宋瑜 齊赟 張明 康前雁 黎黎

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科,西安 710061

干眼是影響視覺和生活質(zhì)量的常見眼表疾病,DEWS Ⅱ報(bào)道指出干眼的患病率為5%～50%[1]。2020年中國干眼專家共識提出,干眼為多因素引起的慢性眼表疾病,并明確提出眼表微環(huán)境失衡是造成干眼的原因之一[2]。研究眼表微環(huán)境的改變對于探索干眼的發(fā)病機(jī)制以及治療具有重要意義[3-5]。2011年,Dong等[6]首次使用16S rRNA高通量測序技術(shù)確定健康人群眼表微生物菌群,發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、丙酸菌屬、棒狀桿菌、葡萄球菌、水桿菌、鏈球菌等在人結(jié)膜囊普遍存在,并且核心菌群由共生菌、環(huán)境致病菌和機(jī)會(huì)致病菌共同組成。通過高通量測序技術(shù)(宏基因組或16S rRNA)對正常人群和眼表疾病患者眼表微生物菌群進(jìn)行對比研究發(fā)現(xiàn),眼表微生物菌群對于維持眼表及視功能的健康起著重要作用,并參與部分眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展,如真菌性角膜炎、結(jié)膜炎、瞼緣炎、眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜炎[7-13]。眼表微生物菌群是眼表微環(huán)境的重要組成部分,可能在干眼的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,但是目前該領(lǐng)域研究很少。本研究擬探討干眼與非干眼患者結(jié)膜拭子微生物菌群差異,為深入了解眼表菌群在干眼發(fā)病和治療中的作用及機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 納入2020年6—11月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的干眼患者42例42眼作為干眼組,其中男16例16眼,女26例26眼,平均年齡(47.5±15.3)歲,屈光不正患者占7.1%;同期納入在眼科門診查體的非干眼患者37例37眼作為非干眼組,其中男14例14眼,女23例23眼,平均年齡(41.4±15.5)歲,屈光不正患者占8.1%。雙眼均符合納入標(biāo)準(zhǔn)時(shí),右眼入組。干眼組與非干眼組患者年齡、性別構(gòu)成以及屈光不正患者比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.615,P=0.111;χ2=3.457,P=0.063;χ2=0.026,P=0.872)。干眼的診斷依據(jù)2020年中國干眼專家共識[14]。所有患者均由同一位有經(jīng)驗(yàn)的眼表專家進(jìn)行檢查和評估。干眼組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲;(2)具有眼部燒灼感、異物感、畏光、眼干、眼癢等不適癥狀,眼表疾病指數(shù)評分(Ocular Surface Disease Index,OSDI)≥13分;(3)淚液分泌試驗(yàn)Schirmer試驗(yàn)Ⅰ(無麻醉)≤5 mm,或熒光素染色淚膜破裂時(shí)間(fluorscein tear film breakup time,FBUT)≤5 s,或非侵入淚膜破裂時(shí)間(non-invasive tear film breakup time,NIBUT)<10 s;若5 mm/5 min10 mm/5 min或FBUT>10 s或NIBUT≥13 s。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)近4周內(nèi)眼局部應(yīng)用抗生素者;(2)有配戴角膜接觸鏡史者;(2)近4周內(nèi)有眼表及眼周炎癥病史者;(3)近3個(gè)月內(nèi)有眼科手術(shù)史者;(4)妊娠或有自身免疫性疾病者。本研究方案經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號:XJTU1AFCRC2018SJ-014),所有受檢者均了解本研究目的和方法并自愿簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社);QIA Stool Mini Kit(德國QIAGEN公司);異丙醇、醋酸鈉(美國Sigma-Aldrich公司)。超微量分光光度計(jì)(美國Multiskan SkyHigh公司);PCR儀(美國賽默飛公司)。

