歐陽維杰 劉祖國 孫旭光 鄧應(yīng)平 李青松 黃彩虹 林祥 朱莉

1廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心 廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院 廈門大學(xué)眼科研究所 福建省眼科與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廈門 361102;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院眼科,北京 100069;3四川大學(xué)華西醫(yī)院眼科,成都 610044;4上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院眼科,上海 200062

干眼是一種多因素引起的慢性眼表疾病,患者可出現(xiàn)眼干、異物感等一系列眼部不適癥狀,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。淚膜不穩(wěn)定是干眼發(fā)生的核心機(jī)制[2-3]。眼表組織中的黏蛋白分為跨膜型和分泌型黏蛋白,主要由結(jié)膜、角膜及淚腺所分泌,其質(zhì)或量的異?？蓪?dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降,淚液無法停留在眼表,引發(fā)干眼[4-5],進(jìn)而引起眼表上皮細(xì)胞損傷,加重黏蛋白的異常。因此,關(guān)注眼表黏蛋白的變化是干眼研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域。已有多項(xiàng)研究對(duì)干眼患者眼表黏蛋白含量的變化進(jìn)行檢測(cè),但研究報(bào)道的結(jié)果有所不同。部分研究發(fā)現(xiàn)干眼患者眼表杯狀細(xì)胞數(shù)量減少,MUC5AC蛋白水平下降[6-8],結(jié)膜上皮中MUC1、MUC4及MUC16表達(dá)量下降[9-10],而另有研究發(fā)現(xiàn)在干燥綜合征及非干燥綜合征患者的眼表及淚液中MUC1和MUC16表達(dá)量增加[11-13]。最新版的國際淚膜和眼表協(xié)會(huì)干眼疾病工作組第二次會(huì)議制定的國際干眼指南雖然對(duì)所有研究結(jié)果進(jìn)行了全面總結(jié),但仍無法準(zhǔn)確對(duì)干眼患者眼表組織中黏蛋白的變化進(jìn)行定論[14]。本研究擬探討干眼患者結(jié)膜組織中黏蛋白表達(dá)量變化及其與干眼癥狀和體征之間的關(guān)聯(lián),為干眼防控和治療措施的制定提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用橫斷面研究方法,納入2016年12月至2018年5月在廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心(27例)、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院(20例)、四川大學(xué)華西醫(yī)院(3例)、上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院(19例)首次就診、未曾接受干眼相關(guān)藥物干預(yù)的干眼患者69例69眼作為干眼組,各分中心干眼診斷均依據(jù)《干眼臨床診療專家共識(shí)(2013年)》標(biāo)準(zhǔn)[5],同期納入健康志愿者40人40眼作為正常對(duì)照組。干眼組患者平均年齡(39.7±13.3)歲,正常對(duì)照組平均年齡(22.2±2.8)歲。干眼組患者M(jìn)UC1、MUC4、MUC5AC和MUC16表達(dá)量與年齡無明顯相關(guān)性(rs=-0.065,P=0.598;rs=-0.014,P=0.911;rs=-0.247,P=0.081;rs=-0.029,P=0.815)。干眼組男女比例為1∶2,正常對(duì)照組為7∶3。干眼組男和女MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.96(0.80,4.05)、2.39(0.01,5.67),MUC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.02(0.91,3.96)、2.50(1.09,4.90),MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.21(0.02,1.13)、0.06(0.02,3.41),MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.20(1.20,3.80)、1.67(0.99,3.62),不同性別間各黏蛋白表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=522.0,P=0.94;Z=486.5,P=0.69;Z=184.0,P=0.84;Z=457.5,P=0.37)。其中來自北京的患者M(jìn)UC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較其他地區(qū)低(Z=35.78,P=0.0001),來自廈門的患者淚液分泌量和淚膜破裂時(shí)間(tear breakup time,TBUT)較其他地區(qū)低(Z=20.68,P=0.0001;Z=19.91,P=0.0001)。考慮到病例數(shù)量較少,可能會(huì)產(chǎn)生偏倚,故暫不對(duì)3例四川地區(qū)的患者與其他地區(qū)的患者結(jié)果進(jìn)行比較。

