張文娟，郭 逸，段 勇，馮 娜，彭 鵬，景媛媛

（陜西省血液中心，西安 710061）

近年來，臨床治療開始大量選擇成分輸血，機(jī)采血小板因純度高、臨床療效好、起效快等優(yōu)點導(dǎo)致需求量越來越大，但其可用性和安全性受到血小板儲存損傷（platelet sterage lesion,PSL）和細(xì)菌污染風(fēng)險的限制[1]。PSL 是從采血到輸血過程中發(fā)生在血小板中的生化和功能變化的總和[2-4]。對PSL深入的研究可以延長血小板的體外保存期，提高使用率和減少浪費。目前PSL 診斷主要依賴于對血小板形態(tài)、功能、代謝等方面的檢測，尋找敏感度較高的生物學(xué)標(biāo)志物來評價PSL 迫在眉睫。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（＞200 個核苷酸長），盡管缺乏編碼蛋白的功能，但LncRNA 通過多級調(diào)節(jié)途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其可以在各種主要細(xì)胞功能（例如增殖、遷移和凋亡）中作為正相或者負(fù)相調(diào)節(jié)劑[5-8]。有研究表明，lncRNA 可以作為miRNA 海綿發(fā)揮作用進(jìn)而調(diào)節(jié)疾病進(jìn)程[9]。LncRNA 作為研究血小板的新興關(guān)注點，與miRNA 相比，其在PSL 中的研究鮮有報道。

為了深入分析血小板儲存過程中LncRNA 的表達(dá)與PSL 之間的關(guān)系，通過前期預(yù)實驗，收集陜西省血液中心4 份正常機(jī)采血小板，利用Primerpremier 6.0 軟件設(shè)計了多個LncRNAs（SENCR，SNHG9，LIPCAR，GAS5，H19，MIAT，LincRNA-p21，MEG3，UCA1 及MALAT1）引物，采用實時熒光定量RCR（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）檢測機(jī)采血小板中上述指標(biāo)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)預(yù)測心臟重塑造的基因長鏈非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA predicting cardias remodeling,LIPCAR）的表達(dá)量變化對血小板儲存時間延長比較敏感。本研究通過擴(kuò)大樣本量運用qRT-PCR 檢測機(jī)采血小板在22±2℃恒溫振蕩保存箱內(nèi)伴隨儲存時間延長，LIPCAR 的表達(dá)水平變化，分析LIPCAR對PSL 的影響和意義，為其將來在血小板領(lǐng)域的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集本站2021年11月～2022年7月健康獻(xiàn)血者32 例，其中男性22 例，女性10 例，血型分別是11 例A Rh+，2 例B Rh+，2 例AB Rh+和17 例O Rh+，要求其在捐獻(xiàn)機(jī)采血小板前7 天內(nèi)不能服用抗生素或改變血小板功能的藥物。所有樣本經(jīng)檢驗科乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗及核酸檢測結(jié)果均陰性，生化指標(biāo)檢測結(jié)果正常，符合臨床病人輸血相關(guān)檢測要求?？蒲杏贸煞盅ㄟ^西安市中心血站倫理委員會批準(zhǔn)，獻(xiàn)血者符合中華人民共和國衛(wèi)生部規(guī)定的《獻(xiàn)血者健康檢查要求》（GB18467-2011）標(biāo)準(zhǔn)，采集后機(jī)采血小板樣本pH 值檢測結(jié)果（7.0±0.1），血小板計數(shù)、白細(xì)胞殘余量計數(shù)、紅細(xì)胞殘留量計數(shù)合格，厭氧菌和需氧菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，無細(xì)菌生長。質(zhì)量檢測結(jié)果均符合《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB18469-2012）的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 Trima accel 全自動血液成分分離機(jī)及配套管路（80300，泰爾茂比司特有限公司）；血小板恒溫震蕩保存箱（XHZ-IB DLP90，蘇州醫(yī)用儀器廠）；無菌接管機(jī)（TSCD-2，日本TERUMO 公司）；全自動血細(xì)胞計數(shù)儀（SYSMEXKX-21，日本希森美康公司）；殘余白細(xì)胞計數(shù)儀（ADAM-rWBC，韓國納諾恩泰）；血全自動細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)（BACTECFX 2000，美國BD 公司）；熒光定量PCR 儀（7500，美國ABI 公司）；超微量核酸檢測儀（美國賽默飛公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號AG11706，中國艾科瑞生物公司）；熒光定量PCR 試劑盒（貨號AG11706，中國艾科瑞生物公司）；引物序列：β-actin 上游引物：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC-3’；LIPCAR 上游引物：5’-TAAAGGATGCGTAGGGA TGG-3’，下游引物：5’-TTCATGATCACGCCCTCA TA-3’，PCR 引物合成（上海生工公司）。

