劉 慧，鐘嬌影，劉 杰，陳秀娟（河北以嶺醫(yī)院腎病科，石家莊 050000）

糖尿病腎病（diabetes nephropathy，DN）是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）常見(jiàn)并發(fā)癥，具有高發(fā)病率和死亡率[1-2]。尿蛋白是腎功能生物標(biāo)志物之一，可反映腎小球損傷及其對(duì)大分子的通透性增加，但其變異性大、敏感度低[3]。因此臨床急需有效的輔助檢測(cè)指標(biāo)，以提高預(yù)后不良DN 高?；颊叩臋z出率。LI 等[4]研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)和文獻(xiàn)篩選，確定長(zhǎng)鏈非編碼RNA 核富集轉(zhuǎn)錄體1（long noncoding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1，LncRNA NEAT1）參與的LncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)與早期DN疾病進(jìn)展有關(guān)。微小RNA（microRNA，miR）-495-3p 靶向調(diào)控核孔蛋白160 可參與DN 的足細(xì)胞損傷[5]。miR-495-3p 與LncRNA NEAT1 間存在靶向關(guān)系，但二者在DN 預(yù)后中的作用仍不明確。因此，本研究旨在探討血清miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 水平在DN 患者預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入河北以嶺醫(yī)院2019年1月～2021年1月收治的116 例DN 患者作為DN組（均為T2DM 患者），其中男性60 例，女性56例；平均年齡59.84±11.35 歲；＜60 歲67 例，≥60 歲49 例。另收集同期單純T2DM 患者102 例作為T2DM 組，男性54 例，女性48 例，平均年齡59.76±11.15 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①DN 診斷符合《糖尿病腎病診治專家共識(shí)》[6]，T2DM 診斷符合《糖尿病分型診斷中國(guó)專家共識(shí)》[7]；②臨床資料完整且能配合隨訪；③年齡＞18 周歲，本人自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)尿路感染、急慢性腎小球腎炎或其他腎病者；②并發(fā)甲狀腺疾病、酮癥酸中毒或其他代謝疾病者；③既往有腎毒性藥物及免疫抑制劑服用史者；④孕婦、哺乳期婦女或有精神障礙性疾病者。同期健康體檢者100 例作為對(duì)照組，男性58 例，女性42 例，平均年齡59.94±10.27 歲。對(duì)照組、T2DM 組和DN 組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F/χ2=0.007，0.931，P=0.993，0.628）。研究獲取醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均提供知情同意書。

1.2 儀器與試劑 RNA 提取試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司，貨號(hào)：K1101）；第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：ZR102）；SYBR Green Master Mix（美國(guó)ABI 公司，貨號(hào)：4367659）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：采集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血樣10 ml，室溫靜置1 h，4℃，3 000 r/min 離心15 min，取血清，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)血清miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 相對(duì)表達(dá)水平：依照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，采用Nanodrop 2000c 超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度，A260nm/A280nm比值為1.8～2.1 則樣本合格，第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系：上下游引物各0.8μl，cDNA 2μl，SYBR Green Master Mix 10μl，ddH2O 補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 5 min；95℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 相對(duì)表達(dá)量，引物由上?？泼羯锟萍加邢薰竞铣?，序列：miR-495-3p 上游5’- CGTCCTGACATGATGC ATGAC-3’，下游5’- TCAGGCTCGCACTAAGCGT CG -3’；U6 上游5’- GCGAGCCTCATGAGGAGCG C -3’，下游5’- CAGTAGACGTGAGCTGTCACAC-3’；LncRNA NEAT1 上游5’- CGATACAGCAATGAC ATCCGA-3’，下游5’- ATGCAGCATCGCCCACTG GAGA-3’；GAPDH上游5’- CTGTACAGCCGCTTAA GCACG -3’，下游5’- CGTGACGCCTACGTACCGT AC -3’。

