李勇 劉釗臣 彭華琮

1孝感愛(ài)爾眼科醫(yī)院,孝感 432000;2孝感市中心醫(yī)院眼科,孝感 432000;3武漢艾格眼科醫(yī)院,武漢 430019

白內(nèi)障是一種由氧化損傷、鈣紊亂、年齡、遺傳等多種因素誘發(fā)的致盲眼病,其表現(xiàn)為晶狀體混濁。晶狀體的透明性和正常功能依賴晶狀體上皮細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能的完整性[1]。研究證實(shí),高濃度過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)是導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的重要因素之一,氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的一系列產(chǎn)物使晶狀體上皮細(xì)胞的通透性、蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,其生理功能也隨之改變,從而導(dǎo)致晶狀體混濁[2-3]。因此提高晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力有助于預(yù)防和控制白內(nèi)障。蝦青素是葉黃素家族的一種,廣泛存在于海洋動(dòng)物、藻類及少數(shù)陸生植物體內(nèi)[4]。研究證實(shí),蝦青素有強(qiáng)大的抗氧化能力,能有效清除氧自由基,抑制氧化應(yīng)激損傷[5-6]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)與氧化應(yīng)激密切相關(guān),參與白內(nèi)障形成[7],通過(guò)抑制Nrf2信號(hào)通路可預(yù)防糖尿病大鼠白內(nèi)障進(jìn)展[8]。有研究報(bào)道,蝦青素對(duì)糖尿病性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體氧化應(yīng)激損傷有緩解作用,也能減少紫外線誘發(fā)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[9-10]。Li等[11]研究證實(shí),蝦青素能通過(guò)調(diào)控Nrf2/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)通路抵抗赭曲霉素A誘發(fā)的小鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷;閆孟利等[12]證實(shí),蝦青素能通過(guò)激活Nrf2通路從而抑制H2O2誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡;Kubo等[13]報(bào)道蝦青素刺激Nrf2通路防止氧化應(yīng)激損傷,改善吸煙所致的小鼠肺氣腫。以上研究提示蝦青素能通過(guò)刺激Nrf2信號(hào)通路活性緩解多種細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,但蝦青素對(duì)于晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制尚鮮有報(bào)道?；诖?本研究擬探索蝦青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 永生型人晶狀體上皮細(xì)胞系(HLEB-3)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器 膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(Annexin V FITC/PI)凋亡試劑盒(德國(guó)美天旎公司);兔抗人Nrf2一抗(710574)、兔抗人血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)一抗(PA5-77833)、兔抗人醌氧化還原酶1[NAD (P) H,quinine oxidoreductase 1,NQO1]一抗(39-3700)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和H3抗體(美國(guó)Invitrogen公司);山羊抗兔IgG二抗(ab205719)、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、DEME/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(英國(guó)Abcam公司);一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司);Multiskan GO酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);DYCP-31DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司);Tanon Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HLEB-3細(xì)胞解凍、復(fù)蘇,重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS和青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2噻唑藍(lán)法檢測(cè)不同濃度H2O2處理細(xì)胞的抑制率 取對(duì)數(shù)期HLEB-3細(xì)胞,按5×104個(gè)/ml接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后更換為含0、50、100、200、500、750 μmol/L H2O2的新鮮完全培養(yǎng)液,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μl新配制的噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,每孔加入150 μl Formazan溶解液,將96孔板置于酶標(biāo)儀中,檢測(cè)480 nm波長(zhǎng)處的吸光度(absorbamce,A)值,取6個(gè)孔A值的平均值,計(jì)算不同濃度H2O2處理細(xì)胞的抑制率,細(xì)胞抑制率=(1-各濃度H2O2處理組A值)/0 μmol/L H2O2組A值×100%。Graphpad軟件計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50)。

1.2.3MTT法檢測(cè)不同濃度蝦青素處理細(xì)胞的存活率 將對(duì)數(shù)期HLEB-3細(xì)胞接種于96孔板,分別加入0、5、10、20和50 μmol/L蝦青素,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。參照1.2.2部分方法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率,細(xì)胞存活率=各濃度蝦青素組A值/0 μmol/L蝦青素處理組A值×100%。