1.2 方法

1.2.1樣品采集與保存 嚴(yán)格按照無菌方式取材。采樣前用鹽酸奧布卡因滴眼液點(diǎn)受檢眼進(jìn)行表面麻醉,點(diǎn)眼后3 min囑受檢者向上注視,向下拉開下眼瞼,用無菌干棉簽拭子,輕微按壓擦拭下方的球結(jié)膜表面3次,擦拭時(shí)避免棉簽拭子接觸眼瞼和睫毛。將結(jié)膜拭子置于1.5 ml無菌管中,迅速轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2DNA提取、擴(kuò)增和16S rRNA基因擴(kuò)增測序 按照華大基因公司的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行(參照文獻(xiàn)[15-16]中方法),根據(jù)QIA Stool Mini Kit試劑盒說明書將棉簽拭子前端轉(zhuǎn)移至EP管中,研磨5 min,65 ℃裂解13 min,室溫下離心力14 000×g離心10 min。取上清液至離心管中,加入-20 ℃預(yù)冷的異丙醇和100 g/L醋酸鈉3 ml混勻,于-20 ℃冰箱中過夜;離心力14 000×g離心3次,晾干后溶于適量緩沖液。采用10 g/L瓊脂糖凝膠檢測樣本中DNA提取的質(zhì)量。取30 ng DNA樣品,用341F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3')通用區(qū)引物對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;采用Agencount AMPure XP磁珠進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液,完成建庫。采用Agilent 2100 Bioanalyzer軟件檢測文庫的片段范圍及濃度,采用IIIumina的MiseqPE301+8+8+301平臺對檢測合格的文庫進(jìn)行雙端測序。

1.2.3測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析 設(shè)定Cut off值,過濾采集數(shù)據(jù),清除低質(zhì)量數(shù)據(jù),將過濾后數(shù)據(jù)用于后期分析。采用FLASH軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾及嵌合體去除,采用USE-ARCH(v7.0.1090)軟件進(jìn)行種屬分類,進(jìn)行可操作分類種屬(operational taxonomic species,OTUs)聚類分析,相似性>97%的標(biāo)簽聚集成1個(gè)OTUs。根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果以及物種注釋結(jié)果進(jìn)行各組間物種差異分析和樣品物種復(fù)雜度分析。采用R(v3.2.1)軟件的mixOmics包對樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析,包括observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等,以評估單個(gè)樣本的物種豐富度;基于bray-curtis矩陣分析Beta多樣性,在門水平上評估菌群構(gòu)成的差異性。采用GreenGene數(shù)據(jù)庫對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組眼表微生物菌群OTUs比較

干眼組和非干眼組受檢眼中共獲得18 586個(gè)OTUs,其中干眼組13 310個(gè)OTUs,非干眼組8 950個(gè)OTUs,2個(gè)組共有OTUs為3 674個(gè)(圖1)。

圖1 OTUs聚類分析維恩圖

2.2 各組眼表微生物菌群多樣性分析

2.2.12個(gè)組間Alpha多樣性比較 干眼組與非干眼組間observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。

表1 2個(gè)組間Alpha多樣性相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of alpha diversity indices between two groups組別樣本量observed species指數(shù)?[M(Q1,Q3)]Chao指數(shù)?[M(Q1,Q3)]ace指數(shù)?[M(Q1,Q3)]shannon指數(shù)#(x±s)simpson指數(shù)?[M(Q1,Q3)]非干眼組37439.5(277.0,598.2)439.5(277.0,598.2)439.5(277.0,598.2)5.418±1.4530.905(0.766,0.955)干眼組42473.0(345.5,736.5)473.0(345.5,736.5)473.0(345.5,736.5)5.537±1.4290.911(0.863,0.951)t/Z值943.000943.000943.0000.589791.000P值0.0970.0970.0970.5580.871 注:(?:Wilcoxn秩和檢驗(yàn);#:獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) Note:(?:Wilcoxon rank sum test;#:Independent samples t-test)

2.2.22個(gè)組間Beta多樣性比較 Beta多樣性PCoA分析顯示,2個(gè)組的距離矩陣置換多元方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R2=0.039,F=3.100,P=0.022)(圖2)。

圖2 基于Bray-Curtis矩陣的Beta多樣性(PCoA分析)結(jié)果 圓圈代表95%置信區(qū)間,每個(gè)坐標(biāo)軸百分?jǐn)?shù)代表解釋變量百分比

表2 2個(gè)組間相對豐度前10位的細(xì)菌門比較[M(Q1,Q3),%]Table 2 Comparison of top 10 abundant bacterial phyla between two groups [M(Q1,Q3),%]組別樣本量變形菌門放線菌門厚壁菌門擬桿菌門藍(lán)藻菌門非干眼組3748.363(34.444,58.355)18.044(5.051,27.415)8.066(3.985,12.927)2.900(0.696,6.432)1.006(0.105,3.170)干眼組4242.982(31.132,63.800)5.993(2.712,27.109)7.073(1.694,14.920)2.299(0.466,5.528)0.296(0.033,0.700)Z值836.00959.00888.00901.001 062.50P值0.8620.1820.5070.4310.020組別樣本量熱流桿狀菌門酸桿菌門綠彎菌門梭桿菌門TM菌門非干眼組370.172(0.012,0.411)0.000(0.000,0.866)0.007(0.000,0.421)0.000(0.000,0.058)0.113(0.000,0.335)干眼組420.069(0.015,0.181)0.000(0.000,0.036)0.000(0.000,0.035)0.014(0.000,0.132)0.037(0.000,0.131)Z值963.50962.00974.00719.00982.00P值0.1650.1070.1040.3200.113 注:(Wilcoxn秩和檢驗(yàn)) Note:(Wilcoxon rank sum test)

