，且PPARGC1A 與EHHADH的相關(guān)性比PPARGC1B與EHHADH相關(guān)性更高（R=0.22>0.11，圖3G）。

2.3 EHHADH表達與HCC細胞去分化程度顯著相關(guān)

基于HCC421數(shù)據(jù)集中EHHADH RNAseq數(shù)據(jù)和臨床信息進行整合發(fā)現(xiàn)，EHHADH的轉(zhuǎn)錄組水平差異與患者年齡及肝細胞去分化程度高度相關(guān)（P<0.01，表2）。

表2 HCC421數(shù)據(jù)集中患者的臨床信息Tab.2 Clinical information of patients in HCC421 datasets

UALCAN 數(shù)據(jù)庫中TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)也顯示EHHADH基因轉(zhuǎn)錄組水平的中位數(shù)在HCC細胞去分化程度Grade1、Grade2、Grade3、Grade4 中分別 是80.891、57.812、33.488、31.279 TPM?；贖CC421數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)，與Grade1（分化程度高）HCC 患者相比，EHHADH 在Grade2（中度分化)、Grade3（分化不良）、Grade4（未分化）HCC 患者中轉(zhuǎn)錄組水平下降明顯（P<0.05，圖4A）。與Grade2 HCC患者相比，EHHADH在Grade3 HCC 患者中轉(zhuǎn)錄組水平下降明顯（P<0.05）。EHHADH與促進肝細胞去分化相關(guān)基因脂肪酸氧化酶3-羥基輔酶A脫氫酶(HADHA)、乙酰輔酶A氧化酶（ACOX2）表達呈顯著正相關(guān)關(guān)系，R值分別為0.47、0.34（P<0.05，圖4B、C）。經(jīng)免疫組化實驗驗證HCC癌組織EHHADH量隨癌組織分化程度降低而降低（圖5A～X）。

圖4 EHHADH在不同分化程度的HCC組織中的表達Fig. 4 Expression of EHHADH in HCC tissues with different degrees of differentiation. A:EHHADH expression in HCC tissues with different degrees of differentiation from HCC421 dataset.B,C:Spearman correlation analysis of the expressions of the two genes.

圖5 不同分化程度的HCC組織切片免疫組化圖及H&E圖Fig. 5 Immunohistochemical and HE staining of HCC tissues with different degrees of differentiation. A-F/M-R:Representative image of immunohistochemistry showing EHHADH expression in HCC tissues with different degrees of differentiation. G-L/S-X: HE staining showing EHHADH expression in HCC tissues with different degrees of differentiation.

2.4 EHHADH低表達與鐵死亡相關(guān)

利用HCC421數(shù)據(jù)集，進行全基因組與EHHADH之間的關(guān)聯(lián)性分析，根據(jù)各個基因轉(zhuǎn)錄組水平，采用Spearman相關(guān)性分析評估兩兩基因間的相關(guān)性，選取相關(guān)性最高的前300個基因，剔除10個假基因后對這290 個基因及EHHADH，即共291 個基因進行GO 及KEGG富集分析（圖6A～F）。GO 分析結(jié)果顯示此291個基因分子功能及生物過程富集于氧化還原酶活性、有機羥基化合物代謝過程、脂質(zhì)分解代謝過程，線粒體基質(zhì)烯烴化合物代謝過程、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、硫化合物代謝過程、細胞氨基酸生物合成過程等。KEGG信號途徑富集于PPAR信號通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等。其中大部分信號途徑及富集的生物功能與鐵死亡相關(guān)，例如氧化還原酶活性、脂質(zhì)分解代謝過程、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、硫化合物代謝過程、細胞氨基酸生物合成過程、丙酮酸代謝、PPAR信號通路、氨基酸代謝過程（圖6G）。