1.2.4細(xì)胞分組和處理 將細(xì)胞按5×104個(gè)/ml接種于96孔板中,分為正常對(duì)照組、氧化應(yīng)激組、10 μmol/L蝦青素組和20 μmol/L蝦青素組。其中氧化應(yīng)激組細(xì)胞培養(yǎng)于含250 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基中,10 μmol/L蝦青素組和20 μmol/L蝦青素組在氧化應(yīng)激組條件下分別添加終濃度為10 μmol/L和20 μmol/L的蝦青素,正常對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞,胰蛋白酶消化,預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,離心半徑3 cm 1 000 r/min離心10 min后重懸于200 μl Binding Buffer中,加入5 μl Annexin V-FITC混勻,冰浴條件下避光反應(yīng)15 min,繼續(xù)加入300 μl Binding Buffer,加入5 μl PI后1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。左下象限為活細(xì)胞,左上象限為死亡細(xì)胞,右上象限為晚期凋亡細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo) (1)SOD活性檢測(cè) 收集細(xì)胞,吸凈培養(yǎng)液,PBS洗滌,加入SOD樣品制備液,吹打裂解細(xì)胞,離心半徑10 cm,12 000 r/min離心3 min,取上清作為待測(cè)樣品。BCA試劑盒測(cè)定樣品的蛋白濃度,使用試劑盒中提供的檢測(cè)緩沖液稀釋樣品,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制酶工作液,設(shè)置樣品孔(待測(cè)樣品、酶工作液、反應(yīng)啟動(dòng)工作液)、空白對(duì)照1孔(檢測(cè)緩沖液、酶工作液、反應(yīng)啟動(dòng)工作液)、空白對(duì)照2孔(檢測(cè)緩沖液、酶工作液)和空白對(duì)照3孔(待測(cè)樣品、檢測(cè)緩沖液、酶工作液),各孔37 ℃孵育30 min,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定A值。抑制百分率=[(A空白對(duì)照1-A空白對(duì)照2)-(A樣品-A空白對(duì)照3)]/(A空白對(duì)照1-A空白對(duì)照2)×100%,待測(cè)樣品中SOD酶活力單位=抑制百分率/(1-抑制百分率)。(2)MDA含量檢測(cè) 取各組裂解細(xì)胞上清液,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制工作液,將待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品與試劑混勻,以裂解液作為空白對(duì)照,95 ℃水浴40 min,流水冷卻,離心半徑3 cm,3 000 r/min離心10 min,取上清,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)530 nm波長(zhǎng)處A值。MDA含量=(樣本A值-空白對(duì)照A值)/(標(biāo)準(zhǔn)品A值-空白對(duì)照A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×2/待測(cè)樣本濃度。(3)NO濃度檢測(cè) 取各組裂解細(xì)胞上清液,在96孔板加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品,在各孔中加入置于室溫的Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ,采用酶標(biāo)儀測(cè)量540 nm波長(zhǎng)處A值。NO濃度=(樣品A值-標(biāo)準(zhǔn)品A值)/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。(4)GSH活性檢測(cè) 取各組裂解細(xì)胞上清液,按照說(shuō)明書(shū)將試劑與待測(cè)樣本混合均勻,離心半徑3 cm,4 000 r/min離心10 min,每管取1 ml上清液,進(jìn)行顯色反應(yīng);另按照說(shuō)明書(shū)要求配制試劑,并將試劑與待測(cè)樣本混合均勻,室溫孵育15 min,于酶標(biāo)儀412 nm處檢測(cè)A值,GSH活性=(A非酶管-A酶管)/(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×稀釋倍數(shù)×樣本稀釋倍數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7Western bolt法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,離心半徑3 cm,3 000 r/min離心10 min,取上清液即為細(xì)胞質(zhì)蛋白;收集沉淀,加入200 μl核蛋白提取劑,高速渦旋30 s,離心半徑3 cm,3 000 r/min離心10 min,取上清液即為核蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST充分洗滌后分別加入Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶500)、NQO1(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜;TBST漂洗3次,每次10 min,加入相應(yīng)二抗(1∶5 000),室溫下孵育1 h;TBST漂洗3次,每次10 min,化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence,ECL)顯色,采用Image J軟件分析蛋白灰度。取核蛋白,加入Nrf2(1∶1 000)、H3(1∶2 000)一抗,檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá),步驟同上。細(xì)胞質(zhì)蛋白以GAPDH為內(nèi)參,細(xì)胞核蛋白以H3為內(nèi)參,計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 取對(duì)數(shù)期HLEB-3細(xì)胞按1×106個(gè)/ml接種于6孔板內(nèi),分別將5 μg Nrf2-小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(序列為5'-GCTTAGGCTTAGGCTTAGGC-3')或正常對(duì)照-siRNA(normal control-siRNA,NC-siRNA)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)加入6 μl Tuebofect和200 μl不含F(xiàn)BS的DMEM混合液中,混合均勻后加入6孔板內(nèi),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分為NC-siRNA組、Nrf2-siRNA組、NC-siRNA+蝦青素組、Nrf2-siRNA+蝦青素組,其中NC-siRNA組和Nrf2-siRNA組培養(yǎng)于含終濃度250 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基中,NC-siRNA+蝦青素組和Nrf2-siRNA+蝦青素組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含終濃度10 μmol/L蝦青素和250 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中NO濃度、SOD及GSH活性和MDA含量。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2處理HLEB-3細(xì)胞抑制率比較

