陳翠翠，梁煥坤，鐘樹海，陸嫣紅，李來慶

（1.廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司，廣州 510663；2.濟(jì)南市來德生物科技有限公司，濟(jì)南 271100）

登革熱是由登革熱病毒（dengue virus，DENV）感染引起的一種急性傳染性疾病，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，是分布最廣、發(fā)病數(shù)量最多、危害較大的一種蟲媒病毒性疾病[1]。人感染DENV的臨床癥狀有持久高熱、頭痛、全身肌肉痛、骨關(guān)節(jié)痛、皮疹等癥狀[2]。全球每年約有4 億例登革熱病例和2.2 萬例死亡病例[3]。自1978年在廣東出現(xiàn)首例確診病例后，登革熱在我國呈現(xiàn)由南向北不斷蔓延、感染人數(shù)不斷增加的趨勢。以2019年為例，中國大陸高達(dá)28 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）報(bào)告登革熱病例共計(jì)22 599 例，顯著高于2018年（5 136例）[4]。目前，登革熱病毒并沒有有效疫苗或針對性的治療方法，而快速準(zhǔn)確的檢測方法對于其防控和治療具有重要意義[5]。目前，我國的登革熱體外診斷試劑均為定性檢測產(chǎn)品，對靈敏度更高的定量產(chǎn)品有迫切需求?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是一種新型的分析方法，具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確度、選擇性較好、儀器簡單、分析速度快、線性范圍可寬達(dá)幾個(gè)數(shù)量級等優(yōu)點(diǎn)，在近幾年的臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用愈來愈廣泛[6]。本研究擬采用CLIA 建立一種登革熱病毒NS1 抗原快速檢測方法，為登革熱的快速、準(zhǔn)確、早期篩查提供一種新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象 登革熱陰陽性樣本來自廣州市疾病預(yù)防控制中心，其中110 例陰性樣本來自健康體檢志愿者，年齡5～65歲，無傳染病、一月內(nèi)無服藥史；85 例陽性樣本為臨床確診的患者血清樣本（具有登革熱臨床表現(xiàn)或流行病學(xué)史，登革熱病毒核酸陽性），年齡6～58 歲，無傳染病、一月內(nèi)無服藥史。血清樣本的使用已獲得作者知情同意。

1.2 儀器與試劑 羧基化磁珠（杭州博岳生物技術(shù)有限公司，貨號M1000C）；NS1 抗原及其配對抗體對為廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司制備；吖啶酯[赫利森（廈門）生物科技有限公司，貨號HS-11015006]；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，（EDC，貨號22980）]，N-羥基磺基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysulfosuccinimide sodium，NHS）（Sigma 公司）?；瘜W(xué)發(fā)光檢測儀（重慶科斯邁生物科技有限公司，型號SMART500S）。發(fā)光底物（含激發(fā)液和預(yù)激發(fā)液）（雅培公司，貨號6E23-82 和6C55-82）。

1.3 方法

1.3.1 NS1單抗-吖啶酯發(fā)光試劑的制備：按照4∶1的質(zhì)量比，將NS1 單抗與吖啶酯混合，室溫下振蕩反應(yīng)1h，加入終濃度為0.5%（v/v）賴氨酸溶液終止反應(yīng)。用0.1mol 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析（去除游離的吖啶酯）24h 后，過Sephadex G50 凝膠層析純化，收集具有高發(fā)光強(qiáng)度的產(chǎn)物，即為純化的NS1 單抗-吖啶酯發(fā)光試劑，儲存于4℃下備用。

1.3.2 NS1 配對單抗-磁珠偶聯(lián)物的制備：采用常用的EDC/NHS 方法活化羧基磁珠后再與NS1 配對單抗進(jìn)行偶聯(lián)。具體步驟為：0.05mol 嗎啉磺酸（pH 6.0）洗滌羧基磁珠后，加入等量的EDC 和NHS，常溫下振蕩活化30 min 后，按照NS1 配對單抗與磁珠質(zhì)量比1∶5 加入NS1 配對單抗，室溫下振蕩反應(yīng)3h。然后，經(jīng)封閉緩沖液（0.05 mol Tris+0.02% Triton X-100+5g/dl 牛血清清蛋白）封閉1h 后，0.1mol PBS 洗滌數(shù)次后得到NS1 配對單抗-磁珠偶聯(lián)物，用磁珠稀釋液（0.05mol Tris+5g/dl 牛血清清蛋白+0.05% Triton X-100+5g/dl 海藻糖+0.05g/dl Proclin300）溶解，放于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測步驟：按照優(yōu)化的條件，在化學(xué)發(fā)光檢測儀上設(shè)置各參數(shù)，進(jìn)行全自動化檢測。具體檢測步驟為：取50μl NS1 配對單抗-磁珠偶聯(lián)物，分別加入50μl 的NS1 抗原標(biāo)準(zhǔn)品或人血清樣本和100μl NS1 單抗-吖啶酯發(fā)光試劑，37℃溫育反應(yīng)20 min，外加磁場促使磁珠及其磁珠偶聯(lián)物聚集到試管底部，洗滌磁珠上吸附的雜質(zhì)，然后加入100μl 的發(fā)光底物預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液后，檢測吖啶酯光子的相對光強(qiáng)度（relative luminosity，RLU）。樣本中的NS1 抗原濃度與收集到的RLU呈正相關(guān)，通過檢測一系列NS1 抗原標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算得出待測樣品中NS1 抗原的濃度。

