劉麗婭 席銳 葉鋒 馬曉菁 谷文喜 陳榮貴 葛小強(qiáng) 馬俊杰 易新萍

摘 要 為探討布魯氏菌病采用先初篩、后確診不同方法及試劑組合檢測(cè)結(jié)果的差異性，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的133份牛、羊血清，以英國(guó)布病參考實(shí)驗(yàn)室RBT、SAT、APHA-cELISA方法為標(biāo)準(zhǔn)確定布病陽性血清73份、陰性血清60份。選擇4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑，按照先初篩，對(duì)結(jié)果陽性樣品再確診的檢測(cè)程序?qū)Υ_定的133份血清樣品分別用6種方法（9種試劑）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：用18種組合方法檢測(cè)牛陽性血清樣品，符合率100%的有3種，檢測(cè)結(jié)果假陰性率為0～53.33%；用12種組合方法檢測(cè)羊陽性血清樣品，符合率100%的有2種組合方法，檢測(cè)結(jié)果假陰性率為0～50.00%。用所有方法檢測(cè)牛陰性血清樣品，符合率100%的有1種方法（試劑），檢測(cè)結(jié)果假陽性率為0～77.78%；檢測(cè)羊陰性血清樣品，符合率100%的有4種方法（試劑），檢測(cè)結(jié)果假陽性率為0～41.67%。應(yīng)用不同的初篩、確診組合方法檢測(cè)同批樣品，結(jié)果出現(xiàn)了多樣性。建議布病初篩可優(yōu)先選擇iELISA、RBT、FPA，確診可優(yōu)先選擇cELISA。

關(guān)鍵詞 布魯氏菌??；初篩；確診；差異性

布魯氏菌病作為主要的人畜共患病，不僅對(duì)人類健康產(chǎn)生較大的威脅，對(duì)畜牧業(yè)也造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。中國(guó)作為農(nóng)牧業(yè)大國(guó)，布病發(fā)病率較高，特別是人畜之間的傳染現(xiàn)象較為嚴(yán)重[2]。近年來布病疫情呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，最主要的原因是傳染源的持續(xù)存在，病畜沒有及時(shí)被檢出，發(fā)現(xiàn)的病畜不能被及時(shí)處理，加之畜牧業(yè)的快速發(fā)展，牲畜交易、流通頻繁，造成傳染源的擴(kuò)散[3]。國(guó)家布魯氏菌病防治計(jì)劃要求在全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)施監(jiān)測(cè)凈化，快速、準(zhǔn)確的診斷方法及檢測(cè)產(chǎn)品是有效開展布病防控工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和必要條件。

目前，布病的診斷主要采用病原學(xué)和血清學(xué)方法，相對(duì)復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、危險(xiǎn)大的病原學(xué)細(xì)菌分離方法而言，血清學(xué)方法因其快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是動(dòng)物布病檢疫最常用的診斷方法[4-8]。布病血清學(xué)診斷方法種類很多，但目前還沒有任何一種方法能兼具高敏感性、高特異性以及操作簡(jiǎn)便、易行、快速等優(yōu)點(diǎn)[9]。為了避免造成陽性動(dòng)物的誤檢或漏檢，布病檢測(cè)應(yīng)先選擇敏感性高、操作較為簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉的方法進(jìn)行初篩，再用敏感性、特異性均較高的診斷方法予以確診，以達(dá)到最全面、準(zhǔn)確的檢測(cè)效果[10]。已有報(bào)道對(duì)布病的不同血清學(xué)方法或試劑檢測(cè)結(jié)果存有差異進(jìn)行了研究分析[11-16]。中國(guó)國(guó)標(biāo)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）中規(guī)定，可用RBPT和iELISA方法進(jìn)行動(dòng)物布魯氏菌病的初篩，用SAT和cELISA方法進(jìn)行確診。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)布病的診斷方法研究非常多，實(shí)際采用的診斷方法也多種多樣，但都存在著不同的缺點(diǎn)[17]。本研究應(yīng)用不同診斷試劑，及不同先初篩后確診的組合方法，對(duì)布病檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。選用4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑，對(duì)已確定布病的陰、陽性牛、羊血清進(jìn)行檢測(cè)，以此了解應(yīng)用不同初篩、確診組合方法及不同廠家診斷試劑檢測(cè)結(jié)果的差異性，以期為中國(guó)布病防控工作的有效開展提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 樣品 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存的133份樣品，其中牛血清81份，羊血清52份。