表3 2個(gè)組間相對豐度前10位的細(xì)菌菌屬比較[M(Q1,Q3),%]Table 3 Comparison of top 10 abundant bacterial genera between two groups [M(Q1,Q3),%]組別樣本量嗜糖假單胞菌棒狀桿菌丙酸桿菌假單胞菌草螺菌非干眼組371.780(0.272,28.367)3.671(0.902,13.652)3.162(1.139,8.106)0.830(0.375,3.913)2.043(0.000,6.456)干眼組4216.681(0.658,28.939)1.671(0.371,12.496)1.441(0.510,3.399)0.520(0.191,2.742)3.578(0.000,6.183)Z值700.50939.501027.50926.00733.50P值0.2720.2480.0470.3060.424組別樣本量葡萄球菌不動(dòng)桿菌棲水菌鏈球菌普雷沃菌非干眼組372.165(0.457,4.609)1.507(0.687,3.493)0.204(0.050,0.797)0.294(0.098,1.048)0.089(0.033,0.270)干眼組421.236(0.448,3.014)1.245(0.583,3.640)0.267(0.080,1.221)0.261(0.033,2.075)0.153(0.030,0.701)Z值928.00863.00751.00841.50750.00P值0.3000.6680.5350.8200.528 注:(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)) Note:(Wilcoxon rank sum test)

2.3 各組眼表微生物菌群的分類

2個(gè)組樣本鑒定出細(xì)菌隸屬40門473屬。

2.3.12個(gè)組菌門水平比較 干眼組與非干眼組檢出的相對豐度較高的前10位細(xì)菌門種類相似,干眼組和非干眼組檢出的變形菌、放線菌、厚壁菌、擬桿菌、熱流桿狀菌、酸桿菌、綠彎菌、梭桿菌、TM菌門相對豐度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),干眼組藍(lán)藻菌相對豐度低于非干眼組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1 062.50,P=0.020)(表2)。

2.3.22個(gè)組菌屬水平比較 干眼組和非干眼組檢出的噬糖假單胞菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌、假單胞菌、草螺菌、葡萄球菌、不動(dòng)桿菌、棲水菌、鏈球菌、普雷沃菌相對豐度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。干眼組丙酸桿菌屬的相對豐度低于非干眼組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1 027.50,P=0.047)(表3)。

2.4 2個(gè)組微生物標(biāo)志物分析

LEfSe分析顯示,干眼組的優(yōu)勢菌群為泰氏菌屬、棲水菌屬和芬戈?duì)柕戮鷮?非干眼組的優(yōu)勢菌群為柄桿菌屬和彎鉤菌屬(圖3,表4)。

圖3 干眼組與非干眼組菌屬水平優(yōu)勢菌群LEfSe分析(LDA>3) LDA:線性判別分析

表4 優(yōu)勢菌屬LEfSe分析Table 4 LEfSe analysis result of dominant bacterial genera種屬組別LDA值P值柄桿菌屬Caulobacter非干眼組3.4700.003彎鉤菌屬Curvibacter非干眼組3.2490.018芬戈?duì)柕戮鷮貴inegoldia干眼組3.5190.004棲水菌屬Enhydrobacter干眼組3.7550.017泰氏菌屬Tissierellaceae干眼組3.8780.015 注:LDA:線性判別分析 Note:LDA:linear discriminant analysis

3 討論

眼表微生物菌群參與眼表微環(huán)境的調(diào)節(jié),因此探討干眼患者眼表組織中細(xì)菌菌群的變化對于探索干眼的發(fā)病機(jī)制有潛在的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn),干眼患者眼表微生物菌群較非干眼者發(fā)生一定程度的改變[4],但是該領(lǐng)域研究有限,且因所用的測序方法學(xué)不同(宏基因組與16S rRNA技術(shù))、取材環(huán)境不統(tǒng)一等,造成研究結(jié)果不一致。本研究對干眼及非干眼患者結(jié)膜囊拭子樣本進(jìn)行16S rRNA基因測序,對比2個(gè)組受檢眼眼表細(xì)菌的Alpha多樣性、Beta多樣性,探索干眼與非干眼患者的優(yōu)勢菌群區(qū)別,擬尋找可能對干眼診斷有提示作用的眼表菌群。