干眼患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年滿18周歲;(2)首次門診就診患者;(3)癥狀和體征符合中國干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)已診斷為干眼且接受過治療的患者;(2)對(duì)熒光素鈉溶液有變態(tài)反應(yīng)史者;(3)有除干眼外的其他眼部疾病者或接受過任何眼部手術(shù)者;(4)有眼部用藥史者;(5)有全身疾病史或全身用藥史者;(6)主要研究者和/或協(xié)助研究者認(rèn)為不適合參加此項(xiàng)研究的患者。納入研究的患者雙眼均接受檢查,選擇干眼癥狀評(píng)分高的一側(cè)眼作為研究眼;若雙眼干眼評(píng)分相等,則納入角膜熒光素鈉染色較重的一側(cè)眼;若雙眼熒光素鈉染色程度相等則取右眼為研究眼。

正常受檢者入組標(biāo)準(zhǔn):(1)年滿18周歲;(2)不存在任何需接受治療的眼科疾病;(3)至少有一側(cè)眼符合以下標(biāo)準(zhǔn):①未出現(xiàn)干眼癥狀;②TBUT>5 s;③無麻醉Schirmer試驗(yàn)Ⅰ結(jié)果>5 mm/5 min;④角膜無熒光素鈉染色。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷為干眼或存在疑似干眼癥狀或體征者;(2)既往有眼科疾病史者;(3)有熒光素鈉變態(tài)反應(yīng)史者;(4)主要研究者和/或協(xié)助研究者認(rèn)為不適合參加此項(xiàng)研究者。納入研究的正常受檢者雙眼均接受相應(yīng)檢查,若雙眼均符合入組標(biāo)準(zhǔn)則以右眼為研究眼。本試驗(yàn)方案分別經(jīng)廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院、上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批文號(hào):2017003、TREC2016-29、2016年審(310)號(hào)、PTEC-A-2016-18-1],研究過程遵循《赫爾辛基宣言》和中國有關(guān)臨床試驗(yàn)研究規(guī)范和法規(guī),患者進(jìn)入研究前均了解本研究的方法和目的并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)量控制 4家眼科中心研究人員在項(xiàng)目啟動(dòng)前進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn),規(guī)范檢查設(shè)備,統(tǒng)一檢查和干眼診斷標(biāo)準(zhǔn),檢查人員具有藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范培訓(xùn)證書。試驗(yàn)全程由臨床協(xié)調(diào)員監(jiān)察臨床研究質(zhì)量、跟蹤研究進(jìn)度及臨床試驗(yàn)工作協(xié)調(diào)。

1.2.2眼科臨床檢查 對(duì)所有受檢者進(jìn)行臨床檢查,包括記錄患者病史、干眼癥狀評(píng)分、TBUT、角膜結(jié)膜熒光素鈉染色評(píng)分、Schirmer試驗(yàn)Ⅰ。本研究按照如下順序依次對(duì)受試者進(jìn)行檢查。

1.2.2.1干眼癥狀評(píng)分 先后采用中國干眼問卷、眼表疾病指數(shù)量表(Ocular Surface Disease Index,OSDI)和干眼相關(guān)生活質(zhì)量評(píng)分問卷(Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire,DEQS)對(duì)受檢者進(jìn)行干眼癥狀評(píng)估,所有受檢者在研究者的監(jiān)督和指導(dǎo)下獨(dú)立填寫并完成3份問卷。根據(jù)OSDI問卷癥狀評(píng)分[17]將干眼組受檢眼進(jìn)行癥狀分組:總分≤12為無癥狀組,共9眼;總分>12～32為輕中度癥狀組,共40眼;總分>32為重度癥狀組,共20眼。

