楊 蕙，王 華，李成龍，何 雄，雷詩卉，李 薇，孟 盼，王瑾茜，劉 檢，王宇紅

湖南中醫(yī)藥大學1第一附屬醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410007；2科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；3中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二一醫(yī)院急診科，湖南 長沙 410153；4湖南省藥品審評與不良反監(jiān)測中心，湖南長沙410013

隨著人們飲食結(jié)構和飲食習慣的改變，糖尿病的患病率越來越高。據(jù)報道，2019年糖尿病的患病人數(shù)已達4.63億，預計到2045年將升至7億［1］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病伴隨的高血糖是誘發(fā)抑郁癥的重要因素之一，而抑郁癥會降低糖尿病患者的自我管理和血糖控制效果，從而導致糖尿病并發(fā)抑郁癥患者的預后較差［2］。

海馬是抑郁癥發(fā)生的核心腦區(qū)，海馬齒狀回的神經(jīng)干細胞可在成年期持續(xù)自我更新和分化，生成新的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，并整合進神經(jīng)環(huán)路，影響情緒和認知。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖或是中樞胰島素抵抗可通過影響神經(jīng)干細胞對能量底物的利用，致神經(jīng)發(fā)生亂序，并通過削弱細胞的自我更新能力不斷縮小干細胞池，減少新生神經(jīng)元的數(shù)量［3］。目前，增強海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的自我更新和分化能力、增加神經(jīng)發(fā)生已成為改善糖尿病認知障礙的重要治療目標［4］，但糖尿病并發(fā)抑郁癥是否存在神經(jīng)干細胞功能異常研究較少。

左歸降糖解郁方是基于糖尿病并發(fā)抑郁癥“虛、瘀、郁”病機，以滋陰益氣、化瘀解郁為治法，從經(jīng)典名方左歸丸加減化裁而得［5］。前期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元的樹突棘形態(tài)和可塑性功能均具有較好的調(diào)節(jié)作用［6］，但對神經(jīng)干細胞的影響研究較少。因此，本項目擬以神經(jīng)干細胞的增殖屬性為研究重點，探明左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)干細胞自我更新能力的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠96只，6～7周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SYXK（湘）2020-0010。實驗前，所有動物在SPF動物房中適應性飼養(yǎng)5 d，并保證正常飲食飲水，房內(nèi)溫度為20～24 ℃，濕度為40%～60%。本次實驗符合湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理審查（ZYFY20220322-07），實驗過程中完全遵循“3R”原則。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（黃芪、貫葉連翹、姜黃、熟地黃、山茱萸、枸杞、菟絲子、杜仲、丹參、丹皮、牛膝）中的所有藥材均購自于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，并于醫(yī)學創(chuàng)新實驗中心煎制，獲得左歸降糖解郁方水煎液（1.14 g生藥/mL）。

1.3 主要試劑與儀器

高脂飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，組成為3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油，81.3%基礎飼料。瘦素ELISA試劑盒（基因美生物）；Brdu（博士德生物）；Nestin（艾方生物）。Cyclin D1、SOX2、Shh、Ptch1、Gli-3、Gli-1、GAPDH、LaminB1（#13435）（Cell Signaling）。Smo、Brdu（Proteintech）。

血糖儀和血糖試紙（三諾生物），強迫游泳杯和Morris 水迷宮（東樂自然基因生命科學），酶標儀（Perkinelmer），病理切片機（徠卡），正置熒光顯微鏡（尼康），蛋白印跡系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.4 方法

1.4.1 模型構建［7］SD 大鼠采用正常飼料適應性飼養(yǎng)5 d后，給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，隨后尾靜脈注射STZ（劑量為38 mg/kg），并繼續(xù)采用高脂飼料飼養(yǎng)。3 d后，采大鼠尾尖血檢測血糖含量，血糖檢測前動物需禁食7 h。選擇血糖值≥16.0 mmol/L的動物為糖尿病模型大鼠。最后，給予糖尿病模型大鼠28 d慢性溫和不可預知應激，建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型。應激方式包括：傾籠45°24 h、噪音8 h、晝夜顛倒24 h、夾尾2 min、50 V電擊3 min、潮濕墊料12 h。應激期間的動物為單籠飼養(yǎng)，每天施加刺激方式一種，相鄰2d的刺激方式不相同。

