裴徐梨 焦鵬 荊贊革 杞如春 王定康 唐征

摘 要 長(zhǎng)鏈非編碼RNA在植物抵御逆境脅迫中起著重要作用。適宜的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其表達(dá)水平的基礎(chǔ)。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)16個(gè)青花菜LncRNAs表達(dá)水平，并通過(guò)geNorm、NormFinder、BestKeerper軟件進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明：青花菜的16個(gè)LncRNAs在不同逆境脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性存在差異。其中在弱光脅迫條件下，? XLOC_000400表達(dá)最穩(wěn)定；在低溫脅迫條件下? XLOC_030832基因穩(wěn)定性最好；在干旱和漬水脅迫條件下最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因分別是? XLOC_007087和? XLOC_012179；高溫和鹽脅迫處理下最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因均為? XLOC_007980。? XLOC_010342和? XLOC_007980在青花菜不同逆境脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性較好。研究結(jié)果可為準(zhǔn)確定量青花菜不同逆境脅迫下的LncRNAs提供合適的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞 青花菜；內(nèi)參基因；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；非生物脅迫

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA，LncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200 bp的內(nèi)源RNA，可參與植物成花轉(zhuǎn)變、花粉發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程。扎桑等[1]在對(duì)2個(gè)青稞品種進(jìn)行鹽堿脅迫過(guò)程中獲得了6 704條LncRNAs，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同階段的鹽堿脅迫中有不同的lncRNAs參與脅迫應(yīng)答；許欣[2]在鹽脅迫剛毛檉柳LncRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析后，發(fā)現(xiàn)在脅迫過(guò)程中l(wèi)ncRNA對(duì)差異表達(dá)基因的調(diào)控起重要作用；分析黃瓜響應(yīng)高溫脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)響應(yīng)脅迫[3]；除此之外，在新疆楊中鑒定了10 531個(gè)lncRNA，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下有60%的lncRNA參與了脅迫應(yīng)答的過(guò)程[4]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是基因表達(dá)分析研究中應(yīng)用最為廣泛的方法之一。然而qRT-PCR的使用還存在一些問(wèn)題，如在基因表達(dá)相對(duì)定量時(shí)，需要有適宜的內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量目標(biāo)基因的表達(dá)水平，從而確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性在不同品種、不同逆境脅迫或是不同組織器官中表達(dá)的穩(wěn)定性不盡相同。再加上同mRNA相比較，LncRNAs表達(dá)量更低，因此選擇編碼蛋白的基因作為內(nèi)參來(lái)研究LncRNA的表達(dá)量，就不一定能很準(zhǔn)確地反映其表達(dá)水平的高低。試驗(yàn)前期課題組對(duì)青花菜高溫和鹽脅迫LncRNAs進(jìn)行了高通量測(cè)序，基于FPKM法計(jì)算的表達(dá)水平，從中篩選出多個(gè)表達(dá)較穩(wěn)定的LncRNAs作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)并運(yùn)用geNorm、Normfinder和BestKeeper軟件對(duì)青花菜不同非生物脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。通過(guò)綜合分析得到適宜的內(nèi)參基因，研究結(jié)果可為青花菜不同非生物脅迫下LncRNAs的表達(dá)計(jì)算提供適宜的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和脅迫處理

以青花菜自交系“KU19-3”為材料，放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，光照周期為16 h/8 h。五葉期時(shí)進(jìn)行非生物脅迫處理。脅迫處理如下：高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）、干旱（PEG 10%）、漬水（淹水高于基質(zhì)表面）、弱光（30％光照度）、鹽脅迫（100 mmol/L NaCl灌根），分別在處理后0、3、12和24 h取樣。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

提取的葉片總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，而后采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)筆者課題組高溫和鹽脅迫LncRNA的測(cè)序結(jié)果（相關(guān)結(jié)果已發(fā)表在西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)）篩選出16個(gè)表達(dá)較穩(wěn)定的LncRNA，設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1）。

1.4 熒光定量PCR和表達(dá)穩(wěn)定性分析

qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司）在ABI 7500（Applied Biosystems公司）上運(yùn)行。反應(yīng)體系和參數(shù)參照裴徐梨[5]的方法。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對(duì)候選LncRNA的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LncRNA候選內(nèi)參基因擴(kuò)增特異性分析

對(duì)候選LncRNA內(nèi)參基因進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果顯示為單一峰（圖1）。表明設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增特異性好。

