裴徐梨,荊贊革,2,施俊宏 ,胡文婷,唐 征,焦 鵬

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650214;2.溫州科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 溫州 325006)

0 引言

【研究意義】Whirly(WHY)基因家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,其家族成員可參與植物多種生命進(jìn)程的調(diào)控[1]。首個被鑒定的Whirly家族成員為馬鈴薯StWHY1,其與誘導(dǎo)應(yīng)答元件ERE相結(jié)合,從而調(diào)節(jié)抗病基因的表達(dá)[2]。青花菜屬于十字花科蕓薹屬植物,營養(yǎng)成分齊全,并含有抗癌物質(zhì)葡糖異硫氰酸鹽,具有特殊的保健作用。因此,研究青花菜WHY基因有助于探討其在逆境脅迫下的應(yīng)答機(jī)制,對選育適應(yīng)性廣的青花菜新品種意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,植物WHY基因的研究相對較少,僅在杧果[3]、水稻[4]、辣椒[5]、黃瓜[6]、大豆[7]、番茄[8]和擬南芥[9]等鑒定出WHY基因。WHY基因家族在非生物脅迫和抗病等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[10]。三明野生蕉WHY基因在8℃條件下表達(dá)量變化明顯,說明該基因可能在抗寒過程中發(fā)揮著重要作用[11];在鹽脅迫處理下,天寶蕉WHY基因表現(xiàn)出明顯的抗性反應(yīng),表明該基因可能在天寶蕉抗鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[12]。此外,SiWHY2轉(zhuǎn)基因型的煙草可通過緩解青枯假單胞菌造成的ROS積累,抵抗病菌的侵染擴(kuò)散,推測SiWHY2可能通過參與水楊酸依賴的抗病響應(yīng)途徑增強(qiáng)植株的抗病性;茉莉酸甲酯可誘導(dǎo)超表達(dá)Whirly2擬南芥葉片更早出現(xiàn)衰老癥狀,說明在茉莉酸酯處理下,Whirly2對植物葉片的衰老具有調(diào)控作用[2]。【研究切入點(diǎn)】青花菜喜冷涼,高溫是其生長發(fā)育的重要影響因素。雖WHY基因的分子機(jī)制在模式植物中研究較多,但其在青花菜高溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制仍不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆青花菜BoWHY2基因,分析其序列特征和分子進(jìn)化,檢測其高溫脅迫下的表達(dá)特征,為進(jìn)一步研究青花菜BoWHY2在高溫脅迫下的應(yīng)答機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為青花菜高代自交系WN12-95B,由昆明學(xué)院青花菜遺傳育種課題組選育。常規(guī)育苗,五葉期時進(jìn)行高溫脅迫(38℃)處理3 h和12 h,每個處理重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 青花菜BoWHY2基因的克隆 提取青花菜葉片總RNA,使用Prime Script 1ststrand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第1鏈。以青花菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的WHY2基因序列為模板,設(shè)計(jì)特異引物(F：5′-ATGATGAAGCAAGCTCGCACT-3′和R：5′-TTACTCTTTACCCCACTCCAGCTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序和體系參照裴徐梨等[13]的方法。

1.2.2 青花菜BoWHY2序列特征分析 利用ProtParam tool、ProtScale和DNAMAN等工具分析BoWHY2的等電點(diǎn)、相對分子量和親疏水性等序列特征。采用GOR4和SWISS-MODEL預(yù)測該蛋白的高級結(jié)構(gòu)[13]。

1.2.3 青花菜BoWHY2同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用BLAST分析青花菜BoWHY2基因的序列同源性。采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]。

1.2.4 青花菜BoWHY2基因的表達(dá)特征分析 青花菜BoWHY2基因在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于昆明學(xué)院青花菜遺傳育種課題組前期的高通量測序結(jié)果。基因表達(dá)量經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理,用FPKM值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花菜BoWHY2基因的克隆

由圖1可見,青花菜BoWHY2基因PCR擴(kuò)增獲得700 bp左右的條帶,經(jīng)回收純化后進(jìn)行TA克隆,測序顯示該序列長度為768 bp,包含上下游引物序列(圖2),將其命名為BoWHY2。

圖1 青花菜BoWHY2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of broccoli BoWHY2 gene

圖2 青花菜BoWHY2基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Broccoli BoWHY2 gene and its deduced amino acid sequence