1.4.2 分組與給藥 將糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠按照血糖隨機分為5組，模型組、陽性藥組、左歸降糖解郁方高、中、低劑量組，每組16只。另設16只健康SD大鼠為對照組。其中，左歸降糖解郁方高、中、低劑量組給藥劑量分別為20.52、10.26、5.13 g/kg。陽性藥組灌胃給藥二甲雙胍和氟西汀的混懸液，劑量分別為0.18 g/kg、1.8 mg/kg。上述4組的灌胃體積均為10 mL/kg，給藥28 d。對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。給藥結(jié)束后，大鼠禁食7 h，用血糖試紙測其空腹血糖值，隨后進行行為學檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 強迫游泳實驗 給藥結(jié)束后，各組大鼠先進行強迫游泳實驗。將大鼠放置于游泳杯中，先適應性游泳1 min，隨后記錄動物3 min內(nèi)在水中的不動時間。游泳杯的水位要保持一致，且保證所有大鼠的尾巴和后足不能碰到杯底。實驗過程中，游泳杯之間用黑板隔開，避免相互影響。

1.5.2 Morris水迷宮實驗 強迫游泳結(jié)束后，各組大鼠進行水迷宮實驗。水迷宮所用的圓形水缸被分為4個象限，且平臺固定放置在其中一個象限的水面下。實驗的前4 d，大鼠每天從不同的象限放入水缸中，訓練其找到水中隱藏的平臺。第5天，將動物從平臺所在象限的對角象限放入水中，記錄其找到并爬上平臺的時間，記為登臺時間。第6天，移去平臺，記錄大鼠在目標象限（即原平臺所在象限）的游泳時間（尋臺時間），以及穿過原平臺位置的次數(shù)（穿臺次數(shù)）。實驗期間，室內(nèi)物品擺放位置不能改變，燈光和水位等保持統(tǒng)一。

1.5.3 ELISA檢測 行為學實驗結(jié)束后，動物麻醉并采用腹主動脈取血，隨后處死，并在冷凍臺上取海馬。血液離心取上清后，按照瘦素的ELISA試劑盒操作步驟進行檢測。

1.5.4 神經(jīng)干細胞增殖檢測 采用Brdu標記神經(jīng)干細胞的增殖情況，實驗時將Brdu粉末溶于生理鹽水并制成濃度為50 mg/kg的Brdu溶液，取材前，每組取8只大鼠進行Brdu溶液腹腔注射，每只注射3次，每次間隔4 h，注射在1 d內(nèi)完成，次日取材。

1.5.5 免疫熒光檢測 將大鼠腦組織制成蠟塊并切片，自發(fā)熒光淬滅和BSA封閉后，滴加Nestin和Brdu一抗，于濕盒內(nèi)4 ℃過夜。第2天，采用PBS脫色洗滌玻片3次，每次5 min。隨后，在組織上滴加與一抗相對應種屬的二抗，并避光常溫孵育50 min。最后，采用DAPI復染細胞核。封片后在熒光顯微鏡下采集圖像。其中，DAPI染色為藍光，紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm；FITC染色為綠光，激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm；CY3染色為紅光，激發(fā)波長510～560，發(fā)射波長590 nm。