1.2.2.2TBUT測(cè)定 將用1滴生理鹽水濕潤的熒光素鈉試紙條接觸受檢者下瞼結(jié)膜囊,囑受檢者瞬目數(shù)次,使試紙條與淚液充分混合。采用16倍裂隙燈顯微鏡(SL220,德國蔡司公司)的鈷藍(lán)光觀察受檢者末次瞬目至出現(xiàn)第1個(gè)淚膜破裂點(diǎn)的時(shí)間,TBUT<5 s為異常。檢查重復(fù)3次,取平均值。

1.2.2.3熒光素鈉染色評(píng)估角結(jié)膜上皮完整性 TBUT測(cè)定結(jié)束后繼續(xù)在16倍裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察角結(jié)膜熒光素染色。根據(jù)國際眼科機(jī)構(gòu)染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[15]對(duì)角膜上皮完整性進(jìn)行評(píng)估。將角膜分為上、鼻、中、下、顳側(cè)5個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域評(píng)分均為0～3分,總分為各區(qū)域評(píng)分之和,總分≥1分為異常。參照Van Bijsterveld評(píng)分體系[16]對(duì)角結(jié)膜上皮完整性進(jìn)行評(píng)分。將角結(jié)膜分為顳側(cè)、角膜和鼻側(cè)3個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域評(píng)分0～3分,總分為各區(qū)評(píng)分之和,總分≥1分為異常。

1.2.2.4Schirmer試驗(yàn)Ⅰ評(píng)估淚液分泌量 在無局部麻醉情況下,將Schirmer試紙彎折處放入患者下瞼結(jié)膜囊中外1/3處,囑患者平視前方后閉眼,5 min后取出試紙條,測(cè)量淚液浸潤長(zhǎng)度。淚液浸潤長(zhǎng)度≤5 mm為異常。

1.2.2.5干眼癥狀體征評(píng)估 在干眼癥狀方面,OSDI評(píng)分≤32分為輕中度干眼,>32分為重度干眼。在體征方面,根據(jù)有無角膜熒光素鈉染色將干眼分為輕度和重度干眼。

1.2.3結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)標(biāo)本采集 采用鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼行表面麻醉,囑患者注視下方,暴露受檢眼上方球結(jié)膜,并用無齒鑷夾取醋酸纖維素膜輕貼于患者上方球結(jié)膜,在膜上均勻輕壓數(shù)次,3～5 s后取下醋酸纖維素膜,并用另一無齒鑷將膜放入350 μl保存液中(裂解液:β-巰基乙醇體積比為100∶1),漩渦振蕩1 min,使細(xì)胞充分裂解,-80 ℃保存。操作結(jié)束后受檢眼用氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定標(biāo)本中MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)RNA提取試劑盒[DP420,天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟,將-80 ℃保存的標(biāo)本室溫下溶解,渦旋振蕩混勻,轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上,離心半徑10 cm,12 000 r/min離心2 min,收集濾液,加入1倍體積分?jǐn)?shù)70%乙醇,用移液器混勻,全部轉(zhuǎn)移至吸附柱CR1上,12 000 r/min離心30～60 s,棄廢液。向吸附柱中加入350 μl去蛋白液RW1,12 000 r/min離心30～60 s,棄廢液。向吸附柱中加入80 μl DNase I工作液,室溫下放置15 min,加入350 μl去蛋白液RW1,12 000 r/min離心30～60 s,棄廢液。向吸附柱中加入500 μl漂洗液RW,室溫靜置2 min,12 000 r/min離心30～60 s,棄廢液,重復(fù)漂洗2次。12 000 r/min離心2 min,棄廢液。將吸附柱在室溫下放置數(shù)分鐘,以徹底晾干殘余的漂洗液。將吸附柱置入新的RNase-free離心管中,加入14 μl RNase-free ddH2O,室溫放置2 min,12 000 r/min離心1 min,所得溶液即為RNA溶液。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(KIT0204,美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。采用SYBR預(yù)混試劑盒(RR420A,日本TaKaRa公司),反應(yīng)體系為10.0 μl,包括1.0 μl cDNA,0.2 μl正向和反向引物,5.0 μl混合液及3.6 μl DEPC水。PCR反應(yīng)條件:95 ℃變性10 s,60 ℃退火5 s,72 ℃延伸20 s,共45個(gè)循環(huán)。引物序列(5'-3'):MUC1正向序列為ACAATTGACTCTGGCCTTCC,反向序列為CAGACTGG GCAGAGAAAGGA;MUC4正向序列為CTTACTCTGGC CAACTCTGTAGTG,反向序列為GAGAAGTTGGGCTTG ACTGTC;MUC5AC正向序列為TCCACCATATACCGC CACAGA,反向序列為TGGACCGACAGTCACTGTCAAC;MUC16正向序列為GCCTCTACCTTAACGGTTACAATG AA,反向序列為GGTACCCCATGGCTGTTGTG;β-actin正向序列為CATGTACGTTGCTATCCAGGC,反向序列為CTCCTTAATGTCACGCACGAT。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔCt計(jì)算各目的黏蛋白基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)法行正態(tài)分布檢驗(yàn),均不滿足正態(tài)分布,以M(Q1,Q3)表達(dá)。2個(gè)組間相關(guān)評(píng)估指標(biāo)差異比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),多個(gè)組間評(píng)估指標(biāo)總體差異比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn),多重比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)分析法評(píng)估干眼患者結(jié)膜黏蛋白表達(dá)水平與受檢眼癥狀評(píng)分及體征相關(guān)指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 干眼組和正常對(duì)照組受檢者結(jié)膜中MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