圖6 基因EHHADH與全部基因組間的相關(guān)性分析及EHHADH在HCC中功能和通路的富集分析Fig. 6 Correlation analysis of EHHADH with the whole genome and function and pathway enrichment analyses of EHHADH in HCC. A-C:The top 3 genes with the highest positive correlation with EHHADH in the whole genome were correlated with EHHADH, D-F: The top 3 genes with the highest negative correlation with EHHADH in the whole genome were correlated with EHHADH; G: Bar graph of enriched terms across the first 290 genes associated with EHHADH,colored by p-values, H-J: The expression distribution of ferroptosis-related mRNA in EHHADH high expression HCC tissues and EHHADH low expression HCC tissues.(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001), K: A heatmap of the correlation between multiple genes and EHHADH.(**P<0.01,*P<0.05), L-M: Representative image of immunohistochemistry showing EHHADH expression in HCC tissue, N-O: Representative image of immunohistochemistry showing FTH1 expression in HCC tissue, P-Q: Representative image of immunohistochemistry showing NCOA4 expression in HCC tissue.

基于HCC421數(shù)據(jù)集，將HCC患者以EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平中位數(shù)為分界線，分為高、低表達組，通過wilcox檢驗分析兩組間Ferroptosis分子的表達分布。結(jié)果顯示多個鐵死亡的相關(guān)基因（HSPA5、EMC2、SLC7A11、NFE2L2、HSPB1、FANCD2、CISD1、FDFT1、SLC1A5、RPL8、NCOA4、LPCAT3、GLS2、DPP4、CS、CARS1、ATP5MC3、ACSL4、ATL1）轉(zhuǎn)錄組水平在兩組間存在顯著差異（圖6H～J）。其中EHHADH 轉(zhuǎn)錄組水平與負調(diào)控鐵死亡進程基因HSPA5、SLC1A5轉(zhuǎn)錄組水平呈負相關(guān)關(guān)系，與正調(diào)控鐵死亡進程基因NCOA4、GLS2、DPP4轉(zhuǎn)錄組水平呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05，R>0.2，圖6K）。

免疫組化結(jié)果顯示在HCC組織中EHHADH蛋白質(zhì)表達量與負調(diào)控鐵死亡的標記基因FTH1蛋白表達量呈負相關(guān)性，與正調(diào)控鐵死亡的標記基因NCOA4蛋白表達量呈正相關(guān)性（圖6L～Q）。

2.5 EHHADH低表達與高干性評分相關(guān)

使用邏輯回歸機器學(xué)習(xí)算法（OCLR），基于HCC421數(shù)據(jù)集中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以HCC患者EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平中位數(shù)為分界線將樣本分為EHHADH高表達組和低表達組，計算干性指數(shù)來評估腫瘤細胞的干性程度。結(jié)果顯示低表達組的干性評分顯著高于高表達組，即低表達組腫瘤細胞的干性明顯強于高表達組（P=0.0063），低表達組腫瘤細胞增殖能力更強（圖7A）。

圖7 EHHADH表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系Fig. 7 Association between EHHADH expression and prognosis of HCC patients.A:The distribution of OCLR scores in EHHADH high/low expression groups.B:Forest plot:The p-value,risk coefficient(HR)and confidence interval of EHHADH in multiple tumours are analyzed by univariate cox regression;CE:Kaplan-Meier survival curve for HCC patients in the high-and low-expression EHHADH groups.

2.6 EHHADH低表達與HCC患者生存預(yù)后差相關(guān)

基于TCGA數(shù)據(jù)庫，利用Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存率與EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平的相關(guān)性，多種腫瘤中EHHADH基因單因素Cox分析結(jié)果以森林圖的形式呈現(xiàn)，結(jié)果顯示在KIRC、LGG、LIHC數(shù)據(jù)集中的預(yù)后差異顯著（P<0.05，圖7B）。

利用Hiplot平臺，基于HCC421數(shù)據(jù)集、HCC488數(shù)據(jù)集、HCC442數(shù)據(jù)集進行Kaplan-Meier生存曲線分析HCC 患者生存率與EHHADH 轉(zhuǎn)錄組水平的相關(guān)性。選取每一數(shù)據(jù)集的EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平最優(yōu)分箱點為基線將患者分為高表達組(RHES)和低表達組（RLES），結(jié)果顯示預(yù)后差異顯著，其中HCC421數(shù)據(jù)集、HCC488數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示有顯著的生存差異（P<0.05），EHHADH高表達患者的生存時間顯著長于低表達EHHADH患者（圖7C、D）；HCC442數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示沒有顯著的生存差異（P>0.05，圖7E）。