1.3 方法

1.3.1 機(jī)采血小板的制備：應(yīng)用Trima accel 血細(xì)胞分離機(jī)分離采集，全自動血細(xì)胞收集系統(tǒng)回路管組收集機(jī)采血小板，每單位血小板濃度標(biāo)準(zhǔn)為≥2.5×1011個，收集32 份健康機(jī)采血小板各100ml，置于20～24℃血小板恒溫振蕩保存箱內(nèi)水平振蕩保存。

1.3.2 機(jī)采血小板的分組：將收集的每人份機(jī)采血小板通過無菌接管機(jī)分成5 份，每份約20ml，保存于22±2℃恒溫振蕩保存箱內(nèi)，于不同儲存時間（1，3，5，7 和9 天）取出一份檢測血小板質(zhì)量指標(biāo)，用qRT-PCR 對不同儲存時間血小板中LIPCAR的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.3.3 LncRNA LIPCAR 表達(dá)水平檢測：①血小板分離：將不同儲存時間的血小板樣本10 ml 倒入離心管，8000g 離心2 min，棄上清；向每5×106個細(xì)胞中加入1 ml 的RNAiso Plus，混勻，室溫（15～30℃）靜置5 min，分離RNA。②血小板RNA 提?。菏褂肦NAiso Plus 提取血小板RNA，加入適量RNase-free 水溶解沉淀RNA。③使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5s，4℃。④Real Time PCR：按兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序Stage 1：預(yù)變性，Reps：1，95℃ 30 s；Stage 2：PCR 反應(yīng)，Reps：40，95℃ 5 s，60℃30～34 s。倍數(shù)變化被標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin，并使用2-ΔΔCt方法計算表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，不同儲存時間LIPCAR 表達(dá)差異分析采用Kruskal Wallis 秩和檢驗，不同天數(shù)之間數(shù)據(jù)比較均采用兩兩多重比較的Bonferroni 矯正法計算矯正P值（Adj P），AdjP＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。針對LIPCAR 表達(dá)量與性別的關(guān)聯(lián)性采用t檢驗，與血型關(guān)聯(lián)性選用ANOVA 方差齊性分析，不同血型之間兩兩組間比較選用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 檢測LIPCAR 在正常機(jī)采血小板不同儲存時間表達(dá)量 對同一捐獻(xiàn)者機(jī)采血小板樣本，于儲存的第1，3，5，7，9 天進(jìn)行qRT-PCR檢測LIPCAR 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)伴隨儲存時間延長，LIPCAR 表達(dá)水平逐漸增高，數(shù)據(jù)總體差異存在統(tǒng)計意義（H=89.46，P＜0.001）。對不同儲存天數(shù)之間LIPCAR 表達(dá)量進(jìn)行兩兩多重比較，發(fā)現(xiàn)第1天與第3 天校正后的LIPCAR 表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.094）；第1 天和第5 天，第1天和第7 天，第1 天和第9 天校正后的LIPCAR 表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）；第3 天和第7 天，第3 天和第9 天校正后的LIPCAR 表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）；第5 天和第9 天校正后的LIPCAR 表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016），見圖1。

圖1 機(jī)采血小板樣本不同儲存時間（1，3，5，7，9d）LIPCAR 表達(dá)量qRT-PCR 檢測結(jié)果（**P＜0.05）

2.2 機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者性別和血型差異與LIPCAR表達(dá)量關(guān)系 32 份機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者不同儲存時間LIPCAR 表達(dá)量根據(jù)性別進(jìn)行t檢驗分析，發(fā)現(xiàn)在第5 天和第1 天（t=2.189，P=0.038）、第7 天和第1 天（t=2.320，P=0.028）、第9 天和第1 天（t=2.264，P=0.032）男性表達(dá)量均高于女性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2A。根據(jù)血型不同進(jìn)行ANOVA 方差齊性分析，總體存在同質(zhì)性差異（F=3.160，P=0.043），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步通過LSD 法進(jìn)行兩兩組間比較，發(fā)現(xiàn)AB Rh+型與O Rh+型儲存第7 天和第1 天LIPCAR 的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.015），見圖2B。

