曲志梅，董 偉，劉艷萍（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，濟(jì)南 271199）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是起源于造血干細(xì)胞以病理性造血為特征的異質(zhì)性克隆性疾病，具有向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前MDS 發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與分子遺傳學(xué)、造血微環(huán)境變化、造血干/祖細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡紊亂和腫瘤抑制基因甲基化等多種因素相關(guān)[2-3]。傳統(tǒng)化療對(duì)MDS 療效有限，去甲基化藥物（hypomethylating agents，HMAs）已成為對(duì)于國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)（the international prognostic scoring system，IPSS）不適合移植的中危-2 級(jí)和高?；颊叩呐R床治療首選藥物[4]。HMA是一種特異性的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，包括阿扎胞苷和地西他濱（decitabine，DAC），盡管HMAs 治療的總有效率約為50%，但患者的完全緩解率僅為20%，且嚴(yán)重的骨髓抑制需要多療程鞏固治療等因素導(dǎo)致患者治療依從性較差[5]。此外，隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，部分患者的療效會(huì)逐漸下降，耐藥性普遍存在嚴(yán)重影響HMAs 臨床效果。為進(jìn)一步提高M(jìn)DS 患者的緩解率和生存時(shí)間，探索與HMAs 的聯(lián)合治療是MDS 治療的主要目標(biāo)。