1.5.6 Western blot檢測 分別采用RIPA蛋白裂解液及NE-PER核蛋白-胞漿蛋白提取試劑盒提取大鼠海馬組織的總蛋白和核蛋白。檢測不同蛋白原液的含量并稀釋至蛋白濃度相等過后進行凝膠電泳分離蛋白。待蛋白分離結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)裝置將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，并與脫脂奶粉中封閉1 h。將封閉后的膜放置于孵育盒中，并添加相應的一抗，4 ℃孵育過夜。次日，采用TBST洗膜3次，10 min/次。將洗除多余一抗的蛋白膜再次放置于孵育盒中，并添加相應的二抗，室溫孵育1 h。最后采用ECL化學發(fā)光法進行顯色，所得蛋白條帶采用Image J軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS16.0，所有計量資料以均數(shù)±標準差表示。各指標組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 左歸降糖解郁方對大鼠血糖和瘦素的影響

與正常組比較，模型組大鼠血糖和瘦素含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，左歸降糖解郁方高和中劑量組大鼠血糖和瘦素含量顯著降低（P<0.01或P<0.05，表1）。

表1 各組大鼠的血糖和瘦素含量Tab.1 Blood glucose and leptin content of rats in each group(Mean±SD)

2.2 左歸降糖解郁方對大鼠抑郁樣行為和認知功能的影響

本實驗采用了強迫游泳實驗和Morris 水迷宮實驗評價各組大鼠的抑郁樣行為和認知功能。首先，在強迫游泳實驗中，與正常組比較，模型組大鼠的不動時間顯著延長（P<0.01）。與模型組比較，左歸降糖解郁方高和中劑量組大鼠的不動時間均顯著縮短（P<0.01 或P<0.05）。其次，在Morris水迷宮實驗中，與正常組比較，模型組大鼠在平臺未撤走前找到并爬上平臺的所需時間明顯延長（P<0.01）；而在平臺撤走后，其在平臺所在象限的尋找時間明顯縮短，穿過原平臺位置的次數(shù)明顯減少（P<0.01）。與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中劑量可顯著縮短大鼠的登臺時間，延長尋臺時間并增加穿臺次數(shù)（P<0.01或P<0.05，表2）。

表2 各組大鼠在強迫游泳和水迷宮實驗的結(jié)果Tab.2 Results of the forced swimming test and the water maze test of rats in each group

2.3 左歸降糖解郁方對神經(jīng)干細胞增殖的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬齒狀回Nestin和Brdu表達顯著降低（P<0.05，圖1）。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠海馬齒狀回Nestin和Brdu表達均顯著升高（P<0.01），左歸降糖解郁方中劑量組大鼠海馬齒狀回Brdu表達顯著升高（P<0.05，圖1）。

圖1 左歸降糖解郁方促進模型大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖Fig. 1 Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction promotes the proliferation of neural stem cells in dentate gyrus of hippocampus in model rats.A:The expression of Nestin and Brdu in the dentate gyrus of the hippocampus(Original magnification:×200).B,C: The expression of Nestin(B)and Brdu(C)were increased after Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction administration.**P<0.01 vs the contro group,##P<0.01,#P<0.05 vs the model group.

2.4 左歸降糖解郁方對神經(jīng)干細胞自我更新階段標志物的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬Cyclin D1和SOX2表達顯著降低（P<0.01，圖2）。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量可顯著升高Cyclin D1蛋白表達，而高劑量和中級量均可顯著升高SOX2蛋白表達（P<0.01，圖2）。

圖2 左歸降糖解郁方增強模型大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞自我更新標志物表達Fig. 2 Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction enhances the expression of self-renewal markers of neural stem cells in the dentate gyrus of the hippocampus in rats.A:The expression of Cyclin D1 and SOX2. B, C: The expression of cyclin D1 (B) and SOX2 (C) were increased after Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction administration.**P<0.01 vs the contro group,##P<0.01,#P<0.05 vs the model group.