2.2 LncRNA候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.2.1 geNorm穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 從圖2可以看出，高溫脅迫下，? XLOC_000400和? XLOC_008536的M 值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最好；低溫脅迫下，? XLOC_007980和? XLOC_008536表達(dá)穩(wěn)定性最好；在鹽脅迫下，? XLOC_000108和? XLOC_000400表達(dá)穩(wěn)定性最好；在漬水脅迫下，? XLOC_007087和? XLOC_012179表達(dá)穩(wěn)定性最好；干旱和弱光脅迫下均是? XLOC_007980和? XLOC_034687表達(dá)穩(wěn)定性最好。而? XLOC_034059的M值在6種非生物脅迫中均較大，表現(xiàn)最不穩(wěn)定。

2.2.2 NormFinder穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 由NormFinder軟件評(píng)價(jià)結(jié)果可知，高溫脅迫下? XLOC_007980和? XLOC_012179穩(wěn)定值均為0.064，穩(wěn)定性最好；低溫脅迫下? XLOC_010342和? XLOC_025578穩(wěn)定值（0.038）最??；干旱脅迫下? XLOC_021473和? XLOC_029328穩(wěn)定值均為0.013，穩(wěn)定性最好；漬水脅迫下? XLOC_012179和? XLOC_021473的表達(dá)最穩(wěn)定，穩(wěn)定值均為0.060；在弱光和鹽脅迫下，表達(dá)最穩(wěn)定的是? XLOC_000400，穩(wěn)定值分別為0.047和0.049。? XLOC_034059的穩(wěn)定值在6種脅迫下均最高，穩(wěn)定性差（表2）。

2.2.3 BestKeeper穩(wěn)定性評(píng)價(jià) BestKeeper軟件評(píng)價(jià)結(jié)果表明，高溫脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的是? XLOC_037050，其SD值為0.15；低溫脅迫下? XLOC_012179 SD值為0.23，表達(dá)最穩(wěn)定。? XLOC_034059在這兩種脅迫下SD值最大，穩(wěn)定性最差。漬水和鹽脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的分別是? XLOC_012179（SD=0.46）和? XLOC_007980?（SD=0.16），最不穩(wěn)定的均為? XLOC_039609；弱光脅迫下? XLOC_010342表達(dá)最穩(wěn)定，SD值為0.13，? XLOC_007980（SD=0.68）表達(dá)最不穩(wěn)定；干旱脅迫下? XLOC_015579（SD=0.15）表達(dá)最穩(wěn)定，? XLOC_030832表達(dá)最不穩(wěn)定，SD值高達(dá)1（表3）。

2.2.4 LncRNA候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合評(píng)價(jià) 通過(guò)geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件獲得的最適內(nèi)參基因有所差異，因此將數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果顯示，在弱光脅迫條件下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)? XLOC_000400；在低溫脅迫條件下? XLOC_030832基因穩(wěn)定性最好；在干旱脅迫和漬水脅迫條件下最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因分別是? XLOC_007087和? XLOC_012179；高溫和鹽脅迫處理下最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因均為? XLOC_007980。綜上所述，? XLOC_010342和? XLOC_007980為青花菜不同逆境脅迫下的LncRNAs準(zhǔn)確定量的最適宜內(nèi)參基因（表4）。

3 討? 論

植物內(nèi)參基因通用性不是特別高。同一內(nèi)參基因在不同的生長(zhǎng)階段、不同組織細(xì)胞、不同環(huán)境以及不同脅迫下，其穩(wěn)定性也會(huì)有所不同。如內(nèi)參基因 UBC18、 ACT2-1和 EF1a在毛竹實(shí)生苗中表達(dá)性較好，但在開(kāi)花竹中穩(wěn)定性較差[6]。在非生物脅迫下的番茄植株根和葉中，Actin表達(dá)穩(wěn)定，莖中SAND基因表達(dá)穩(wěn)定[7]。本研究對(duì)青花菜中多個(gè)LncRNA在非生物脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)? XLOC_000400弱光脅迫下表達(dá)穩(wěn)定，而在漬水脅迫下其穩(wěn)定性卻較差；? XLOC_007980也存在類似的現(xiàn)象，其在鹽脅迫下表達(dá)穩(wěn)定，而在漬水脅迫下表達(dá)最不穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，在篩選青花菜LncRNA內(nèi)參基因時(shí)，其穩(wěn)定性也表現(xiàn)出此現(xiàn)象。