維奈克拉（venetoclax，VCX）是2016年獲得美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）加速批準(zhǔn)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病，在2019年獲得可用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤的高選擇性B 細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2（B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl-2）抑制劑[6]。在MDS治療領(lǐng)域，多個(gè)地區(qū)的臨床研究表明，VCX 聯(lián)合HAMs 對(duì)初治高危MDS 是安全有效的[7]。一項(xiàng)前瞻性研究也報(bào)道，DAC 聯(lián)合VCX 維持治療對(duì)預(yù)防MDS 患者異基因造血干細(xì)胞移植治療后復(fù)發(fā)和降低化療耐受性具有一定的有效性[8]。這表明DAC聯(lián)合VCX 對(duì)MDS 的治療可能具有較大應(yīng)用潛力。因此本研究通過(guò)體外培養(yǎng)MDS 細(xì)胞系探討了DAC聯(lián)合VCX 對(duì)MDS 化療敏感性的影響及潛在可能機(jī)制，以期為改善MDS 的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 人MDS 細(xì)胞系SKM-1 細(xì)胞和MUTZ-1 細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），采用含10%（v/v）FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃，5%（v/v）CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；VCX 和DAC(西安楊森制藥有限公司)；CCK-8 試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Annexin V-FITC/ PI 試劑盒（美國(guó)eBioscience 公司）；JC-1 試劑盒（美國(guó)SAB 公司）；H2DCF-DA試劑盒（美國(guó)MedChemExpress 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）；Laemmli 上樣緩沖液（美國(guó)Bio-Rad 公司）；小鼠抗Bcl-1，cleaved Caspase-3，P62（美國(guó)Cell Signal Technology 公司）；兔抗LC3B，Bax，Beclin 1，cytochrome C 和β-actin（美國(guó)Santa Cruz 公司）；大鼠抗小鼠或山羊抗兔二抗（美國(guó)Abacm 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；LightCycler480II 型RT-PCR 儀（瑞士Roche 公司）；800TS 型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8 法檢測(cè)MDS 細(xì)胞增殖活性：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SKM-1 和MUTZ-1 細(xì)胞，按每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板，用稀釋后不同濃度的VCX（0，0.1，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0 μmol/L）處理SKM-1 或MUTZ-1 細(xì)胞24h，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育2h；采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定各孔的吸光度值（A值）。將0 μmol/L 的VCX 設(shè)為0 加藥組，并設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)液孔為空白組。計(jì)算各組細(xì)胞增殖活性，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制曲線，分析VCX 對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。細(xì)胞增殖活性=（A加藥-A空白）/（A0加藥-A空白）×100%。IC50值即與對(duì)照組A值減少一半所需的VCX 濃度。每組每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.2 細(xì)胞處理和分組：根據(jù)上述“CCK-8 法檢測(cè)MDS 細(xì)胞增殖活性”的檢測(cè)結(jié)果，使用8 μmol/L的VCX 分別處理MUTZ-1 細(xì)胞；按細(xì)胞處理方式的不同將MUTZ-1 分為4 組：無(wú)任何藥物處理的對(duì)照組、VCX 組、DAC 組（參考文獻(xiàn)[9-10]方法使用5 μmol/L 的DAC 處理）和VCX+DAC 組（使用VCX 和DAC 聯(lián)合處理細(xì)胞）。將各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI 法檢測(cè)MDS 細(xì)胞凋亡率：取各組待測(cè)MUTZ-1 細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒使用說(shuō)明書加入Annexin V-FITC 和PI 試劑，37 ℃下避光孵育15～ 20 min，上機(jī)分析。其中Annexin V-FITC 陽(yáng)性，PI 陰性為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC 和PI 雙陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞，兩者之和為總凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.4 JC-1 染色法檢測(cè)MDS 細(xì)胞線粒體膜電位：取各組待測(cè)MUTZ-1 細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后加入JC-1 熒光染料，37℃避光孵育30 min，PBS 溶液再次洗滌后上機(jī)進(jìn)行分析。JC-1 熒光染色后細(xì)胞通常發(fā)出紅色熒光，但當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)JC-1 則變?yōu)榫G色熒光，通過(guò)計(jì)算綠色熒光比值可分析細(xì)胞的線粒體膜電位改變。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.5 H2DCF-DA 熒光探針法檢測(cè)MDS 細(xì)胞中ROS含量：按前述方法收集各組細(xì)胞，800 g 離心5 min，取細(xì)胞沉淀，加入H2DCF-DA 試劑重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育30 min，PBS 溶液再次洗滌細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS 含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.6 Western blotting 檢測(cè)MDS 細(xì)胞中凋亡與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)：取各組待測(cè)MUTZ-1 細(xì)胞，用預(yù)冷RIPA 細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑在冰上提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；取40 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，分別加入Bcl-1(1∶800)，Bax(1∶800)，cleaved Caspase-3（1∶1 000），cytochrome C（1∶1 000），LC3B（1∶1 000），Beclin 1(1∶800)，P62(1∶800)和β-actin（1∶2000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入抗小鼠或抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影。采用Image J 軟件評(píng)估蛋白條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，通過(guò)計(jì)算目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 和 GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VCX 對(duì)MDS 細(xì)胞增殖的影響 見表1。CCK-8 法檢測(cè)顯示，隨VCX 濃度升高，SKM-1 細(xì)胞和MUTZ-1細(xì)胞增殖活性均明顯降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。VCX 對(duì)SKM-1 細(xì)胞的IC50值為10.14±3.26 μmol/L，對(duì)MUTZ-1 細(xì)胞的IC50值為8.09±2.73 μmol/L。選擇對(duì)VCX 更為敏感的MUTZ-1 細(xì)胞，并使用8 μmol/L 的VCX 分別處理MUTZ-1 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同濃度VCX 對(duì)MDS 細(xì)胞增殖活性的影響 ［（±s）%］

表1 不同濃度VCX 對(duì)MDS 細(xì)胞增殖活性的影響 ［（±s）%］

注：與空白組比較，*tSKM-1=2.139,5.286,11.268,14.391,21.589,31.308,37.912,tMUTI-1=2.844,5.854,10.474,15.336,20.351,29.909,38.076,均P＜0.05。

VCX(μmol/L)細(xì)胞空白組F 值P 值0.11.02.55.010.025.050.0 SKM-198.23±7.11 92.97±3.18 85.23±1.90* 70.52±1.58* 62.84±2.07* 45.14±1.08* 21.24±0.58* 5.00±0.09* 17.29223.770 MUTZ-1101.05±6.92 94.00±2.43 86.54±3.21* 75.09±2.39* 63.04±1.18* 50.61±1.27* 26.92±0.94* 6.18±0.15*0.0030.001