0、50、100、200、500、750 μmol/L H2O2對(duì)HLEB-3細(xì)胞的抑制率分別為(0.00±0.00)%、(10.38±2.01)%、(18.53±2.25)%、(39.18±3.49)%、(64.59±5.42)%、(87.94±7.43)%,隨著H2O2濃度的增加,細(xì)胞抑制率隨之增加,不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞抑制率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.358,P<0.05)。H2O2對(duì)HLEB-3細(xì)胞的IC50為264.2 μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度H2O2處理HLEB-3細(xì)胞抑制率比較 F=12.358,P<0.05.與0 μmol/L H2O2比較,aP<0.05;與50 μmol/L H2O2比較,bP<0.05;與100 μmol/L H2O2比較,cP<0.05;與200 μmol/L H2O2比較,dP<0.05;與500 μmol/L H2O2比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=6)

2.2 不同濃度蝦青素處理HLEB-3細(xì)胞存活率比較

0、5、10、20、50 μmol/L蝦青素處理HLEB-3細(xì)胞后存活率分別為(100.00±0.00)%,(102.20±1.34)%、(109.50±3.60)%、(115.40±4.13)%、(93.60±2.59)%,提示5～20 μmol/L范圍內(nèi)蝦青素對(duì)HLEB-3細(xì)胞無(wú)毒性作用,而50 μmol/L蝦青素對(duì)HLEB-3細(xì)胞有明顯毒性,后續(xù)選取10 μmol/L和20 μmol/L蝦青素作為實(shí)驗(yàn)劑量。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

正常對(duì)照組、氧化應(yīng)激組、10 μmol/L蝦青素組和20 μmol/L蝦青素組細(xì)胞凋亡率分別為(9.20±0.24)%、(38.50±2.38)%、(27.60±4.33)%和(14.90±1.23)%,各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.344,P<0.001),兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 A:各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 氧化應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3個(gè)組 B:各組細(xì)胞凋亡率比較 F=18.344,P<0.001.與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與氧化應(yīng)激組比較,bP<0.05;與10 μmol/L蝦青素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=3)

表1 各組細(xì)胞中NO、MDA、SOD、GSH水平比較(x±s)Table 1 Comparison of NO,MDA,SOD and GSH contents among different groups (x±s)組別樣本量NO(μmol/L)MDA(nmol/L)GSH(U/g)SOD(U/mg)正常對(duì)照組32.01±0.091.42±0.026.48±0.2518.52±2.05氧化應(yīng)激組36.32±0.25a5.68±0.26a2.33±0.08a5.63±1.67a10 μmol/L蝦青素組34.28±0.11ab3.82±0.13ab3.96±0.06ab10.33±1.51ab20 μmol/L蝦青素組32.81±0.04abc2.11±0.02abc5.45±0.03abc15.85±2.02abcF值17.02429.52033.35424.052P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與氧化應(yīng)激組比較,bP<0.05;與10 μmol/L蝦青素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) NO:一氧化氮;MDA:丙二醛;GSH:谷胱甘肽過(guò)氧化物酶;SOD:超氧化物歧化酶 Note:Compared withnormal control group,aP<0.05;compared with oxidative stress group;bP<0.05,com-pared with 10 μmol/L astaxanthin group;cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) NO:nitric oxide;MDA:malondialdehyde;GSH:glutathione peroxidase;SOD:superoxide dismutase

2.4 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

各組NO濃度、MDA含量、GSH和SOD活性總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.024、29.520、33.354、24.052,均P<0.001)。氧化應(yīng)激組細(xì)胞中NO濃度、MDA含量較正常對(duì)照組、10 μmol/L蝦青素組和20 μmol/L蝦青素組升高,SOD、GSH活性較正常對(duì)照組、10 μmol/L蝦青素組和20 μmol/L蝦青素組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);10 μmol/L蝦青素組中NO濃度、MDA含量高于20 μmol/L蝦青素組和正常對(duì)照組,GSH、SOD活性低于20 μmol/L蝦青素組和正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