1.3.4 檢測線性范圍和靈敏度評估：制備NS1抗原系列濃度：0，0.1，1，10，100，500 和1 000 ng/ml，采用本方法檢測各濃度對應(yīng)的發(fā)光光度值，采用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)濃度測定3 個(gè)復(fù)孔。以不含NS1 抗原的溶液為樣本，重復(fù)測定20 次，計(jì)算平均值（）及其標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，s），數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到本方法檢測NS1 抗原的靈敏度。

1.3.5 檢測特異度評估：采用本檢測方法分別檢測100ng/ml 人血清清蛋白，100ng/ml 膽紅素，100ng/ml血紅蛋白，100ng/ml 白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）和100ng/ml 甲流病毒抗原樣本，以評估該試劑盒的特異度。

1.3.6 參考區(qū)間的確定：對110 例健康志愿者血清樣本進(jìn)行檢測，應(yīng)用SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。先確定110例樣本NS1抗原濃度值是否為正態(tài)分布，若為正態(tài)分布，采用正態(tài)分布法計(jì)算參考區(qū)間；若為偏態(tài)分布，則采用百分位法計(jì)算參考區(qū)間，取其第95 百分位[7]。

1.3.7 臨床樣本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取85 例臨床確診的登革熱陽性血清樣本，20 例健康志愿者陰性血清樣本，采用美國Cortez 公司的登革熱NS1 快速檢測試劑盒和本試劑盒同時(shí)進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果與臨床結(jié)果進(jìn)行對比，以確定本試劑盒臨床篩查登革熱的靈敏度。采用配對卡方檢驗(yàn)（McNemar test）和一致性檢驗(yàn)（Kappa test）分析兩種方法的對比結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，GraphPad Prism 5軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考區(qū)間采用正態(tài)分布法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 檢測線性范圍和靈敏度結(jié)果 見圖1。以NS1抗原系列濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.355 3X+3.446 2，r2= 0.991 3。NS1 抗原濃度在0.1～1 000ng/ml 范圍內(nèi)時(shí)，本檢測方法具有良好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。以不含NS1 抗原的溶液為樣本，重復(fù)測定20 次，得到本方法檢測NS1 抗原的靈敏度為1.12ng/ml。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測特異度結(jié)果 見表1。用本方法重復(fù)3 次檢測100ng/ml NS1 抗原，得到的平均濃度為98.60ng/ml；人血清清蛋白、膽紅素、血紅蛋白、IL-6和甲流病毒抗原，檢測值分別為1.46，1.05，1.11，0.96 和1.63ng/ml，交叉反應(yīng)率均低于2%，表明血清中常見干擾物質(zhì)對該方法NS1 抗原檢測的影響較小，方法特異度較好。

表1 特異度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 參考區(qū)間 110 份健康志愿者血清樣本進(jìn)行檢測，計(jì)算得到的NS1 抗原濃度使用SPSS 17.0 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其數(shù)值呈正態(tài)分布，參考區(qū)間cut off 值計(jì)算公式為±1.64s，110 份健康志愿者NS1 抗原的平均濃度為2.53ng/ml，s為0.692，計(jì)算得到cut off 值為3.66ng/ml。這意味著當(dāng)利用本方法檢測臨床血清樣本時(shí)NS1抗原濃度大于3.66ng/ml 時(shí)，懷疑患者感染了登革熱病毒；NS1 抗原濃度值小于3.66ng/ml 時(shí)，患者感染登革熱病毒的可能性較小。

2.4 臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果 本方法檢測85 例臨床確診的登革熱陽性血清樣本，20 份健康志愿者陰性血清樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)85 例臨床確診的登革熱陽性血清樣本全部為陽性，20 例陰性血清樣本全部為陰性，提示該方法臨床檢測準(zhǔn)確度較高。兩種方法的比對結(jié)果采用SPSS 軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，配對卡方檢驗(yàn)（McNemar test）的P值為1.000，一致性檢驗(yàn)（Kappa test）的Kappa 值為0.876。卡方檢驗(yàn)結(jié)果說明了本方法與Cortez 公司試劑盒在臨床樣本檢測上無顯著性差異。