圖2 機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者在不同儲存時間LIPCAR 表達(dá)量與性別和血型的相關(guān)性分析

3 討論

血液中，血小板是最小的無核細(xì)胞，其易變形、高度敏感，易進(jìn)入小血管，可快速應(yīng)激，在出血與止血、血栓形成、損傷反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。血小板結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有細(xì)胞器、線粒體、致密小體、殘核以及散在分布的顆粒成分。每個血小板均攜帶大量的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）生物信息，通過快速、有效的應(yīng)答來發(fā)揮作用。血小板中的線粒體與細(xì)胞核一樣，具有DNA，雙層細(xì)胞膜、細(xì)胞分裂周期等特點，在能量產(chǎn)生和代謝中發(fā)揮著重要作用。健康血小板通常包含5～8 個線粒體，其更新周期為9～24 天，而無核細(xì)胞血小板的平均存活時間為7～10 天，可能是由線粒體的更新周期決定的[11]。有研究證實B 淋巴細(xì)胞瘤-XL 可通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡來決定血小板的存活時間[12]。LIPCAR 是線粒體長鏈非編碼RNA，提示LIPCAR 是否可能參與調(diào)控血小板的線粒體通路。

LIPCAR 在心血管疾病發(fā)生發(fā)展、預(yù)后等方面的研究已比較深入。有研究證明LIPCAR 的過表達(dá)有可能是治療動脈粥樣硬化的潛在治療靶標(biāo)[13]。LIPCAR 可以預(yù)測心血管疾病患者的生存期，血漿中LIPCAR 的過表達(dá)可能是診斷ST 段抬高型心肌梗死的警告信號[14-15]。YAN 等[16]證明LIPCAR是急性心肌梗死后患者心力衰竭的潛在標(biāo)志物。WANG 等[17]證實LIPCAR 通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路調(diào)節(jié)心房纖維化，為房顫的臨床治療提供了潛在的方法。在腫瘤研究領(lǐng)域，LIPCAR 在肝癌患者外周血和肝癌細(xì)胞株中均高表達(dá)，其可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。

針對LncRNA 在血小板方面的研究報道，迄今僅局限于利用芯片進(jìn)行表達(dá)譜分析。有學(xué)者通過對血小板濃縮液RNA 測序，共檢測到2 923 個LncRNAs，其中1 413 個LncRNAs 的表達(dá)水平變化是明顯的，42 種的水平上升，28 種的水平下降[19]。國內(nèi)學(xué)者通過芯片研究發(fā)現(xiàn)有大量的LncRNAs 存在于血小板中，其表達(dá)量隨著血小板儲存時間的延長而呈現(xiàn)增高或降低不同的變化趨勢，進(jìn)一步分析表明部分變化的LncRNAs 與血小板聚集、激活、內(nèi)吞等生理過程密切相關(guān)，并且在PSL 中發(fā)揮作用[20]。

本研究首次用大量健康獻(xiàn)血者機(jī)采血小板樣本依據(jù)儲存時間不斷延長，初步判定LIPCAR 表達(dá)水平不斷增高。同時，發(fā)現(xiàn)不同性別、血型之間LIPCAR 表達(dá)量伴隨儲存時間延長具有顯著性差異。通過分析推測由于機(jī)采血小板在體外時間延長，LIPCAR 表達(dá)反應(yīng)性增多，并通過調(diào)控血小板的線粒體通路來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成從而影響血小板的聚集和止血功能，不同人群性別和血型差異可能因為個體免疫系統(tǒng)對外界條件變化的敏感性不同而導(dǎo)致血小板功能差異，這與之前研究報道的血小板儲存時間延長與免疫介導(dǎo)的輸血反應(yīng)風(fēng)險增加結(jié)論相符。

總之，本實驗使LIPCAR 在正常機(jī)采血小板方面的研究邁出第一步，為進(jìn)一步探討其在PSL 中的作用及分子機(jī)制提供了一定的實驗依據(jù)。但同時，實驗也有一定的局限性，具體LIPCAR 是如何參與調(diào)控PSL 的分子機(jī)制還需進(jìn)行不斷驗證，后續(xù)會繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，細(xì)化指標(biāo)分類，適當(dāng)結(jié)合臨床機(jī)采血小板患者輸注后相關(guān)指標(biāo)變化來研究其意義。