本研究結(jié)果顯示,干眼組和非干眼組受檢眼眼表菌群Alpha多樣性相關(guān)指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而Beta多樣性PCoA分析結(jié)果存在不同,提示干眼眼表菌群的豐度無明顯變化而菌群的構(gòu)成發(fā)生了改變。Li等[3]針對中國人群的研究發(fā)現(xiàn)干眼組與非干眼組眼表菌群在Alpha與Beta多樣性上均具有顯著性差異,可能與研究入組標(biāo)準(zhǔn)、受試人群差異有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)干眼組與非干眼組眼表微生物菌群中相對豐度排名前3位菌門分別是變形菌、放線菌和厚壁菌,三者為構(gòu)成眼表菌群的核心菌門,與Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)變形菌、厚壁菌、放線菌是糖尿病干眼患者眼表菌群中豐度排名前3位菌群的結(jié)果基本相同。然而,Li等[3]研究顯示,干眼及非干眼眼表菌門水平排名前3位微生物菌群分別是變形菌、厚壁菌和擬桿菌,與本研究結(jié)果存在部分差異,可能與研究所用的干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn),各組患者菌屬水平排名前10位眼表微生物菌群分別為噬糖假單胞菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌、假單胞菌、草螺菌、葡萄球菌、不動(dòng)桿菌、棲水菌、鏈球菌、普雷沃菌,干眼患者眼表丙酸桿菌相對豐度較非干眼患者顯著下降。但一項(xiàng)針對干燥綜合征患者口腔微生物菌群的研究顯示,丙酸桿菌在干燥綜合征患者中的相對豐度顯著升高,與本研究結(jié)果不一致,推測可能由于不同部位微生物菌群存在差異,同時(shí)也證明丙酸桿菌可能是關(guān)鍵的差異菌屬[18]。

干眼組的優(yōu)勢菌群為泰氏菌屬、棲水菌屬和芬戈?duì)柕戮鷮?非干眼組的優(yōu)勢菌群為柄桿菌屬和彎鉤菌屬。本研究中LEfSe分析干眼組優(yōu)勢菌群中棲水菌屬相對豐度較高,與Andersson等[19]采用16S rRNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)德國水樣缺乏型干眼患者眼表的優(yōu)勢菌屬為棲水菌屬的研究結(jié)果一致。同樣,Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn),瞼緣炎患者眼表微生物菌群中棲水菌屬豐度較正常對照組顯著升高。因此推測,棲水菌屬在干眼中的作用可能與炎癥相關(guān),但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究基于我國最新干眼專家共識的標(biāo)準(zhǔn)[14]納入干眼患者,與既往以DEWS或者日本干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)干眼與非干眼患者之間眼表微生物菌群構(gòu)成存在差異,為眼表微生物標(biāo)志物的探索研究提供數(shù)據(jù)支持,同時(shí)為進(jìn)一步研究干眼發(fā)病機(jī)制提供了新的角度。但本研究也存在一定的局限性:(1)16S rRNA與宏基因組測序的原理與物種鑒定深度不同,16S rRNA基因測序在細(xì)菌種水平分析和功能學(xué)分析上都不占優(yōu)勢[20];(2)本研究未考慮干眼的類型和嚴(yán)重程度,未來需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,并針對干眼性質(zhì)和嚴(yán)重程度進(jìn)行分層研究;(3)本研究未排除全身藥物、免疫疾病程度和環(huán)境等混雜因素,可能導(dǎo)致結(jié)果受到一定影響;(4)由于樣本量較小,可能會(huì)存在一定程度的選擇偏倚;(5)本研究在納入干眼組及非干眼組患者時(shí),并未將屈光不正作為排除標(biāo)準(zhǔn),僅2個(gè)組內(nèi)屈光不正患者占比保持可比性。

綜上所述,本研究結(jié)果表明干眼和非干眼受檢者眼表微生物菌群構(gòu)成具有一定差異,為干眼的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的線索。未來需進(jìn)一步研究特定菌屬是否可作為生物標(biāo)志物用于干眼診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明宋瑜:參與研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集、分析、論文撰寫;齊赟:參與患者招募、研究實(shí)施;張明:參與研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集及分析;康前雁:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、患者診斷及招募、數(shù)據(jù)驗(yàn)證及論文修改;黎黎:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、對文章智力性內(nèi)容的審閱和修改及論文最終定稿