3 討論

本研究通過對HCC488數(shù)據(jù)集中HCC組織與癌旁組織進行GSEA分析獲得與HCC發(fā)展中脂肪酸氧化相關(guān)的Hub基因EHHADH。此基因主要參與過氧化體β氧化途徑，起催化長鏈二羧酸降解作用，在肝細胞過氧化物酶脂肪氧化通路中起到重要作用［7］，且已有研究表明脂肪酸合成、β氧化和細胞脂質(zhì)組成的改變會促進HCC 的發(fā)生和發(fā)展［22］，所以本研究聚焦于探究基因EHHADH在HCC發(fā)生發(fā)展中的表達和作用。本研究發(fā)現(xiàn)HCC組織相對于癌旁組織，其EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平顯著下調(diào)，EHHADH低表達組預(yù)后顯著差于高表達組。且EHHADH低表達組腫瘤細胞的干性明顯強于高表達組，表示低表達組腫瘤細胞增殖能力更強。綜上，EHHADH可作為HCC患者的獨立預(yù)后因素。

為研究EHHADH低表達促進HCC發(fā)展的機制，本研究通過分析HCC患者的體細胞突變景觀發(fā)現(xiàn)TP53的突變與EHHADH 的表達相關(guān)，KEGG 中顯示EHHADH主要參與PPAR信號途徑。PPAR信號途徑具有調(diào)節(jié)細胞周期和新陳代謝的作用，并已報道其參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展［23,24］。肝臟作為調(diào)控代謝的器官，PPAR信號途徑在HCC中的發(fā)生發(fā)展中起尤為重要的作用［25-27］。在PPAR信號途徑中EHHADH以PPAR家族成員依賴的方式發(fā)揮其脂肪酸β氧化的功能［9］，其上游基因主要為PPAR 家族基因，包括PPARA、PPARB、PPARG、PPARGC1A、PPARGC1B［24］。本文進一步通過研究HCC腫瘤細胞中EHHADH表達量與PPAR家族基因表達量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)PPARGC1A轉(zhuǎn)錄組水平與TP53突變及EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平相關(guān)。

由于PPARGC1A定位于4號染色體上，最新研究表明在卵巢癌中TP53突變導(dǎo)致4號染色體上發(fā)生顯著的片段缺失現(xiàn)象［28］。抑癌基因TP53突變是HCC最常見的基因突變，攜帶突變型TP53的HCC患者比攜帶野生型TP53的患者總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期更短［29,30］。多項研究表明，TP53的缺失或錯義突變導(dǎo)致線粒體功能障礙［31-34］，且TP53錯義突變直接導(dǎo)致PPARGC1A編碼的蛋白質(zhì)PGC-1α水平下降［35-37］。線粒體功能是轉(zhuǎn)化和抑制腫瘤生長所必需的［34,38］，PGC-1α的主要生理功能是通過促進線粒體氧化磷酸化來控制能量代謝。由于目前還沒有針對PGC-1α本身作用的藥物［39］，因此，識別PGC-1α的下游分子從而抑制腫瘤生長至關(guān)重要。以往的研究表明，EHHADH的下調(diào)與線粒體脂肪酸氧化途徑的抑制有關(guān)［40］，同時EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平與PPARGC1A轉(zhuǎn)錄組水平相關(guān)［41］，且低表達EHHADH組的HCC患者較高表達EHHADH的HCC患者TP53錯義突變率更高。綜上，我們猜測在HCC組織中TP53發(fā)生缺失或錯義突變導(dǎo)致PPARGC1A轉(zhuǎn)錄組水平下降，引發(fā)線粒體功能障礙，最后導(dǎo)致EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平下降。