1.1.2 診斷試劑 布病對(duì)照血清：陽性對(duì)照血清購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司（201401）），陰性對(duì)照血清購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司（201403）；標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)試劑：英國(guó)參考實(shí)驗(yàn)室布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原，英國(guó)參考實(shí)驗(yàn)室布病試管凝集實(shí)驗(yàn)抗原（0054），英國(guó)參考實(shí)驗(yàn)室APHA競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試劑盒（C223-17）；初篩方法（試劑）：ZS-RBT為北京某所布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原（2017810）；HP-FPA為哈爾濱某公司布魯氏菌病熒光偏振測(cè)定法試管型抗體檢測(cè)試劑盒（921012-1）；SZ-GICA為深圳某公司布魯氏菌病抗體快速檢測(cè)卡（2018041212）；LY-GICA為蘭州某公司布魯氏菌抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）（20170501）；ZS-iELISA為某所牛布病間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（17111506）；ZD-iELISA為浙江某公司牛布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（01117）；確診方法（試劑）：ZS-SAT為某所布病試管凝集實(shí)驗(yàn)抗原（20170620）；BW-cELISA為北京某公司cELISA布魯氏桿菌抗體檢測(cè)試劑盒（18040308G）；SZ-cELISA為深圳某公司布魯氏菌病抗體檢測(cè)試劑盒（2018030902）。所有試劑、檢測(cè)卡和試劑盒均在有效期內(nèi)。

1.2 方? 法

1.2.1 血清樣本檢測(cè)與結(jié)果判定 所有方法均嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)GB/T18646-2018 的規(guī)定和試劑盒說明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清樣品的確定 對(duì)113份血清樣品進(jìn)行布病檢測(cè)，先用英國(guó)參考實(shí)驗(yàn)室布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原進(jìn)行RBT初篩，初篩陽性樣品再用英國(guó)參考實(shí)驗(yàn)室布病試管凝集實(shí)驗(yàn)抗原、英國(guó)參考實(shí)驗(yàn)室APHA-cELISA方法進(jìn)行確診。后2種確診方法檢測(cè)結(jié)果都為陽性的判定為陽性。3種方法檢測(cè)結(jié)果都為陰性的判定為陰性。以此結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)確定本試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清樣品。

1.2.3 差異性分析 對(duì)上述確定的陽性血清樣品，先選擇一種初篩方法（試劑）進(jìn)行初篩，對(duì)初篩結(jié)果為陽性的樣品，再選擇一種確診方法（試劑）進(jìn)行確診。對(duì)上述確定的陰性血清樣品，用9種方法（試劑）分別進(jìn)行檢測(cè)（表1）。計(jì)算假陽性率=b/（b+d），假陰性率=c/（a+c）[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰、陽性血清樣品的確定

對(duì)133份牛、羊血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，最終確定標(biāo)準(zhǔn)牛陽性血清45份、陰性36份；標(biāo)準(zhǔn)羊陽性血清28份、陰性24份（表2）。

2.2 布病牛血清檢測(cè)結(jié)果差異性

2.2.1 牛標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品的檢測(cè) 對(duì)45份標(biāo)準(zhǔn)牛布病陽性血清，選擇4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑，按照先應(yīng)用初篩方法全面檢測(cè)后，結(jié)果為陽性的樣品再應(yīng)用確診方法進(jìn)行檢測(cè)，共有18種檢測(cè)組合。