干眼組受檢眼結(jié)膜中跨膜黏蛋白MUC1和MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.277(0.568,5.790)和1.815(1.048,3.694),分別高于正常對(duì)照組的1.055(0.550,2.010)和1.024(0.541,1.965),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=819.00,P=0.008;Z=861.00,P=0.002);干眼組受檢眼結(jié)膜中MUC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.465(1.016,4.881),高于正常對(duì)照組的1.356(0.371,3.082),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1 029.00,P=0.055)。干眼組受檢眼結(jié)膜中MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.075(0.022,1.725),與正常對(duì)照組的0.288(0.075,2.325)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=438.00,P=0.226)(圖1)。

圖1 各組受檢眼結(jié)膜中MUC1、MUC4、MUC5AC和MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(Wilcoxon秩和檢驗(yàn),正常對(duì)照組n=40,干眼組n=69)

2.2 干眼組和正常對(duì)照組受檢眼臨床癥狀評(píng)分比較

干眼組TBUT和平均淚液分泌量明顯小于正常對(duì)照組,角膜染色評(píng)分、角結(jié)膜染色評(píng)分、中國干眼問卷評(píng)分、OSDI評(píng)分以及DEQS評(píng)分均高于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。干眼患者中,癥狀輕體征輕者28例、癥狀重體征輕者10例、癥狀輕體征重者21例、癥狀重體征重者10例。

2.3 各組受檢眼結(jié)膜中MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA表達(dá)量與干眼癥狀評(píng)分的關(guān)聯(lián)

干眼組中結(jié)膜MUC1、MUC4、MUC5AC和MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量與中國干眼問卷、OSDI和DEQS總評(píng)分間均無明顯相關(guān)性(均P>0.05)。無癥狀組、輕中度癥狀組和重度癥狀組受檢眼結(jié)膜中MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.209(0.157,5.666)、3.277(1.161,6.226)和0.859(0.015,4.472),輕中度癥狀組結(jié)膜中MUC1 mRNA表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=9.04,P=0.029)。重度癥狀組MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=12.24,P=0.007)。各不同癥狀評(píng)分組間MUC4、MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.69,P=0.196;Z=2.72,P=0.437)(圖2)。