2.2 各組MDS 細(xì)胞凋亡率與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 見表2。Annexin V-FITC/PI 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，與對(duì)照組比較，VCX 組、DAC 組和VCX+DAC 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（t=3.604,3.086,5.259,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.518,P＞0.05），VCX+DAC 組凋亡率則明顯升高（t=2.473,P＜0.05）。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，VCX 組，DAC 組和VCX+DAC 組細(xì)胞中促凋亡蛋白cytochrome C，cleaved Caspase-3 表達(dá)水平均明顯升高（t=11.637,10.755,39.319; 13.023,8.864,30.314,均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值明顯降低（t=14.893,13.352,22.596,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細(xì)胞中cytochrome C，cleaved Caspase-3 表達(dá)和Bcl-2/Bax比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.882,4.159,1.541,均P＞0.05）；而VCX+DAC 組細(xì)胞中cytochrome C，cleaved Caspase-3 表達(dá)水平均明顯升高（t=28.564,17.291,均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值則明顯降低（t=9.244,P＜0.05）。

表2 各組MDS 細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）

表2 各組MDS 細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）

項(xiàng) 目對(duì)照組VCX 組DAC 組VCX+DAC 組F 值P 值凋亡率(%)4.28±1.6613.75±3.0212.39±4.1618.10±3.5045.7820.014 Bcl-2/Bax1.01±0.040.43±0.050.49±0.070.13±0.01248.0350.047 cleaved Caspase-31.04±0.022.23±0.101.85±0.063.81±0.19282.0690.022 cytochrome C1.01±0.021.67±0.051.62±0.083.24±0.10116.3840.025

2.3 各組MDS 細(xì)胞線粒體膜電位與細(xì)胞中ROS 表達(dá) 見表3。JC-1 法檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，VCX 組，DAC 組和VCX+DAC 組細(xì)胞線粒體膜電位均明顯降低（t=4.269,4.089,8.710,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細(xì)胞線粒體膜電位雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.179,P＞0.05），而VCX+DAC 組細(xì)胞的線粒體膜電位明顯降低（t=4.621,P＜0.05）。H2DCF-DA 熒光探針法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，VCX 組、DAC 組和VCX+DAC 組細(xì)胞中ROS 含量明顯升高（t=3.686,3.109,12.428,均P＜0.05）；與DAC組比較，VCX 組細(xì)胞中ROS 含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.577,P＞0.05），而VCX+DAC 組細(xì)胞中ROS 含量明顯升高t=9.319,P＜0.05）。

表3 各組MDS 細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞中ROS 含量［（±s）%］

表3 各組MDS 細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞中ROS 含量［（±s）%］

項(xiàng) 目對(duì)照組VCX 組DAC 組VCX+DAC 組F 值P 值JC-1 染色2.05±0.348.72±1.26*8.44±2.13*15.66±2.90*#66.7820.041 ROS 含量8.78±1.3714.02±1.45*13.20±2.41*26.45±1.53*#69.0710.046

2.4 各組MDS 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 見表4。Western blotting 檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，VCX組、DAC 組和VCX+DAC 組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1 表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，而P62 蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（t=4.481,4.874,20.988; 9.818,8.886,15.907;4.696,4.905,9.183,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細(xì)胞中Beclin1，P62 蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.393,0.932,0.209,均P＞0.05），而VCX+DAC 組細(xì)胞中Beclin1 表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，P62 蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.115,7.021,4.278,均P＜0.05）。

表4 各組MDS 細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）

表4 各組MDS 細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）

項(xiàng) 目對(duì)照組VCX 組DAC 組VCX+DAC 組F 值P 值Beclin11.05±0.041.62±0.151.67±0.173.72±0.21118.2570.017 P621.01±0.070.56±0.150.54±0.140.13±0.09236.920.007 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.02±0.082.60±0.192.45±0.203.58±0.27209.4220.009

3 討論

Bcl-2 家族蛋白作為一類膜整合蛋白，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的完整性和凋亡因子的釋放來(lái)調(diào)控細(xì)胞的存亡[11]。研究表明，Bcl-2 家族抗凋亡蛋白的過(guò)度表達(dá)與血液系統(tǒng)惡性疾病發(fā)生和耐藥性的形成密切相關(guān)，而VCX 是一種高效、選擇性的Bcl-2 抑制劑，其能與Bcl-2 直接結(jié)合，改變線粒體外膜的通透性，活化凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。目前，VCX 在我國(guó)主要與HAMs 類藥物聯(lián)合應(yīng)用于治療高齡難治性急性髓系白血病患者[12]。然而臨床研究發(fā)現(xiàn)，VCX 聯(lián)合HAMs 對(duì)MDS 治療同樣有效[7-8]。因而本研究通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了應(yīng)用VCX 對(duì)MDS 細(xì)胞DAC 化療敏感性的影響及機(jī)制。

