邢俊杰，盛永亮，張浩然，劉春輝，李志軍（河南科技大學第一附屬醫(yī)院泌尿外二科，河南洛陽 471000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例達57.3 萬例，死亡病例達21.3 萬例[1]。非肌層浸潤膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)是最常見的膀胱癌類型，目前其治療以經尿道膀胱腫瘤電切術(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)輔助術后灌注化療為主，但仍有約50%～70%患者術后復發(fā)進展，危及生命[2]。尿路上皮癌相關基因1(upregulated in bladder cancer 1,UBC1)是一種長鏈非編碼RNA，參與個體生長發(fā)育、細胞外基質重塑等病理生理過程[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，UBC1 在膠質瘤、結直腸癌等[4-5]惡性腫瘤中表達升高，其通過促進腫瘤細胞的惡性增殖轉移，導致患者不良生存預后。帕金森病相關蛋白-1（Parkinson’s disease associated protein-1，DJ-1）是肽酶C56 蛋白家族成員，參與細胞轉化、細胞凋亡等多種生物學過程的調控[6]。HE 等[7]報道，前列腺癌中DJ-1 的表達升高通過誘導Kirsten 肉瘤病毒致癌基因的表達，促進腫瘤細胞的侵襲、遷移，是新的血清腫瘤標志物。目前NMIBC 患者血清中UBC1 和DJ-1 表達及兩者的臨床意義尚不清楚。本研究通過檢測NMIBC 患者血清UBC1 和DJ-1 表達，探討兩者的臨床預后預測價值，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年2月～2019年2月于河南科技大學第一附屬醫(yī)院接受TURBT 治療的120 例NMIBC 患者為NMIBC 組。納入標準：①經組織病理學檢查明確診斷為NMIBC；②初次診治，無放化療治療史；③臨床病理及隨訪資料完整，患者及家屬依從性好，對本研究知情同意并簽字。排除標準：①并發(fā)其他惡性腫瘤；②并發(fā)急性膀胱炎、尿道狹窄及凝血功能異常等疾病；③并發(fā)嚴重肝腎功能障礙。NMIBC 組中，男性80 例，女性40例；年齡40～69（62.84±4.17）歲；有吸煙史72例；腫瘤直徑≥3cm 者28 例，＜3cm 者92 例；腫瘤數(shù)目：單發(fā)77 例，多發(fā)43 例；腫瘤TNM 分期：Ta～Tis 期81 例，T1 期39 例；腫瘤分級：低級別75 例，高級別45 例。以同期健康體檢的60例健康人群為對照組，其中男性50 例，女性30 例；年齡37～68（61.29±4.05）歲；有吸煙史35 例。兩組在性別、年齡及吸煙史之間，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2 儀器與試劑 Varioskan LUX多功能酶標儀（美國賽默飛公司）。熒光定量PCR儀器（美國ABI公司，型號ABI7500）。UBC1 和GAPDH 引物由上海華大公司設計合成。人血清DJ-1 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海梵態(tài)生物有限公司，貨號PT4510）。逆轉錄試劑盒及2×SYBR Green Master Mix 試劑盒（北京索萊寶公司，貨號T2240，SR1110）。

1.3 方法

1.3.1 血清UBC1，DJ-1 表達檢測及分組：留取NMIBC 患者入院后次日清晨空腹靜脈血，對照組健康體檢時清晨空腹靜脈血5ml，3 000 r/min 離心10min，分離上層血清。應用Trizol 法提取血清中總RNA，將總RNA 反轉錄為cDNA 后進行熒光定量PCR 反應。UBC1 上游引物：5’-CAAGAGGAGCCGGCTTAGCATCTA- 3’，下游引物：5’- ACGGTTCCAGTCCTCAGTCAG- 3’；GAPDH 上游引物：5’- CAAGAGGAGCCGGCTTAG CATCTA- 3’，下游引物：5’- ACGGTTCCAGTCCTC AGTCA- 3’。反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40 個循環(huán)?？傮w系：SYBR Premix Master Mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA 2μl 和雙蒸水 7ml。以GAPDH為內參，血清UBC1 的相對表達量采用2-△△Ct法表示。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清DJ-1 水平,實驗操作嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。分別根據血清UBC1，DJ-1 表達的平均值1.29，8.30 ng/ml 為界，分為UBC1 高表達組（n=59）和低表達組（n=61），DJ-1 高表達組（n=55）和低表達組（n=65）。