在眾多致病因素中，HCC腫瘤分化程度與腫瘤生長速度、轉(zhuǎn)移、血管侵襲以及患者預(yù)后密切相關(guān)［3,42-44］。在分化良好的HCC中，腫瘤生長緩慢、轉(zhuǎn)移率低，腫瘤完全切除后復(fù)發(fā)率低，而腫瘤細胞去分化則促進其增殖、侵襲，誘導(dǎo)腫瘤在肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移［45,48］。目前抗癌藥物的研究工作主要集中在開發(fā)識別刺激腫瘤細胞死亡的藥物上。然而抗癌的方式不僅于此，還可以嘗試指引癌細胞重新啟動分化程序，從而抑制其自我更新復(fù)制的進程。這種方法目前被成功地用于治療攜帶PML/RARA融合基因的急性早幼粒細胞白血病，其中全反式維甲酸和三氧化二砷誘導(dǎo)白血病細胞向成熟粒細胞的終末分化并阻止其自我更新［47］。成人上皮性腫瘤是否保持潛在的分化能力，以及細胞調(diào)節(jié)中的不同結(jié)節(jié)是否可以被識別為恢復(fù)這種分化潛力的靶點，還需要進一步的研究［48］。HCC去分化過程中的代謝變化，尤其是脂肪酸氧化抑制，是HCC 去分化過程中的重要特征。在HCC中，脂肪酸氧化功能障礙導(dǎo)致在去分化過程中過氧化體的數(shù)量減少，脂肪堆積到腫瘤間質(zhì)［49,50］，腫瘤細胞為避免由脂肪酸氧化所產(chǎn)生大量的活性氧物種堆積，其脂肪酸氧化功能受抑制。因此本研究提出猜想，恢復(fù)脂肪酸氧化代謝穩(wěn)態(tài)可能可以通過恢復(fù)肝細胞良好的分化狀態(tài)從而改善HCC患者的預(yù)后。結(jié)合HCC421數(shù)據(jù)集中臨床數(shù)據(jù)信息及免疫組織化學(xué)結(jié)果推測EHHADH低表達可能導(dǎo)致HCC細胞去分化程度加重相關(guān)。

近年來，索拉菲尼作為目前指南推薦晚期HCC患者全身系統(tǒng)治療的一線藥物，一項納入了3 256例患者信息的meta分析顯示患者中位生存期為12.6（11.15～13.8）個月［51］。已有研究闡明其涉及癌癥相關(guān)蛋白激酶靶點的作用機制，這些發(fā)現(xiàn)突顯了優(yōu)化索拉非尼與其他治療策略聯(lián)合使用的重要性。既往研究表明索拉菲尼是一種鐵死亡誘導(dǎo)劑［52］，氧化應(yīng)激與索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細胞線粒體功能障礙密切相關(guān)，半胱氨酸的耗竭可能

通過誘導(dǎo)鐵死亡，從而與索拉非尼發(fā)揮協(xié)同作用［53,54］。因此，促進肝癌細胞鐵死亡可能可以改善肝癌對索拉非尼的耐藥性。鐵死亡是一種獨特的細胞死亡程序，由依賴鐵的磷脂過氧化驅(qū)動，主要特征包括鐵堆積、脂質(zhì)過氧化和GSH耗竭［55］。有報道認為脂質(zhì)過氧化是鐵死亡最后一步的關(guān)鍵因素，脂肪酸代謝和鐵死亡之間相互作用的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和放射治療抵抗有關(guān)。靶向脂肪酸代謝途徑可能可以通過觸發(fā)鐵死亡來抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［56］。本研究通過GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)EHHADH參與的大部分信號途徑及富集的生物功能與鐵死亡相關(guān)，例如氧化還原酶活性、脂質(zhì)分解代謝過程、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、硫化合物代謝過程、細胞氨基酸生物合成過程、丙酮酸代謝、PPAR信號通路、氨基酸代謝過程［57-62］。結(jié)合鐵死亡相關(guān)基因的差異分析及免疫組織化學(xué)結(jié)果，我們推測EHHADH可能參與細胞鐵死亡調(diào)控，并與腫瘤細胞鐵死亡逃逸相關(guān)。

綜上所述，我們猜測由于HCC中發(fā)生TP53突變造成EHHADH轉(zhuǎn)錄組水平下調(diào)，進而促進了HCC細胞去分化，并且抑制HCC細胞鐵死亡。過表達EHHADH是否可以阻止并逆轉(zhuǎn)HCC細胞去分化進程，以及是否可以促進HCC細胞鐵死亡，仍需進一步研究。