1.3.3 分組及隨訪：根據(jù)腎臟病理?yè)p傷程度（腎小球分級(jí)）分為I 級(jí)組32 例，II 級(jí)組36 例，III 級(jí)組25 例，IV 級(jí)組23 例。采用電話隨訪及門診復(fù)查治療的隨訪方式，隨訪終點(diǎn)為2021年7月，記錄其估算腎小球?yàn)V過(guò)率（estimate glomerular filtration rate，eGFR）（終末期腎病標(biāo)準(zhǔn)eGFR＜15 ml/min/1.73 m2），根據(jù)治療后6 個(gè)月隨訪期間是否發(fā)展為終末期腎病分為預(yù)后良好組(n=76)和預(yù)后不良組(n=40)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS 25.0 進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量資料，計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic,ROC）曲線分析血清miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 水平對(duì)DN 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平比較 對(duì)照組、T2DM 組和DN 組血清miR-495-3p水平（1.02±0.25，0.76±0.22，0.58±0.16）依次降低，而LncRNA NEAT1 水平（1.01±0.23，1.58±0.29，2.16±0.36）依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=117.238，391.506，均P＜0.05）。T2DM組、DN 組與對(duì)照組比較（t=12.385,21.615,18.999,38.529,均P＜0.05）；DN組與T2DM組比較（t=8.889,20.042,均P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 血清miR 495 3p，LncRNA NEAT1 水平與DN 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。T2DM 病程≥10年，eGFR ≥60 ml/min/1.73 m2，F(xiàn)BG ≥8mmol/L，24 h 尿蛋白≥3 g/24 h 的血清miR-495-3p 水平低于對(duì)應(yīng)項(xiàng)，LncRNA NEAT1 水平高于對(duì)應(yīng)項(xiàng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平與DN 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±）

2.3 不同腎臟病理?yè)p傷程度DN 患者血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平比較 I 級(jí)組、II 級(jí)組、III級(jí)組和IV級(jí)組血清miR-495-3p水平（0.74±0.19，0.61±0.16，0.50±0.08，0.39±0.06）依次降低，LncRNA NEAT1水平（1.69±0.30，2.08±0.32，2.34±0.35，2.74±0.39）依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.586,46.729,均P＜0.05）。II 級(jí)組、III 級(jí)組、IV 級(jí)組與I 級(jí)組比較（t=5.341,8.975,12.781,6.725,10.243,16.157,均P＜0.05）；III 級(jí)組，IV 級(jí)組與II 級(jí)組比較（t=4.218,8.227,4.201,10.400,均P＜0.05）；IV 級(jí)組與III 級(jí)組比較（t=3.801,5.823,均P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 不同預(yù)后DN 患者血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平比較 預(yù)后不良組血清miR-495-3p 水平（0.45±0.10）低于預(yù)后良好組（0.65±0.17），LncRNA NEAT1 水平（2.53±0.47）高于預(yù)后良好組（1.97±0.36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.836,7.148，均P＜0.05）。

2.5 血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平對(duì)DN患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制ROC 曲線分析miR-495-3p 和LncRNA NEAT1 的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)DN 患者預(yù)后不良的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.784（95%CI: 0.702～0.867），0.753（95%CI: 0.658～0.848）和0.834（95%CI: 0.755～0.912），特異度分別為71.1%，86.8%和77.6%，敏感度分別為62.5%，57.5%和77.5%。miR-495-3p，LncRNA NEAT1 預(yù)測(cè)截?cái)嘀捣謩e為0.51，2.34。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 水平預(yù)測(cè)DN患者預(yù)后的ROC 曲線

3 討論

T2DM 是由于胰島素作用缺陷、胰島素分泌缺陷或兩者兼而有之而導(dǎo)致高血糖[8]。T2DM 的微血管并發(fā)癥會(huì)導(dǎo)致DN，其通常與血壓升高相關(guān)，若不及時(shí)治療會(huì)導(dǎo)致終末期腎病[9-10]。生物標(biāo)記物的早期檢測(cè)對(duì)DN 早期診斷、早期治療有重要意義。