1.3.2 隨訪：所有NMIBC 患者TURBT 術后予以常規(guī)膀胱灌注化療，并進行定期隨訪，術后第一年每三月隨訪一次，術后第二，三年每半年隨訪一次，以門診或電話方式隨訪，隨訪內容為隨訪期間腫瘤復發(fā)或轉移情況，對膀胱鏡檢及影像學有異常情況的患者進行組織活檢病理學確診，記錄從術后至發(fā)生腫瘤復發(fā)或轉移的時間為無進展生存時間。隨訪時間截止2022年3月。隨訪終點為隨訪結束或發(fā)生腫瘤復發(fā)或轉移。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據。計量資料進行K-S 正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）[M（P25，P75）]表示，組間兩兩比較采用非參數(shù)Mann-whitneyU檢驗。計數(shù)資料以率(%)表示，組間率比較采用卡方檢驗。Kaplan-Meier 生存分析血清UBC1，DJ-1表達對NMIBC 患者無進展生存預后的影響。單因素及多因素COX 回歸分析影響NMIBC 患者無進展生存預后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清UBC1，DJ-1 表達比較 NMIBC組血清UBC1，DJ-1 表達分別為4.19±0.48，8.62±3.60 ng/ml，高于對照組血清UBC1，DJ-1 表達（1.27±0.29，4.31±1.07 ng/ml），差異具有統(tǒng)計學意義（t=43.300，12.117，均P＜0.05）。

2.2 血清UBC1，DJ 1 表達與NMIBC 患者臨床病理特征的關系 見表1。腫瘤T1 期、高級別NMIBC 患者血清中UBC1，DJ-1 表達分別高于Ta/Tis 期、低級別患者，差異具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05）。不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑和腫瘤數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05）。

表1 血清UBC1，DJ-1 表達與NMIBC 患者臨床病理特征的關系[±s，M（P25，P75）]

表1 血清UBC1，DJ-1 表達與NMIBC 患者臨床病理特征的關系[±s，M（P25，P75）]

類 別nUBC1 相對表達量t/ZPDJ-1（ng/ml）t/ZP年齡 （歲）＜60524.14±0.45 1.0200.310 8.29±3.89 0.8520.396≥60684.23±0.508.87±3.54性別 男性804.21±0.42 8.74±3.50 0.6750.501 0.8070.421女性404.15±0.538.18±3.75吸煙情況 是724.24±0.43 8.77±3.53 1.3500.179 0.5540.580否484.12±0.548.40±3.66腫瘤直徑（cm） ≥3284.32（3.71，4.93）8.80（6.21，11.39）0.7480.213 0.4940.469＜3924.12（3.64，4.60）8.57（6.03，11.11）腫瘤數(shù)量 單發(fā)774.13±0.47 8.44±3.50 1.6810.095 0.7400.461多發(fā)434.29±0.558.94±3.64 TNM 分期 Ta/Tis 期813.79±0.43 7.34±3.04 15.3140.000 5.9960.000 T1 期395.21±0.5611.28±3.98腫瘤分級 低級別753.64±0.44 7.49±3.23 16.3930.000 4.5840.000高級別455.11±0.5310.50±3.87

2.3 血清UBC1，DJ-1 表達與NMIBC 患者無進展生存預后的關系 見圖1。120 例NMIBC 患者隨訪期間，腫瘤進展39 例，3年無進展生存率為67.50%（81/120）。UBC1 高表達組和低表達組患者的平均無進展生存時間分別為28.17±3.68 個月，33.59±3.32 個月。UBC1 高表達組患者累積無進展生存時間低于UBC1 低表達組患者，差異具有統(tǒng)計學意義（Log-Rank testχ2=6.681，P＜0.05）。DJ-1 高表達組和低表達組平均無進展生存時間分別為27.34±3.29 個月，34.27±3.54 個月。DJ-1高表達組患者累積無進展生存時間低于DJ-1 低表達組患者，差異具有統(tǒng)計學意義（Log-Rank testχ2=11.262，P＜0.05）。