圖2 不同干眼癥狀評(píng)分組MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),正常對(duì)照組n=40,無癥狀組n=9,輕中度癥狀組n=40,重度癥狀組n=20) 1:正常對(duì)照組;2:無癥狀組;3:輕中度癥狀組;4:重度癥狀組 MUC:黏蛋白

表1 各組受檢眼臨床癥狀比較[M(Q1,Q3)]Table 1 Comparison of clinical symptoms between two groups [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)TBUT(s)平均淚液分泌量(mm)角膜染色評(píng)分(分)角結(jié)膜染色評(píng)分(分)中國干眼問卷評(píng)分(分)OSDI評(píng)分(分)DEQS評(píng)分(分)正常對(duì)照組407.67(5.75,9.33)19.00(9.75,30.00)0.00(0.00,0.00)0.00(0.00,0.00)5.00(3.00,7.00)8.33(4.17,19.17)9.17(3.33,16.25)干眼組693.00(2.33,4.00)9.00(5.00,13.00)0.00(0.00,2.00)0.00(0.00,1.00)10.00(7.00,14.50)22.50(16.67,34.75)23.33(16.67,39.17)Z值147.0614.0827.5960.0487.0522.5535.0P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)) TBUT:淚膜破裂時(shí)間;OSDI:眼表疾病指數(shù)量表;DEQS:干眼相關(guān)生活質(zhì)量評(píng)分問卷 Note:(Wilcoxon rank sum test) TBUT:tear film breakup time;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Question-naire

2.4 干眼患者結(jié)膜MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量與干眼體征評(píng)分的相關(guān)性

干眼患者結(jié)膜MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與TBUT呈正相關(guān)(rs=0.270,P=0.025),與角膜染色評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.331,P=0.006),與角結(jié)膜染色評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.325,P=0.007),與視頻播放終端使用時(shí)間呈正相關(guān)(rs=0.547,P=0.001)。MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量與淚液分泌量均不相關(guān)(rs=-0.184,P=0.134;rs=0.066,P=0.596;rs=-0.230,P=0.108;rs=-0.117,P=0.343)(表2)。

角膜染色陽性患者中,MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與DEQS中難以睜眼的癥狀評(píng)分呈正相關(guān)(rs=0.275,P=0.035),與角膜染色評(píng)分、淚液分泌量均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.331,P=0.006;rs=-0.437,P=0.016)。MUC4表達(dá)與眼痛癥狀評(píng)分呈正相關(guān)(rs=0.371,P=0.044)。MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量與DEQS中視物模糊癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.359,P=0.047)(表3)。MUC4與MUC16的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.455,P=0.012)。在角膜染色陰性患者中,MUC1表達(dá)與視頻播放終端使用時(shí)間呈正相關(guān)(rs=0.622,P=0.003),與晨起分泌物出現(xiàn)頻率評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.498,P=0.001),與MUC16呈正相關(guān)(rs=0.635,P<0.001)。MUC4表達(dá)與干燥感癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.393,P=0.015);MUC16與干眼患者生活質(zhì)量評(píng)分,如閱讀時(shí)癥狀加重評(píng)分、影響開夜車程度評(píng)分、影響計(jì)算機(jī)工作程度評(píng)分、影響看電視程度評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.370,P=0.034;rs=-0.558,P=0.016;rs=-0.498,P=0.006;rs=-0.515,P=0.002)(表4)。