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金法是目前登革熱病毒抗原和抗體最常用的血清學(xué)檢測方法，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是最常用的分子學(xué)檢測方法[8-9]。美國Cortez 公司的NS1檢測試劑盒（膠體金法）是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的、靈敏度和特異度好的登革熱快速診斷試劑盒，也是我國進(jìn)口數(shù)量最多、使用最廣的登革熱快速檢測試劑盒[10]。目前，我國的登革熱體外診斷試劑均為定性檢測產(chǎn)品，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足國內(nèi)市場對登革熱快速診斷試劑的需求。本實(shí)驗(yàn)選擇臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中日益受到青睞的CLIA，經(jīng)過NS1 單抗-吖啶酯發(fā)光試劑的制備、NS1 配對單抗-磁珠偶聯(lián)物的制備和檢測步驟的優(yōu)化，建立了一種登革熱病毒NS1 抗原CLIA，該方法對血清中NS1 抗原的檢測靈敏度高、線性范圍寬、特異度好、對臨床樣本的檢測準(zhǔn)確度較高、與Cortez 公司NS1 檢測試劑盒比較無顯著性差異，為登革熱的快速、準(zhǔn)確、早期篩查提供一種新的技術(shù)方法。

登革熱病毒為單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約11kb，由1 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）和非編碼區(qū)（5’UTR，3’UTR）組成，ORF可編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白、膜蛋白和包膜蛋白）和七種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和NS5）[11-12]。其中，NS1 是臨床上公認(rèn)的DENV 感染早期檢測的生物標(biāo)志物[13]。NS1 基因長約1 056bp，編碼的NS1 蛋白是登革熱病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖蛋白，該糖蛋白在登革熱病毒四種病毒血清型間高度保守，其在血清中的檢測常早于IgM 抗體和RNA 的產(chǎn)生，在登革熱的早期診斷中具有重要作用[14]。此外，在13例原發(fā)性登革熱感染病例中，NS1 抗原是5 例中檢測到的唯一標(biāo)志物[15]。因此，本研究選擇NS1 抗原作為檢測對象，建立了一種登革熱臨床篩查的新方法。

臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果顯示，85 例臨床確診的登革熱陽性血清樣本全部為陽性，20 例陰性血清樣本全部為陰性，說明本CLIA 法的檢測準(zhǔn)確度較高。Cortez 公司試劑盒的檢測結(jié)果有2 例陽性樣本檢測為陰性，2 例陰性樣本檢測為陽性，其準(zhǔn)確度不如該CLIA 法。但配對卡方檢驗(yàn)和一致性檢驗(yàn)顯示CLIA 法與Cortez 公司試劑盒無顯著性差異，提示該CLIA 法具有更高的檢測靈敏度（假陰性率低）和特異度（假陽性率低）、抗溶血等干擾能力較強(qiáng)。雖然在操作簡便性、快捷性上不如Cortez 公司的膠體金試劑，該方法優(yōu)勢在于可全自動化檢測，檢測的靈敏度和特異度更好。值得注意的是，臨床檢驗(yàn)中對陽性結(jié)果的判斷一定要慎重，不能僅憑單一檢測結(jié)果而確診，要結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查及患者的臨床癥狀進(jìn)行綜合分析。

本研究也有一些局限性。首先，由于臨床樣本數(shù)量有限，參考區(qū)間cutoff 值的獲得可能與實(shí)際情況存在偏差，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需增加樣本量，進(jìn)一步明確參考區(qū)間。其次，臨床樣本驗(yàn)證選擇的是85 例臨床確診的登革熱陽性血清樣本，缺少疑似病例樣本的驗(yàn)證，后續(xù)將補(bǔ)充臨床疑似病例樣本、治療恢復(fù)期的臨床樣本，全面考核該CLIA 法的檢測性能。本研究建立的CLIA 法，僅僅進(jìn)行了初步的靈敏度、特異度和臨床樣本驗(yàn)證評價(jià)，明確該方法達(dá)到了實(shí)驗(yàn)室檢測的基本要求，且具有與商業(yè)化試劑相當(dāng)?shù)臋z測性能，有開發(fā)為臨床檢測試劑的潛力，但未進(jìn)行全面客觀的評價(jià)，并未獲得國家注冊，目前還無法臨床應(yīng)用。

綜上所述，本研究建立的登革熱NS1 抗原CLIA 法，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、強(qiáng)特異度、簡便快捷等優(yōu)點(diǎn)，可為臨床登革熱的診斷提供一種新的技術(shù)手段，在登革熱的早期診斷和療效評估等方面可能發(fā)揮重要作用。