結(jié)果顯示，檢測(cè)出45份陽性血清、假陰性率為0的有3種組合，分別為ZS-RBT、BW-cELISA；ZD-iELISA、BW-cELISA；ZS-iELISA、BW-cELISA。檢測(cè)出21份陽性血清、假陰性率最高達(dá)53.33%的有3種組合，分別為L(zhǎng)Y-GICA、ZS-SAT；LY-GICA、BW-cELISA；LY-GICA、BW-cELISA。檢測(cè)陽性血清為44份的有9種組合，檢測(cè)陽性血清為43份的有1種組合，檢測(cè)陽性血清為42份的有2種組合，假陰性率為2.22%～6.67%。

2.2.2? 牛標(biāo)準(zhǔn)陰性血清樣品的檢測(cè) 分別用4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑對(duì)36份標(biāo)準(zhǔn)牛陰性血清進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果顯示（表3），檢測(cè)出36份陰性血清、假陽性率為0的有1種方法（試劑）是LY-GICA；檢測(cè)出8份陰性血清、假陽性率為77.78%的有1種方法（試劑）是ZD-iELISA。檢測(cè)陰性血清為32份的有1種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為28份的有1種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為24份的有2種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為20份的有1種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為12份的有1種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為10份的有1種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為8份的有1種方法（試劑），假陽性率為11.11%～72.22%。

2.3 布病羊血清差異性檢測(cè)

2.3.1 羊標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品的檢測(cè) 分別用3種初篩方法共4種試劑、2種確診方法共3種試劑對(duì)28份標(biāo)準(zhǔn)羊陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，按照先應(yīng)用初篩方法全面檢測(cè)，對(duì)結(jié)果為陽性的樣品再應(yīng)用確診方法進(jìn)行檢測(cè)，共有12種檢測(cè)組合。

結(jié)果顯示（表4），檢測(cè)出28份陽性血清、假陰性率為0的有2種組合，分別為HP-FPA、BW-cELISA；HP-FPA、SZ-cELISA。檢測(cè)出14份陽性血清、假陰性率最高達(dá)50%的有1種組合，為L(zhǎng)Y-GICA、ZS-SAT。檢測(cè)陽性血清為26份的有4種組合，檢測(cè)陽性血清為24份的有2種組合，檢測(cè)陽性血清為22份的有1種組合，檢測(cè)陽性血清為16份的有1種組合，假陰性率為7.14%～42.86%。

2.3.2 羊標(biāo)準(zhǔn)陰性血清樣品的檢測(cè) 對(duì)24份標(biāo)準(zhǔn)羊陰性血清，用3種初篩方法共4種試劑、2種確診方法共3種試劑分別進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果顯示（表5），檢測(cè)出24份陰性血清、假陽性率為0的有4種方法（試劑）：ZS-RBT、SZ-GICA、LY-GICA、SZ-cELISA；檢測(cè)出14份陰性血清、假陽性率為41.67%的有1種方法（試劑）：BW-cELISA。檢測(cè)陰性血清為22份的有1種方法（試劑），檢測(cè)陰性血清為16份的有1種方法（試劑），假陽性率為8.33%～33.33%。

3 討? 論

畜間布病是人間布病流行的晴雨表，做好畜間布病防控對(duì)人畜健康都有重要意義。近年來隨著中國(guó)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及牲畜、畜產(chǎn)品的大量流通，畜間布病仍未得到有效控制?？傮w來看，每年的發(fā)病數(shù)量沒有呈現(xiàn)出顯著性下降的趨勢(shì)[19]，布病防控工作任重而道遠(yuǎn)。當(dāng)前中國(guó)布病防控采取“檢疫撲殺和疫苗免疫”相結(jié)合的綜合防控措施，診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性關(guān)乎著防控工作的成功與否。在實(shí)際檢疫中，診斷方法的選擇、診斷試劑敏感性、特異性的差別以及檢測(cè)人員的操作，都影響著布病診斷的最終結(jié)果。