圖1 K-M 生存曲線分析血清UBC1，DJ-1 表達與無進展生存預后的關系

2.4 單因素及多因素COX 回歸分析影響NMIBC 患者無進展生存預后的因素 見表2，3。以TURBT術后是否發(fā)生進展為因變量(1=是，0=否，t=無進展生存時間)，將年齡（≥60 歲vs＜60 歲）、性別（男vs 女）、吸煙史（有vs 無）、腫瘤直徑（＞3cm vs ≤3cm）、腫瘤數(shù)量（多發(fā)vs 單發(fā)）、腫瘤TNM 分期（T1 期vs Ta/Tis 期）、腫瘤分級（高級別vs 低級別），UBC1（高表達vs 低表達），DJ-1（高表達vs 低表達）為自變量，進行單因素COX 回歸分析，將單因素分析中差異具有統(tǒng)計學意義的因素（P＜0.05）納入及多因素COX 回歸分析，結果顯示，腫瘤分期T1 期、腫瘤分級高級別、UBC1 高表達、DJ-1 高表達是影響NMIBC 患者無進展生存預后的獨立危險因素。

表2 影響NMIBC 患者無進展生存預后的單因素COX 回歸分析

表3 影響NMIBC 患者無進展生存預后的多因素COX 回歸分析

3 討論

NMIBC 是腫瘤侵犯上皮或上皮下結締組織，未侵犯肌層的膀胱癌，占初發(fā)性膀胱腫瘤的70%。NMIBC 的治療以TURBT 聯(lián)合術后膀胱灌注化療為主，但即使經積極治療后腫瘤仍然容易復發(fā)。目前NMIBC 患者治療后隨訪主要以膀胱鏡鏡檢，尿脫落細胞等為主。膀胱鏡鏡檢是NMIBC 評估復發(fā)的金標準，但有一定的有創(chuàng)性。尿脫落細胞檢查特異度高，但對于低級別膀胱癌診斷的敏感度較差。外周血炎癥指標、尿液核基質蛋白22 及膀胱腫瘤抗原等也是非侵入性的用于膀胱癌早期診斷的標志物，但單一指標檢測對膀胱癌復發(fā)診斷的敏感度和特異度不高[8]。因此，深入研究NMIBC 的疾病機制，尋找能夠有效評估NMIBC 患者預后的血清生物標志物，有利于指導后續(xù)的個體化治療方案，改善患者的臨床預后。

長鏈非編碼RNA（Lnc RNA）是長度超過200個核苷酸的非蛋白編碼RNA 分子，可位于細胞核或細胞質中。近年來發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA 通過調控基因組重塑、染色質修飾和基因轉錄后修飾，參與細胞凋亡、細胞周期、侵襲和增殖等生物學過程[9-10]。UBC1 作為一種Lnc RNA 的轉錄長度為2 616bp，位于染色體1q32.1 上，其在結直腸癌等腫瘤中表達上調，促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移，導致腫瘤患者不良預后[4-5]。本研究中，NMIBC 患者血清中UBC1 表達升高，并且與腫瘤TNM 分期及腫瘤分級有關，提示血清UBC1 水平受NMIBC 疾病影響。NMIBC 中UBC1 的表達升高的機制可能與UBC1 基因的轉錄調控失調有關。8 號染色體短臂的丟失是NMIBC 等尿路上皮癌發(fā)生的重要機制，結果導致轉錄因子鋅指蛋白703 等癌基因的過度表達[11]。WANG 等[12]報道，膠質瘤中轉錄因子鋅指蛋白703 結合UBC1 基因啟動子，在轉錄水平促進UBC1 的表達，促進膠質瘤細胞的惡性增殖和侵襲。有學者發(fā)現(xiàn)，在58.8%的膀胱癌組織中UBC1表達升高，這與本研究結果中NMIBC 患者血清UBC1 水平升高一致[13]。另外，在膀胱癌腫瘤細胞系T24,5637 中發(fā)現(xiàn)，UBC1 能夠與多梳蛋白抑制復合物2 結合形成復合物，促進組蛋白H3K27me3 修飾，誘導癌基因的表達，增強膀胱癌細胞的侵襲、淋巴轉移及集落形成能力[13]。因此，我們提出假說，NMIBC 患者血清UBC1 水平升高能夠促進NMIBC的腫瘤發(fā)病和進展，進而導致患者不良預后。本研究中證實，UBC1 高表達的NMIBC 患者無進展生存預后較差，并且UBC1 高表達是影響NMIBC 患者無進展生存預后的獨立因素，提示血清UBC1 是一種新的NMIBC 預后相關腫瘤標志物。ZHANG等[14]學者對膀胱癌患者血清外泌體LncRNA 表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)相比于尿脫落細胞學檢測，基于UBC1，PCAT-1 和SNHG16 的組合模型能夠更為有效評估膀胱癌術后復發(fā)，診斷的準確性達0.857。因此，UBC1 可能是一種理想的評估NMIBC 患者預后的血清標志物。臨床泌尿外科醫(yī)生可根據UBC1 的表達水平，對NMIBC 患者TURBT 術后是否發(fā)生腫瘤復發(fā)進展進行評估，對于高危復發(fā)進展的患者，予以積極化療或卡介苗膀胱灌注免疫治療，以改善患者臨床預后。