2.5 左歸降糖解郁方對Shh信號相關蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬Shh，Ptch1，Smo蛋白表達顯著降低，而Gli-3表達顯著升高（P<0.01，圖3）。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量可顯著升高模型大鼠海馬Shh，Ptch1，Smo蛋白表達，降低Gli-3蛋白表達（P<0.01或P<0.05，圖3）；而左歸降糖解郁方中劑量可顯著升高Shh，Ptch1，Smo蛋白表達（P<0.01，圖3），但對Gli-3蛋白表達沒有顯著性影響。

圖3 左歸降糖解郁方增加模型大鼠海馬Shh信號Fig. 3 Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction activates the expression of Shh signaling pathway in the hippocampus in rats.A: The expression of Shh,Ptch1,Smo and Gli-3. B-D: The expression of Shh (B),Ptch1 (C) and Smo (D) were increased after Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction administration,while the expression of Gli-3(E)was decreased.**P<0.01 vs the contro group,##P<0.01,#P<0.05 vs the model group.

此外，與正常組比較，模型組大鼠海馬細細胞核Gli-1蛋白表達顯著降低（P<0.01，圖4）。與模型組比較，左歸降糖解郁方可顯著升高Gli-1的核表達（P<0.01，圖4）。

圖4 左歸降糖解郁方增加模型大鼠細胞核中Gli-1表達Fig. 4 Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction increases the expression of Gli-1 in cell nucleus.A: The expression of Gli-1. B:The expression of Gli-1 in cell nucleus was increased after Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction administration,while the expression of Gli-3(E)was decreased.**P<0.01 vs the contro group,##P<0.01,#P<0.05 vs the model group.

3 討論

左歸降糖解郁方是一個具有自主知識產(chǎn)權的治療糖尿病并發(fā)抑郁癥的復方中藥［8］，其君藥為熟地，臣藥為山茱萸和枸杞［5］。課題組圍繞其治療效果、作用機制、物質(zhì)基礎等方面展開研究已有十余年。在本次實驗中，課題組采用高脂飲食、STZ、慢性溫和不可預知應激三聯(lián)法建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型，其毛發(fā)枯黃、身形消瘦，弓背少動、反抗力降低，表現(xiàn)出“虛、瘀、郁”的病機特點［5］。左歸降糖解郁方不僅可以顯著降低該糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠的外周血糖和瘦素水平，還可通過縮短大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間、減少大鼠在Morris水迷宮實驗中的登臺時間、延長尋臺時間、增加穿臺次數(shù)，改善動物的抑郁樣行為和認知功能，表現(xiàn)出對糖尿病并發(fā)抑郁癥較好的治療作用，上述結(jié)果與以往研究保持一致［9,10］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可改善海馬神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮抗抑郁作用［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其對海馬齒狀回的神經(jīng)干細胞也具有較好的干預作用［12］。神經(jīng)干細胞作為干細胞的一個重要分支，因具有持續(xù)自我更新和多向分化潛能，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的替代治療中展現(xiàn)出巨大的研究價值和應用前景，近年來已逐漸成為神經(jīng)科學領域的研究熱點。大量研究證實，糖尿病或是糖尿病合并認知障礙動物均可見海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生異常，包括神經(jīng)干細胞的自我更新和分化功能損傷［13-14］。其中，自我更新功能，即細胞增殖是干細胞維持細胞數(shù)量的核心功能，也是保證足夠數(shù)量的干細胞持續(xù)向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分化的重要前提。故本實驗通過標記Brdu評估了左歸降糖解郁方對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響。Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到活細胞新和成的DNA中，是最

經(jīng)典的增殖標記物。實驗將Brdu與神經(jīng)干細胞的特異性標志物Nestin進行雙重免疫熒光標記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬中與Nestin共表達的Brdu顯著減少，左歸降糖解郁方可顯著增加模型大鼠海馬神經(jīng)干細胞中Brdu 的表達量，即可增加神經(jīng)干細胞的增殖，增強其自我復制功能。目前，“抑郁癥的神經(jīng)發(fā)生假說”強調(diào)了增強海馬神經(jīng)發(fā)生對于抗抑郁效果的重要性［15］。研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁經(jīng)典藥物氟西汀提高糖尿病小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖能力，可有效減少糖尿病引起的抑郁癥［16］。故左歸降糖解郁方調(diào)控糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖功能可能是其改善動物抑郁樣行為的重要機制。