2.5 各組細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

正常對(duì)照組、氧化應(yīng)激組、10 μmol/L蝦青素組和20 μmol/L蝦青素組細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白條帶灰度逐漸減弱,細(xì)胞核Nrf2和細(xì)胞質(zhì)中HO-1及NQO1蛋白條帶灰度逐漸增強(qiáng)(圖3)。各組間細(xì)胞核Nrf2、細(xì)胞質(zhì)Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.512、20.381、31.014、23.435,均P<0.001);各組間各蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

圖3 各組HLEB-3細(xì)胞中細(xì)胞核Nrf2及細(xì)胞質(zhì)Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)電泳圖 正常對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白條帶灰度強(qiáng)于其他組,細(xì)胞核Nrf2、HO-1和NQO1蛋白條帶灰度弱于其他組 1:正常對(duì)照組;2:氧化應(yīng)激組;3:10 μmol/L蝦青素組;4:20 μmol/L蝦青素組 Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2;HO-1:血紅素加氧酶-1;NQO1:醌氧化還原酶

表2 各組HLEB-3細(xì)胞中Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of expression levels of Nrf2 signaling pathway-related proteins in HLEB-3 cells among different groups (x±s)組別樣本量細(xì)胞質(zhì)Nrf2細(xì)胞核Nrf2HO-1NQO1正常對(duì)照組31.03±0.170.23±0.080.48±0.060.11±0.02氧化應(yīng)激組30.83±0.10a0.42±0.08a0.59±0.04a0.52±0.05a10 μmol/L蝦青素組30.46±0.04ab0.60±0.10ab0.71±0.11ab0.82±0.10ab20 μmol/L蝦青素組30.33±0.06abc0.88±0.12abc0.92±0.12abc1.03±0.13abcF值20.38143.51231.01423.435P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與氧化應(yīng)激組比較,bP<0.05;與10 μmol/L蝦青素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2;HO-1:血紅素加氧酶-1;NQO1:醌氧化還原酶 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with oxidative stress group,bP<0.05;compared with 10 μmol/L astaxanthin group,cP<0.05 (One-way ANO-VA,LSD-ttest) Nrf2:nuclear factor E2 related factor 2;HO-1:heme oxygenase-1;NQO1:NAD (P) H,quinine oxidoreductase 1

2.6 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率比較

NC-siRNA組、Nrf2-siRNA組、NC-siRNA+蝦青素組、Nrf2-siRNA+蝦青素組細(xì)胞凋亡率分別為(37.50±2.31)%、(48.30±3.25)%、(25.60±1.38)%和(52.30±4.11)%,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.946,P<0.001),其中Nrf2-siRNA組和Nrf2-siRNA+蝦青素組細(xì)胞凋亡率高于NC-siRNA組和NC-siRNA+蝦青素組,NC-siRNA組細(xì)胞凋亡率高于NC-siRNA+蝦青素組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);Nrf2-siRNA+蝦青素組與Nrf2-siRNA組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率 A:各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 Nrf2-siRNA組和Nrf2-siRNA+蝦青素組細(xì)胞凋亡率高于其他組 B:各組細(xì)胞凋亡率比較 F=12.946,P<0.001. 與NC-siRNA組比較,aP<0.05;與Nrf2-siRNA組比較,bP<0.05;與NC-siRNA+蝦青素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=3)

2.7 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較

各組NO濃度、MDA含量、GSH和SOD活性總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.021、10.341、9.367、16.588,均P<0.001),其中Nrf2-siRNA組細(xì)胞NO濃度、MDA含量高于NC-siRNA組,SOD、GSH活性低于NC-siRNA組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);NC-siRNA+蝦青素組NO濃度、MDA含量低于NC-siRNA組和Nrf2-siRNA+蝦青素組,SOD、GSH活性高于NC-siRNA組和Nrf2-siRNA+蝦青素組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);Nrf2-siRNA+蝦青素組與Nrf2-siRNA組細(xì)胞NO濃度、SOD和GSH活性及MDA含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。