本研究對(duì)牛、羊應(yīng)用布病不同初篩及確診方法組合的檢測(cè)差異性結(jié)果進(jìn)行研究、比對(duì)分析。選擇布病臨床診斷中常用的4 種初篩方法共6 種試劑、2 種確診方法共3 種試劑，依照先初篩再確診的組合檢測(cè)方法，對(duì)確定的標(biāo)準(zhǔn)牛、羊血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)牛陽性血清檢測(cè)用18種組合方法，陽性符合率為100%的有3種組合，檢測(cè)結(jié)果假陰性率為0～53.33%；標(biāo)準(zhǔn)羊陽性血清檢測(cè)用12種組合方法，陽性符合率為100%的僅有2種組合，檢測(cè)結(jié)果假陰性率為0～50.00%。標(biāo)準(zhǔn)牛陰性血清用所有方法（試劑）進(jìn)行檢測(cè)，陰性符合率為100%的僅有1種方法（試劑），檢測(cè)結(jié)果假陽性率為0～77.78%；標(biāo)準(zhǔn)羊陰性血清用所有方法進(jìn)行檢測(cè)，陰性符合率為100%的有4種方法（試劑），檢測(cè)結(jié)果假陽性率為0～41.67%。研究表明，布病初篩方法可優(yōu)先選擇iELISA、RBT、FPA。不同廠家的膠體金方法檢測(cè)結(jié)果間存在顯著差異；確診方法可優(yōu)先選擇cELISA。

本研究應(yīng)用的診斷方法、商品化的診斷試劑及不同的初篩、確診組合方法，在實(shí)際檢測(cè)中常會(huì)用到，所得的檢測(cè)結(jié)果間卻存有較大差異。這些漏檢的假陰性樣品、誤檢的假陽性樣品，致使傳染源進(jìn)一步傳播擴(kuò)大，或因誤殺健康動(dòng)物造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，都制約著布病的有效防控和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為避免診斷結(jié)果出現(xiàn)的多樣性與不確定性[20]，在診斷試劑的監(jiān)管、評(píng)估方面應(yīng)加強(qiáng)管理，制定全國(guó)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，保證檢驗(yàn)效果，從而確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

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Abstract In order to explore brucellosis，the methods such aspreliminary screening at first， and then diagnosis confirmation，the differences of reagent combinationresults were used.The RBT， SAT， APHA-cELISA method of the British Brucellosis Laboratory were used as the standard，73 samples of brucellosis positive sera and 60 samples of negative sera? were confirmed with the 133 samples of bovine and sheep serum stored in the laboratory.Four primary screening methods including 6 reagents， and 2 confirmatory methods including 3 reagents were selected，the preliminary screening was done first ， and then the positive results were confirmed， the determined 133 serum samples were tested by 6 methods （9 reagents）.The result showed that 18 kinds of combination methods were used to detect positive sera from cattle， 3 of which had a 100% coincidence rate， and the false-negative rate was 0 to 53.33%;12 combinations? were used to detect positive sera from sheep， and two combinations had a 100% coincidence rate ， the false negative rate of test results was 0-50.00%. Cattle negative serum was tested by all methods，there was 1 method （reagent） with a compliance rate of 100%， and the false positive rate of test results was 0-77.78%;sheep negative serum was tested by all methods and the compliance rate was 100% by use of 4 methods （Reagent）， the false positive rate of test results was 0-41.67%. In this study， different combination methods for preliminary screening and diagnosis were used to detect the same batch of samples， and the results showed diversity. It is recommended that iELISA， RBT， and FPA should be preferred for initial screening of brucellosis， and cELISA should be preferred for diagnosis.

Key words Brucellosis; Preliminary screening; Diagnosis; Difference