LncRNA NEAT1 可促進(jìn)DN 疾病中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且在DN 患者血清和尿液中過(guò)度表達(dá)[11]。本研究LncRNA NEAT1 表達(dá)趨勢(shì)與上述研究一致。提示LncRNA NEAT1 表達(dá)升高可能參與DN 疾病進(jìn)展。WU 等[12]研究指出LncRNA NEAT1 高表達(dá)與DN 小鼠腎小球系膜細(xì)胞SV40 MES13 的增殖、氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化有關(guān)。據(jù)此推測(cè)LncRNA NEAT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎小球細(xì)胞的增殖、氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化等一系列生物進(jìn)展，參與DN 的發(fā)生發(fā)展。miRNA 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，一個(gè)miRNA 可由多個(gè)LncRNA 調(diào)節(jié)，且一個(gè)miRNA 可調(diào)控多個(gè)靶基因和多個(gè)生物途徑[13]。研究顯示，miR-495-3p 可靶向調(diào)控CRBN 或TRAF6，參與脂多糖誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞損傷[14-15]。SHAN 等[16]研究表明，LncRNA MEG8 通過(guò)海綿miR-495-3p 促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)，加重透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的致瘤性。本研究結(jié)果中DN 患者miR-495-3p 表達(dá)趨勢(shì)與FAN 等[17]研究結(jié)果一致。基于既往研究推測(cè)miR-495-3p 低表達(dá)可能影響細(xì)胞活力、凋亡及炎癥等過(guò)程，參與人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而推動(dòng)DN 疾病進(jìn)展。

既往研究顯示，LncRNA 可通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA合成、翻譯以及干擾轉(zhuǎn)錄因子作用，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用[18]。GONG 等[19]研究表明，LncRNA NEAT1 下調(diào)可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-330-5p/FOXO3 途徑改善脂多糖誘導(dǎo)的腎細(xì)胞損傷。據(jù)此推測(cè)LncRNA NEAT1 可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控miR-495-3p 表達(dá)，二者通過(guò)負(fù)調(diào)控作用共同影響DN 疾病進(jìn)展。進(jìn)一步分析認(rèn)為病理作用下LncRNA NEAT1 表達(dá)升高，通過(guò)負(fù)調(diào)控降低miR-495-3p 表達(dá)，miR-495-3p 低表達(dá)后影響腎小球細(xì)胞活力及凋亡，推動(dòng)DN 進(jìn)展。血清miR-495-3p，LncRNA NEAT1 與DN 患者多個(gè)臨床參數(shù)均有關(guān)。提示miR-495-3p，LncRNA NEAT1 可反映DN 疾病進(jìn)展及嚴(yán)重程度，二者表達(dá)異常可能與腎小球受損有關(guān)。然而miR-495-3p，LncRNA NEAT1 參與DN疾病進(jìn)展的具體作用機(jī)制仍待今后基礎(chǔ)研究證實(shí)。

研究顯示，腎臟損傷程度是DN 患者預(yù)后不良的重要因素，腎小球發(fā)生間質(zhì)性損傷時(shí)可造成其濾過(guò)壓加重，腎小球上皮進(jìn)一步受損，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果中miR-495-3p 水平降低，LncRNA NEAT1 水平升高與腎臟病理?yè)p傷加重及預(yù)后不良有關(guān)。提示miR-495-3p，LncRNA NEAT1水平與DN 疾病進(jìn)展及腎功能損傷程度有密切聯(lián)系，可作為預(yù)測(cè)腎臟病理?yè)p傷程度的重要指標(biāo)。此外miR-495-3p，LncRNA NEAT1 表達(dá)異?？赡苡幸欢I臟毒性，加重腎小球損傷并參與終末期腎病發(fā)生。且ROC 曲線結(jié)果進(jìn)一步表明二者聯(lián)合檢測(cè)水平更能為臨床DN 預(yù)后提供可靠的信息，值得臨床醫(yī)師借鑒，當(dāng)miR-495-3p 水平低于0.51，LncRNA NEAT1 水平高于2.34 時(shí)，發(fā)生不良結(jié)局的可能性更大。

綜上，DN 患者血清miR-495-3p 低表達(dá)，LncRNA NEAT1高表達(dá)可能與DN的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，二者有望成為DN 預(yù)后預(yù)測(cè)的生物指標(biāo)。今后將進(jìn)一步探索DN 發(fā)病機(jī)制，為治療DN 提供新的靶基因。本研究的局限性在于：臨床中DN 的影響因素眾多，本研究未能納入多個(gè)因素綜合分析；miR-495-3p，LncRNA NEAT1 的預(yù)后評(píng)估效能仍需進(jìn)一步優(yōu)化。