DJ-1 是一種帕金森病相關蛋白，又稱PARK7，表達于人體多種組織中，具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡及抗氧化等多種功能[15]。研究表明，DJ-I 可與p53，磷酸酶張力蛋白同源物基因等多個抑癌基因相互作用，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7,16]。本研究中，NMIBC 患者血清DJ-1 表達明顯升高，并與腫瘤TNM 分期及腫瘤分級有關，提示NMIBC 能夠影響血清DJ-1 水平。與SOUKUP等[17]在尿液中發(fā)現(xiàn)DJ-1 表達上調結果一致。但該研究尿液DJ-1 對NMIBC 診斷的敏感度和特異度較低（61%，67%），其原因是低級別、低分期的膀胱癌腫瘤細胞DJ-1 表達量較低，并且其結果受到腎功能和尿量的影響。因此，血清DJ-1 水平可能是理想的NMBIC 血清腫瘤標志物。NMIBC 中DJ-1 的表達可能與微小RNA 介導的轉錄后調控異常有關。研究表明，微小RNA-203 能夠結合并抑制DJ-1 mRNA 的表達，腫瘤發(fā)生時微小RNA-203 表達異常降低，導致DJ-1 mRNA 穩(wěn)定性增加，導致DJ-1 蛋白表達增加，進而抑制腫瘤細胞的凋亡[18]。膀胱癌中由于10 號染色體雜合性缺失，導致磷酸酶張力蛋白同源物基因等抑癌基因的失活。LEE等[19]發(fā)現(xiàn)，DJ-1 的表達升高通過抑制磷酸酶張力蛋白同源物基因的表達，激活磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 信號通路，促進腫瘤細胞的惡性增殖和轉移。此外，DJ-1 的表達升高可通過促進結直腸癌腫瘤細胞中細胞周期蛋白D1 的表達，抑制p53-Bax 抗凋亡途徑，促進腫瘤的過度增殖和轉移，導致腫瘤分期增高[20]。因此，我們推測NMIBC 患者血清DJ-1表達升高可導致患者不良預后。本研究通過生存分析證實，DJ-I 高表達的NMIBC 患者無進展生存預后較差，是影響患者無進展生存預后的獨立危險因素，提示血清DJ-1 可能是新的評估NMIBC 預后的生物標志物。DJ-I 高表達導致NMIBC 患者不良預后的原因可能與DJ-1 參與促進抗腫瘤藥物耐藥性形成有關。有學者報道，DJ-1 可通過激活細胞外信號調節(jié)激酶/RAS 信號通路的激活，增強腫瘤細胞對酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼耐藥性的形成[7]。NMIBC 患者TURBT 術后常規(guī)予以膀胱灌注化療，以預防腫瘤復發(fā)。WANG 等[21]報道，結直腸癌中DJ-1 通過活化核因子κB/Snail 信號通路，誘導腫瘤細胞上皮間質轉化，促進腫瘤細胞對奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等化療藥物耐藥性形成。因此，DJ-I 是一種新的NMIBC 預后相關腫瘤標志物，以DJ-1 為靶點的臨床治療可能通過增加術后膀胱灌注化療治療的敏感度，改善患者的無進展生存預后。

綜上所述，NMIBC 患者血清UBC1 和DJ-1 表達升高，兩者表達與腫瘤TNM 分期、腫瘤分級有關。血清UBC1 和DJ-1 高表達的NMIBC 患者無進展生存預后較差，是影響患者無進展生存預后的獨立危險因素。臨床醫(yī)生可根據血清UBC1，DJ-1 表達水平，對患者接受TURBT 治療后的預后進行評估，對于高危進展的NMIBC 患者及時采取有效措施進行預防，以改善患者的臨床預后。但本研究尚存在一定的不足，本研究樣本量有限，未對NMIBC 患者TURBT 術后血清UBC1，DJ-1 水平變化進行動態(tài)分析，有待今后設計多中心、大樣本及前瞻性的臨床實驗進一步驗證。