表2 結(jié)膜黏蛋白與干眼體征評(píng)分的相關(guān)性Table 2 Correlation between conjunctival mucins and dry eye signs黏蛋白眼數(shù)TBUT角膜染色評(píng)分VDT時(shí)間中國干眼問卷OSDI評(píng)分DEQS評(píng)分角結(jié)膜染色評(píng)分rsPrsPrsPrsPrsPrsPrsPMUC1690.2700.025-0.3310.0060.5470.001-0.0830.498-0.1700.8890.0440.717-0.3250.007MUC4690.1350.272-0.1970.108-0.0960.590-0.1970.108-0.1070.383-0.1760.151-0.0220.549MUC16690.2490.0390.1090.373-0.2390.240-0.0100.936-0.0520.672-0.0860.4810.0550.656MUC5AC51-0.0820.5670.0830.5630.0120.943-0.0160.912-0.0320.823-0.0070.963-0.0870.549 注:(Spearman秩相關(guān)分析) MUC:黏蛋白;TBUT:淚膜破裂時(shí)間;VDT:視頻播放終端;OSDI:眼表疾病指數(shù)量表;DEQS:干眼相關(guān)生活質(zhì)量評(píng)分問卷 Note:(Spearman correlation analysis) MUC:mucin;TBUT:tear breakup time;VDT:video display terminal;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire

表3 角膜染色陽性患者黏蛋白表達(dá)與癥狀體征評(píng)分的相關(guān)性Table 3 Correlation between expression levels of conjunctival mucins and symptoms,signs in dry eye patients with positivecorneal fluorescein staining黏蛋白眼數(shù)難以睜眼評(píng)分(DEQS)角膜染色評(píng)分眼痛評(píng)分(OSDI)視物模糊評(píng)分(DEQS)MUC4淚液分泌量rsPrsPrsPrsPrsPrsPMUC1310.2750.035-0.3310.006-0.3080.0920.1410.451-0.1890.818-0.4370.016MUC430-0.1660.381-0.0060.9760.3710.044-0.0930.624——-0.0370.849MUC16310.3230.0760.1220.5140.2580.162-0.3590.0470.4550.012-0.0680.722 注:(Spearman秩相關(guān)分析) MUC:黏蛋白;OSDI:眼表疾病指數(shù)量表;DEQS:干眼相關(guān)生活質(zhì)量評(píng)分問卷 Note:(Spearman correlation analysis) MUC:mucin;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire

表4 角膜染色陰性患者黏蛋白表達(dá)與癥狀體征評(píng)分的相關(guān)性Table 4 Correlation between expression levels of conjunctival mucins and symptoms,signs in dry eye patients with negativecorneal fluorescein staining黏蛋白眼數(shù)VDT時(shí)間(h/周)晨起分泌物評(píng)分(中國干眼問卷)干燥感評(píng)分(中國干眼問卷)閱讀時(shí)癥狀加重評(píng)分(OSDI)影響開夜車程度評(píng)分(OSDI)影響電腦工作程度評(píng)分(OSDI)影響看電視程度評(píng)分(OSDI)MUC16rsPrsPrsPrsPrsPrsPrsPrsPMUC1380.6220.003-0.4980.001-0.0840.6160.0790.664-0.0120.9630.0930.631-0.0870.6240.6350.0001MUC438-0.0260.914-0.1190.478-0.3930.015-0.2440.172-0.2760.268-0.280.141-0.1530.3880.1280.445MUC16340.2350.319-0.2190.187-0.2730.098-0.3700.034-0.5580.016-0.4980.006-0.5150.002—— 注:(Spearman秩相關(guān)分析) MUC:黏蛋白;VDT:視頻播放終端;OSDI:眼表疾病指數(shù)量表 Note:(Spearman correlation analysis) MUC:mucin;VDT:video display terminal;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire

2.5 不同程度癥狀體征組干眼患者結(jié)膜MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

癥狀體征較輕的患者M(jìn)UC1、MUC4及MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=245,P<0.001;Z=342,P=0.009;Z=366,P=0.022),MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=106,P=0.015);癥狀重體征輕的患者M(jìn)UC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=112,P=0.039)。癥狀輕體征重和癥狀重體征重者M(jìn)UC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=236,P=0.010;Z=80,P=0.004),MUC1、MUC4及MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表5～8)。