3 討論

生理?xiàng)l件下,人晶狀體內(nèi)存在一定數(shù)量的自由基,同時(shí)也存在過(guò)氧化氫酶、SOD、GSH等一系列活性氧組成的抗氧化體系,使晶狀體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡。在外界誘因刺激下,晶狀體內(nèi)自由基生成增多,抗氧化體系受到抑制,可引發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,誘發(fā)白內(nèi)障[14-15]。白內(nèi)障患者房水中H2O2濃度升高是介導(dǎo)早期晶狀體氧化應(yīng)激損傷的主要因素之一[16]。蝦青素作為類胡蘿卜素的一類強(qiáng)抗氧化劑,已被證實(shí)對(duì)白內(nèi)障動(dòng)物模型和晶狀體上皮細(xì)胞有調(diào)控作用。Yang等[17]研究證實(shí),蝦青素能通過(guò)降低氧化損傷而延緩1型糖尿病大鼠代謝性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展;Ishikawa等[18]證實(shí),在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的雞胚胎代謝性白內(nèi)障中,蝦青素能阻止GSH的氧化,維持還原電位。本研究結(jié)果顯示,H2O2能誘導(dǎo)HLEB-3細(xì)胞NO濃度、MDA含量升高,而抑制SOD、GSH等抗氧化酶的活性,使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷,繼而誘發(fā)凋亡和抑制生長(zhǎng),而蝦青素能逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷,抑制細(xì)胞凋亡。

表3 氧化應(yīng)激條件下各組HLEB-3細(xì)胞中NO、MDA、SOD、GSH水平比較(x±s)Table 3 Comparison of NO,MDA,SOD,GSH contents in HLEB-3 cells among various groups under different oxidative stress conditions (x±s)組別樣本量NO(μmol/L)MDA(nmol/L)GSH(U/g)SOD(U/mg)NC-siRNA組36.49±0.216.01±0.152.18±0.115.44±0.85Nrf2-siRNA組38.56±0.38a7.91±0.22a1.02±0.03a3.04±0.52aNC-siRNA+蝦青素組34.33±0.11ab4.03±0.26ab3.88±0.14ab11.21±1.34abNrf2-siRNA+蝦青素組38.81±0.24ac7.52±0.16ac1.25±0.06ac3.12±0.11acF值5.02110.3419.36716.588P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與NC-siRNA組比較,aP<0.05;與Nrf2-siRNA組比較,bP<0.05;與NC-siRNA+蝦青素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2;SOD:超氧化物歧化酶;GSH:谷胱甘肽過(guò)氧化物酶;MDA:丙二醛 Note:Compared with NC-siRNA group,aP<0.05;compared with Nrf2-siRNA group,bP<0.05;compared with NC-siRNA+astaxanthin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Nrf2:nuclear factor E2 related factor 2;SOD:superoxide dismutase;GSH:glutathione peroxidase;MDA:ma-londialdehyde

Nrf2廣泛表達(dá)于機(jī)體的各個(gè)組織,是重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)緩解氧化應(yīng)激損傷有重要作用。生理狀態(tài)下,Nrf2被胞漿蛋白Keap1 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1錨定,以非活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中;氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2被激活,與Keap1解離,轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與DNA上一段特異序列抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合,介導(dǎo)其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄活性,如HO-1、NQO1,增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧自由基的能力,降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞、組織的損傷[19]。朱麗華等[20]研究證實(shí),Nrf2在人晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及核易位能增加抗氧化酶和抗凋亡蛋白的含量,降低促凋亡蛋白的含量,從而起到抗氧化損傷和抗凋亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn),在外源性H2O2的刺激下,HLEB-3細(xì)胞中Nrf2發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)移,且下游HO-1、NQO1蛋白表達(dá)增加;同時(shí),沉默Nrf2基因后,HLEB-3細(xì)胞的NO濃度和MDA含量上調(diào),而抗氧化酶SOD和GSH活性下調(diào),細(xì)胞凋亡率升高。這一結(jié)果提示氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2在HLEB-3細(xì)胞內(nèi)發(fā)生核轉(zhuǎn)移并活化。在H2O2誘發(fā)的氧化應(yīng)激環(huán)境下,蝦青素能刺激HLEB-3細(xì)胞發(fā)生Nrf2的核轉(zhuǎn)移,繼而激發(fā)HO-1、NQO1基因轉(zhuǎn)錄,而沉默Nrf2的表達(dá)后,可逆轉(zhuǎn)蝦青素對(duì)HLEB-3細(xì)胞的這些作用,提示蝦青素對(duì)H2O2誘發(fā)HLEB-3細(xì)胞氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用可能是通過(guò)激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究證實(shí)蝦青素能提高晶狀體上皮細(xì)胞抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷能力,這一作用可能是通過(guò)活化Nrf2相關(guān)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究參照以往文獻(xiàn)并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)僅選取了2個(gè)不同劑量蝦青素進(jìn)行了研究,未驗(yàn)證更多不同劑量的效果,且尚未進(jìn)行在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,未來(lái)仍需納入更多蝦青素劑量及開(kāi)展在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李勇:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作、論文撰寫(xiě);劉釗臣:統(tǒng)計(jì)分析、研究指導(dǎo)及論文修改;彭華琮:數(shù)據(jù)整理和分析