研究表明，Bcl-2在MDS高危組中表達(dá)水平明顯高于低危組，且在急性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)水平最高，推測(cè)應(yīng)與Bcl-2 蛋白在不成熟造血細(xì)胞中堆積相關(guān)，增加MDS 向惡性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[11]。而本研究表明，VCX 對(duì)MDS 細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴性抑制能力，可能與Bcl-2 在MDS 中的過(guò)度表達(dá)相關(guān)。為明確VCX 與DAC 的應(yīng)用對(duì)MDS 細(xì)胞的凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，VCX 與DAC 聯(lián)合應(yīng)用明顯提高M(jìn)DS 細(xì)胞的凋亡率，增加細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白cytochrome C，cleaved Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2/Bax 比值。眾所周知，線粒體損傷被認(rèn)為是化療敏感性機(jī)制中的一個(gè)重要因素，線粒體膜電位的喪失會(huì)增加線粒體膜通透性，調(diào)節(jié)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑[13]。Bax 作為Bcl-2 家族中的重要蛋白，主要通過(guò)與Bcl-2 形成異二聚體促進(jìn)線粒體外膜的通透性，發(fā)揮促凋亡作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2/Bax 比值可直接決定細(xì)胞是否走向凋亡[15]。此外，DAC 還可直接通過(guò)引起線粒體跨膜電位的丟失，進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑[15]。本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位來(lái)觀察線粒體損傷程度，結(jié)果表明，VCX 與DAC 共處理組細(xì)胞線粒體膜電位喪失較兩藥物單獨(dú)處理組明顯增高。

ROS 的產(chǎn)生和積累可導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞凋亡[16]。包括HMAS 在內(nèi)的多種化療藥物在誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生的過(guò)程中會(huì)激活抗氧化通路，誘導(dǎo)抗氧化酶的生成，中和ROS，削弱化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。但有數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合應(yīng)用VCX 與DAC 可減少抗氧化酶的產(chǎn)生[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示VCX與DAC 共處理組ROS 產(chǎn)生明顯增多。此外，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是化療藥物介導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)死亡的關(guān)鍵途徑[18]。研究報(bào)道，自噬途徑的關(guān)鍵啟動(dòng)因子Beclin1 具有Bcl-2 同源結(jié)構(gòu)域BH3。Bcl-2 蛋白與Beclin1 的BH3 結(jié)構(gòu)域的相互作用，阻止了自噬體結(jié)構(gòu)的組裝，導(dǎo)致細(xì)胞的自噬進(jìn)程被抑制[19]。微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(LC3)是自噬發(fā)生的常用指標(biāo)，自噬過(guò)程中，胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ與親脂性磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)換為自噬囊泡相關(guān)形式的LC3-Ⅱ。而P62 是LC3 的選擇性底物之一，P62 直接與LC3 結(jié)合，促進(jìn)泛素化蛋白聚集物降解。由于自噬被激活時(shí)，LC3-II 積累，而P62 減少，因此LC3-II/LC3-Ⅰ和P62 常被用作研究自噬的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VCX 與DAC 共處理組細(xì)胞自噬水平、Beclin1 蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，P62 蛋白則顯著降低。這提示VCX 與MDS 的聯(lián)合可能通過(guò)上調(diào)MDS 細(xì)胞的自噬水平參與細(xì)胞的凋亡。然本研究是基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究分析，VCX 增強(qiáng)MDS 對(duì)DAC 化療敏感性的機(jī)制還需通過(guò)裸鼠成瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究分析。

綜上所述，VCX 可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬和氧化應(yīng)激來(lái)促進(jìn)MDS 細(xì)胞對(duì)DAC 的化療敏感性。VCX 與MDS 的聯(lián)合使用可能成為有效的MDS 治療策略的潛在候選方案，值得臨床進(jìn)一步探究。