表5 不同程度癥狀體征組結(jié)膜中MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)]Table 5 Comparison of relative expression of MUC1 mRNAin conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組391.52(0.55,2.01)干眼組癥狀輕體征輕284.47(2.01,6.57)a干眼組癥狀重體征輕105.02(0.67,8.70)a干眼組癥狀輕體征重211.81(0.001,3.81)干眼組癥狀重體征重102.11(0.01,4.75)H值18.49P值0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn),Nemenyi檢驗(yàn)) MUC1:黏蛋白1 Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC1:mucin 1

表6 不同程度癥狀體征組結(jié)膜中MUC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)]Table 6 Comparison of relative expression of MUC4 mRNAin conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)MUC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組392.72(1.36,3.08)干眼組癥狀輕體征輕286.29(3.05,9.27)a干眼組癥狀重體征輕102.51(1.09,4.08)干眼組癥狀輕體征重212.49(0.92,4.38)干眼組癥狀重體征重92.85(0.53,3.09)H值8.07P值0.089 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn),Nemenyi檢驗(yàn)) MUC4:黏蛋白4 Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC4:mucin 4

表7 不同程度癥狀體征組結(jié)膜中MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)]Table 7 Comparison of relative expression of MUC5ACmRNA in conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)MUC5AC mRNA相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組262.76(0.07,2.33)干眼組癥狀輕體征輕150.25(0.01,0.51)a干眼組癥狀重體征輕35.35(0.001,9.67)干眼組癥狀輕體征重153.40(0.02,5.93)干眼組癥狀重體征重70.87(0.06,0.95)H值6.26P值0.181 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn),Nemenyi檢驗(yàn)) MUC5AC:黏蛋白5AC Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC5AC:mucin 5AC

表8 不同程度癥狀體征組結(jié)膜中MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)]Table 8 Comparison of relative expression of MUC16mRNA in conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組381.29(0.54,1.97)干眼組癥狀輕體征輕272.19(0.91,3.75)a干眼組癥狀重體征輕101.86(0.97,2.76)干眼組癥狀輕體征重212.61(0.98,3.91)a干眼組癥狀重體征重103.21(1.57,5.15)aH值11.65P值0.02 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn),Nemenyi檢驗(yàn)) MUC16:黏蛋白16 Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC16:mucin 16

3 討論

研究表明,干眼的病理改變伴隨著眼表黏蛋白的改變[14]。本研究結(jié)果顯示,與正常人相比,干眼患者眼表跨膜黏蛋白MUC1和MUC16 mRNA表達(dá)水平升高,并且MUC1 mRNA表達(dá)水平與TBUT、角膜染色評(píng)分顯著相關(guān)。研究表明,跨膜黏蛋白具有潤滑、抗炎、抗菌以及親水作用[18]。有研究報(bào)道炎癥介質(zhì)釋放可促進(jìn)MUC1表達(dá)升高,MUC1表達(dá)上調(diào)可通過抑制Toll樣受體通路而抑制炎癥,并且MUC1和MUC16通過抑制白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8及腫瘤壞死因子α來調(diào)節(jié)眼表炎癥[19-21]。本研究入組患者主要以輕中度干眼患者為主,我們推測(cè)干眼早期階段,其結(jié)膜上皮細(xì)胞功能尚完好,眼表微環(huán)境還未完全失衡,機(jī)體受到干眼刺激及引起的輕微炎癥而處于應(yīng)激狀態(tài),結(jié)膜上皮細(xì)胞可能應(yīng)激過表達(dá)黏蛋白用于抵抗眼表刺激和早期炎癥[11,18]。

跨膜黏蛋白在干眼中的變化情況一直未明確,其結(jié)果差異較大。其中一個(gè)主要原因是這些研究中患者入組標(biāo)準(zhǔn)不完全相同,一些研究納入了有全身因素(如干燥綜合征)的患者[12],而一些研究同時(shí)納入首診和復(fù)診干眼患者[11]。由于入組條件不一致,其可比性較差。應(yīng)用治療干眼藥物可影響患者黏蛋白表達(dá)[22]。因而只有納入未影響眼表的全身性疾病、未進(jìn)行過眼表藥物治療的患者才能反映患者黏蛋白表達(dá)的真實(shí)情況。本研究是目前首次研究無全身疾病首診干眼患者的結(jié)膜黏蛋白表達(dá)情況,能更清晰地反映干眼原始的病理改變情況。