內(nèi)參基因在不同的試驗(yàn)條件或不同逆境處理下的表達(dá)是不恒定的[8]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結(jié)果有較大差異，但也有共同點(diǎn)：? XLOC_034059在所有環(huán)境脅迫中都表現(xiàn)極不穩(wěn)定，? XLOC_000108和? XLOC_039609在高溫、干旱和鹽脅迫下表現(xiàn)極不穩(wěn)定。這些研究結(jié)果表明候選的青花菜LncRNAs在不同試驗(yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性存在差異，所以針對(duì)不同非生物脅迫處理需選擇適宜的內(nèi)參基因。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 扎 桑，王玉林，原紅軍，等.鹽堿脅迫下青稞全轉(zhuǎn)錄組分析［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，34（7）：1375-1385.

ZHA S，WANG Y L，YUAN H J，et al.Transcriptome?analysis of tibetan hulless barley under salt-alkali stress ［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2021，34（7）：1375-1385.

［2］ 許 欣.剛毛檉柳鹽脅迫響應(yīng)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的鑒定及耐鹽功能分析［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2021.

XU X.Identification and Functional?analysis of long noncoding RNA on salt tolerance of Tamaris hispida［D］.Harbin：Northeast Forestry University，2021.

［3］ 賀學(xué)英.黃瓜熱脅迫響應(yīng)lncRNAs、circRNAs和miRNAs的鑒定及ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

HE X Y.Identification of heat-stress responsive lncRNAs，circRNAs and miRNAs and construction of ceRNA network in cucumber［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2019.

［4］ 馬建超.新疆楊基因組及其lncRNA響應(yīng)鹽脅迫的研究［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2018.

MA J CH.Genome sequence of a widely cultivated poplar and its lncRNA response to salt stress［D］.Lanzhou：Lanzhou University，2018.

［5］ 裴徐梨 ，荊贊革，唐 征，等.青花菜花蕾發(fā)育miRNA熒光定量?jī)?nèi)參基因的篩選［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2021（2）：1-11.

PEI X L，JING Z G，TANG ZH，et al.Selection of miRNA reference genes for quantitative RT-PCR in developmental bud of broccoli ［J］.Genomics and Applied Biology，2021（2）：1-11.

［6］ 齊飛艷，胡 陶，彭鎮(zhèn)華，等.毛竹實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選及成花基因? PheTFL1表達(dá)分析［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（1）：48-52.

QI F Y，HU T，PENG ZH H，et al.Screening the reference genes for the studies of quantitative real-timeRT-PCR in tomato under abiotic stress［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2013，33（1）：48-52.

［7］ 韓曉雪，韓佳軒，姜 晶.番茄在非生物脅迫下實(shí)時(shí)定量RT-PCR中內(nèi)參基因的篩選［J］.分子植物育種，2015，13（4）：822-831.

HAN X X，HAN J X，JIANG J.Screening the reference genes for the studies of quantitative real-time RT-PCR in tomato under abiotic Stress ［J］.Molecular Plant Breeding，2015，13（4）：822-831.

［8］ REMANS T，SMEETS K，OPDENAKKER K.Normalisation of Real- time RT-PCR gene expression measurements in Arabidopsis thaliana exposed to increased me tal concentrations［J］.Planta，2008，227（6）：1343-1349.

Abstract Long non-coding RNAs（LncRNAs） plays important role in plant resistance to stress.Appropriate reference genes are the basis to accurately evaluate their expression levels.In this study， real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to detect the expression levels of 16 LncRNAs in broccoli， and their expression stability was analyzed by geNorm， NormFinder， and BestKeerper software.The results showed that 16 LncRNAs revealed diverse expression stability under different stresses in broccoli.Among them，? ?XLOC_000400 was the most stable under low light stress;? ?XLOC_030832 had the best stability under low temperature stress; the most stable reference genes under drought and waterlogging stress were? ?XLOC_007087 and? ?XLOC_012179， respectively; under high temperature and salt stress， the most stably reference gene was? ?XLOC_007980.In conclusion，? ?XLOC_010342 and? ?XLOC_007980 have good expression stability under different stresses in broccoli.This study provides suitable reference genes for further research on the expression of LncRNAs under abiotic stresses in broccoli.

Key words Broccoli; Reference gene; Long non-coding RNA; Abiotic stress