2.2 青花菜BoWHY2序列特征

青花菜BoWHY2的蛋白分子量為26.2 kD,理論等電點(diǎn)為9.48,屬于堿性蛋白。該蛋白脂肪系數(shù)為74.42。ProtScale和DNAMAN分析結(jié)果顯示,其親水性較差,疏水性較好。二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋(21.67%)、延長線(20.42%)和無規(guī)則卷曲(57.92%)組成。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,該蛋白表面有1個中心空穴并形成帶電的內(nèi)腔。

2.3 青花菜BoWHY2基因序列同源性和進(jìn)化樹

將青花菜BoWHY2基因的核苷酸序列進(jìn)行NCBI-BLAST比對發(fā)現(xiàn),該基因核苷酸序列與甘藍(lán)(Brassicaoleracea,XM_013734587.1)、油菜(Brassicanapus,XM_013843540.2)、白菜(Brassicarapa,XM_009107547.3)和蘿卜(Raphanussativus,XM_018598754.1)的核苷酸同源性分別是100%、97.79%、96.69%和92.76%,核苷酸相似性均在90%以上。與鹽芥(Eutremasalsugineum,XM_006390725.2)、亞麻薺(Camelinasativa,XM_010429650.2)、河岸葡萄(Vitisriparia,XM_034818773.1)、薺菜(Capsellarubella),XM_006302697.2)、葡萄(Vitisvinifera,MN395405.1)和醉蝶花(Tarenayahassleriana,XM_010536568.2)的核苷酸同源性分別是82.46%、81.31%、79.63%、79.58%、78.75%和74.61%,核苷酸相似性均在70%以上。

將青花菜BoWHY2核苷酸序列與多個植物構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)。該進(jìn)化樹可分為兩大組,第一大組中屬十字花科的甘藍(lán)、白菜、油菜、蘿卜、鹽芥、擬南芥、亞麻芥等聚在同一亞組中,而醉蝶花單獨(dú)為一亞組。葡萄科的3個物種聚為第二大組。

圖3 青花菜BoWHY2系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of broccoli BoWHY2 gene

2.4 青花菜BoWHY2基因在高溫脅迫下的表達(dá)特征

由圖4可見,高溫脅迫處理12 h內(nèi),青花菜BoWHY2基因的表達(dá)量先下降后上升。高溫脅迫下處理3 h時,青花菜BoWHY2基因的表達(dá)量逐漸下降至2.15;高溫脅迫下處理12 h時,BoWHY2基因的表達(dá)量持續(xù)上升至4.76,是對照組的1.3倍。

圖4 青花菜BoWHY 2基因高溫脅迫下的表達(dá)特征Fig.4 Expression characteristics of broccoli BoWHY2 gene under high temperature stress

3 討論

利用PCR技術(shù)克隆得到的青花菜BoWHY2基因其序列特征分析結(jié)果與前人研究相似[15],表明植物WHY家族的保守型較強(qiáng),具有類似的生物學(xué)功能。通過與其他植物的WHY家族基因進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn),青花菜與十字花科植物的親緣關(guān)系較近,和甘藍(lán)、油菜、白菜的同源性均在90%以上。因此,推測Whirly基因的保守性較強(qiáng),在不同植物中可能有著相似的生物學(xué)功能。

非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要因素。Whirly基因參與了三明野生蕉的抗低溫反應(yīng),在抗寒過程中發(fā)揮著重要的作用。天寶蕉Whirly可被低溫處理誘導(dǎo),推測其參與了抗低溫反應(yīng),在抗寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用[12];王潔如[16]研究表明,Whirly基因表達(dá)量隨低溫處理時間的總體變化趨勢與天寶蕉、三明野生蕉的研究結(jié)果相似,說明該基因?qū)Φ蜏孛{迫能夠作出積極反應(yīng)。多個GmWHY的表達(dá)量在鹽脅迫處理24 h和48 h的葉片中明顯上調(diào),表明GmWHY基因可能參與了鹽脅迫的調(diào)控[7]。研究結(jié)果表明,青花菜BoWHY2在高溫處理3 h后,基因表達(dá)量上調(diào);高溫處理12 h后,基因表達(dá)量增加,高于對照。說明BoWHY2基因?qū)Ω邷孛{迫能夠作出正向反應(yīng),推測該基因在青花菜抗高溫脅迫上有一定的作用。

4 結(jié)論

從青花菜克隆的BoWHY2基因長度為768 bp,編碼240個氨基酸,該蛋白分子量為26.2 kD,屬于堿性蛋白,疏水性較好,理論等電點(diǎn)為9.48。青花菜BoWHY2基因與甘藍(lán)和油菜的進(jìn)化關(guān)系較近,保守性較強(qiáng),該基因在高溫脅迫下其表達(dá)量持續(xù)升高,對高溫脅迫能夠作出正向反應(yīng)。