研究證實Shh信號在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元存活和胚胎發(fā)生中發(fā)揮了關鍵作用，且與抑郁癥、癡呆癥、糖尿病神經(jīng)病變等多種疾病均有關，可通過調(diào)控下游靶基因的表達，影響神經(jīng)干細胞的增殖［17］。Ptch1和Smo是Shh信號通路中的重要蛋白，當缺少Shh配體時，Ptch1抑制Smo向初級纖毛的轉(zhuǎn)運，并進一步導致全長膠質(zhì)瘤相關致癌基因（GliFL）水解為Gli抑制因子（GliR）。隨后，GliR進入細胞核，并與Shh靶基因相互作用，抑制該通路下游基因轉(zhuǎn)錄。當Shh與Ptch1結(jié)合時，Shh信號通路被激活，Ptch1對Smo的抑制作用被解除，后者可驅(qū)動Gli蛋白進入細胞核，啟動Shh信號的轉(zhuǎn)錄。在Gli蛋白家族中，Gli-1主要是Shh信號轉(zhuǎn)錄的激活物而Gli-3則是抑制因子。Gli-3可通過抑制Gli-1進入細胞核，從而阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗中，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬Shh，Ptch1，Smo表達降低，而Gli-3表達升高，且Gli-1的細胞核表達降低。給予左歸降糖解郁方后，模型大鼠海馬Shh，Ptch1，Smo表達顯著升高，而Gli-3表達降低，且Gli-1的細胞核表達顯著升高。結(jié)果提示，左歸降糖解郁方可激活糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬的Shh信號通路，并增加Gli-1的入核，增強下游靶基因表達。

為了進一步證明左歸降糖解郁方調(diào)控Shh信號對神經(jīng)干細胞增殖功能的影響，實驗研究了Shh信號下游靶基因中與增殖密切相關的CyclinD1 和SOX2［18,19］。CyclinD1 是細胞周期蛋白家族中調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)換的關鍵蛋白［20］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞中的CyclinD1 可縮短細胞的G1期，并促進G1期向S期過渡，從而起到延緩神經(jīng)發(fā)生，抑制干細胞分化的作用［21］。實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬中CyclinD1 的表達顯著減少，左歸降糖解郁方干預后CyclinD1的表達顯著增加，提示該方可通過增加CyclinD1的表達，保持模型大鼠海馬神經(jīng)干細胞的自我更新。SOX2是神經(jīng)干細胞自我更新階段的重要標志物，也發(fā)揮了重要的細胞周期調(diào)節(jié)作用和細胞干性維持作用［22］。SOX2的突變會導致大腦，特別是海馬的發(fā)育缺陷，并引起學習記憶等認知功能障礙［23］。敲除小鼠胚胎腦內(nèi)的SOX2可導致新生小鼠輕微腦缺陷，并在不久之后，出現(xiàn)海馬神經(jīng)發(fā)生完全消失，齒狀回發(fā)育不全［24］。同樣，在成年小鼠中，SOX2的缺失也會導致海馬神經(jīng)發(fā)生丟失。在本實驗中，左歸降糖解郁方可顯著增加糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬中降低的SOX2蛋白表達。

由此可見，左歸降糖解郁方不僅可促進糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖，還可激活神經(jīng)干細胞中的Shh信號并增強Gli-1入核，啟動下游靶基因CyclinD1和SOX2的表達。已有研究表明，Shh信號參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)干細胞功能，控制神經(jīng)發(fā)生過程中干細胞的可塑性［25］。以腺病毒為載體介導的Shh過表達可促進海馬神經(jīng)干細胞的增殖，而Shh抑制劑環(huán)巴胺則對上述增殖有明顯的抑制作用［26］，故推測左歸降糖解郁方促進海馬神經(jīng)干細胞增殖的作用與其激活Shh信號密切相關，而上述機制可能是其改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為的重要途徑。