MUC1是最小的黏蛋白,但其具有許多功能,MUC1有利于黏蛋白層的分布,并且被認(rèn)為是黏膜細(xì)胞表面形成黏膜屏障的關(guān)鍵黏蛋白,失去MUC1的黏膜上皮易受病原微生物感染[23]及增加染料滲透。另有報(bào)道稱,MUC1缺失的小鼠結(jié)膜炎和瞼緣炎的發(fā)生率更高[24]。因此,MUC1對(duì)維持眼表正常微環(huán)境具有重要作用。本研究中通過Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),MUC1的表達(dá)與TBUT呈正相關(guān),與角膜及結(jié)膜染色評(píng)分呈負(fù)相關(guān),說明MUC1表達(dá)影響干眼體征的嚴(yán)重程度。

MUC16是位于角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞頂端膜上的跨膜黏蛋白,在抗菌、維持角膜屏障功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要作用[25]。一些研究發(fā)現(xiàn)在干眼患者中MUC16表達(dá)增加[11,13]。MUC16上調(diào)被認(rèn)為是眼表上皮細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)釋放的保護(hù)性信號(hào)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)干眼患者結(jié)膜組織中MUC16表達(dá)增加。Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),MUC16表達(dá)與干眼患者生活質(zhì)量相關(guān),反應(yīng)了MUC16具有保護(hù)性作用。

本研究還存在一些不足:首先,所檢測(cè)的MUC5AC相對(duì)表達(dá)量較低,甚至部分樣本測(cè)不出MUC5AC序列,考慮與樣本收集后未及時(shí)冷凍而造成部分RNA降解有關(guān)。其次,首診干眼患者多數(shù)以輕中度干眼為主,極少數(shù)為重度干眼患者,因此重度干眼患者數(shù)量較少,可能存在偏倚,仍需增大樣本量進(jìn)一步研究。此外,由于條件不足,印跡細(xì)胞采集無法滿足實(shí)驗(yàn)室蛋白檢測(cè)所需的樣本濃度,因此未檢測(cè)干眼患者黏蛋白的蛋白水平,同時(shí)在基因?qū)用鎯H選擇最常研究的4種黏蛋白作為研究對(duì)象。而隨著淚液蛋白質(zhì)檢測(cè)手段的不斷更新,淚液蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)方式將為我們提供更加全面的蛋白層面的分析[27],這將是今后進(jìn)一步的研究工作。

綜上所述,首診干眼患者結(jié)膜黏蛋白MUC1和MUC16表達(dá)增加,其中MUC1表達(dá)與患者干眼體征相關(guān),MUC16表達(dá)與患者的生活質(zhì)量相關(guān)。

利益沖突資金提供者與ADES/主要研究者/協(xié)助研究者在計(jì)劃、實(shí)施和報(bào)告研究方面的關(guān)系不影響研究結(jié)果及其解讀。參與者的權(quán)益可得到保障

作者貢獻(xiàn)聲明劉祖國、鄧應(yīng)平、孫旭光:參與選題、研究設(shè)計(jì)和研究標(biāo)準(zhǔn)化制定、數(shù)據(jù)分析結(jié)果的審核、論文智力性內(nèi)容的修改及定稿;歐陽維杰:參與研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集及分析、論文撰寫及修改;李青松、黃彩虹、林祥、朱莉:參與研究實(shí)施、參數(shù)測(cè)量、數(shù)據(jù)采集及分析、論文修改

志謝感謝日本參天株式會(huì)社對(duì)本研究提供資金資助