閆璧瀅 陳渝川 雷麗娟 王瀟 解云英 趙午莉 張晶 司書毅 陳明華

摘要：目的 對海南東寨港紅樹林3種植物和沉積物來源真菌多樣性進(jìn)行勘探，旨在發(fā)現(xiàn)潛在的真菌新物種和藥用真菌。方法 基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列測定對分離得到的真菌進(jìn)行初步鑒定，并對真菌發(fā)酵粗提物進(jìn)行抗菌、抗新冠病毒靶標(biāo)、抗結(jié)核、抗動脈粥樣硬化，以及抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的廣泛活性篩選。結(jié)果 從海南東寨港紅樹林植物和沉積物中共分離得到164株真菌，鑒定出106株，分布在17個目33個科43個屬，其中優(yōu)勢菌群為鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus），分別占總體的12.26%、12.26%和9.43%。結(jié)論 初步認(rèn)知了海南東寨港紅樹林3種植物及沉積物來源真菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的能產(chǎn)生活性物質(zhì)的真菌，為后續(xù)研究紅樹林環(huán)境來源的真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性及其生物活性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紅樹林來源真菌；抗菌活性；抗冠狀病毒活性；細(xì)胞毒性；海南東寨港

中圖分類號：R978.7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Diversity and Bioactivity of fungi isolated from mangrove plants and sediments collected in Dongzhaigang， Hainan Province

Yan Bi-ying， Chen Yu-chuan， Lei Li-juan， Wang Xiao， Xie Yun-ying，

Zhao Wu-li， Zhang Jing， Si Shu-yi， and Chen Ming-hua

（Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050）

Abstract Objective To explore the fungal diversity of mangrove plants and sediments in Dongzhaigang， Hainan Province， and discover the potential new fungal species and bioactive fungi. Methods The isolated fungi were preliminarily identified on the basis of the sequence analysis of the internal transcriptional interval region （ITS）， and the crude extracts of the fermentation were screened for their antibacterial， antifugal， anti-coronavirus， anti-tuberculosis， anti-atherosclerosis， and cytotoxicity activities. Results A total of 164 fungi were isolated from the three mangrove plants and sediments， among them of 106 fungi were identified， which were distributed in 17 orders， 33 families， and 43 genera， including the dominant flora were Fusarium， Penicillium， and Aspergillus genus， accounting for 12.26%， 12.26%， and 9.43%， respectively. Conclusion The diversity of fungi from the three mangrove plants and sediments collected in Dongzhaigang， Hainan Province was preliminarily recognized， and some potential bioactive fungal resources were discovered， which laid a foundation for the subsequent study on the chemical diversity and bioactivity of fungal metabolites from mangrove derived fungi.

Key words Mangrove-derived fungi; Antimicrobial activity; Anti-coronavirus; Cytotoxicity; Dongzhaigang， Hainan province

紅樹林是處在熱帶和亞熱帶海陸交界地帶的木本植物群落，是一種由陸地向海洋過渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)。由于紅樹林所處環(huán)境是一個因周期性潮汐導(dǎo)致鹽度和養(yǎng)分供應(yīng)高度變化的特殊環(huán)境，從而為多樣化生物群落提供了優(yōu)越的棲息之地[1-2]。自1955年澳大利亞學(xué)者Cribb[3]首次報道了紅樹林來源真菌以來，其已成為海洋真菌的第二大類群。紅樹林來源真菌為適應(yīng)其獨(dú)特的生存環(huán)境，具備特殊的代謝機(jī)制，因而有可能產(chǎn)生出獨(dú)特新穎結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物以及顯示出更加廣泛的生物活性[4]。1989年，Poch和Gloer首次從夏威夷紅樹林來源真菌Helicascus kanaloanus中發(fā)現(xiàn)了2個新的α-吡喃酮類化合物[5]，紅樹林來源真菌次級代謝產(chǎn)物自此成為微生物天然產(chǎn)物工作者的研究熱點之一。特別是2008年以后，對紅樹林來源真菌次級代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)入了一個快速發(fā)展的時期，至2020年底，各國學(xué)者已從中獲得了1387個新化合物，包括聚酮類、萜類、生物堿、肽類及二酮哌嗪類化合物等，這些化合物顯示出了廣泛的生物活性，如細(xì)胞毒性、抗病毒、抗細(xì)菌和抗真菌、抗炎以及殺蟲等活性[6-8]。因此，紅樹林來源真菌次級代謝產(chǎn)物已成為創(chuàng)新藥物先導(dǎo)物的一個重要來源。我國孕育著豐富的紅樹林資源，主要分布在海南、福建、兩廣和港澳臺等地區(qū)。前期有研究表明，海南東寨港紅樹林中蘊(yùn)藏著大量的藥用放線菌資源[9]，而本文我們主要對該國家級保護(hù)區(qū)的紅樹林植物內(nèi)生真菌及沉積物來源真菌的多樣性進(jìn)行了初步勘探，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了廣泛的活性篩選，以期篩選出潛在的藥源真菌，為進(jìn)一步開發(fā)利用紅樹林真菌資源，發(fā)現(xiàn)具有潛在藥用價值的生物活性天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅樹林樣品

2020年9月采集自海口東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)（N19°57′33″E110°35′11″）植物樣本6份，沉積物3份（表1），其中木欖1-3為不同植株樣品；沉積物1-3采自木欖周圍土壤。樣本裝進(jìn)無菌自封袋中封存，帶回實驗室后將植物樣本放置于4℃冰箱中低溫保存，將沉積物樣本放置-20℃中保存。

1.1.2 指示菌株

革蘭陽性細(xì)菌：金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌181223（臨床株，MRSA）、耐萬古霉素屎腸球菌310682（臨床株，VRE）；革蘭陰性細(xì)菌：耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（臨床株，CRAB）、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌181230（臨床株，CRPA）、大腸埃希菌ATCC 25922、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌181221（臨床株，ESBLS）、耐碳青霉烯類肺炎克雷菌181248（臨床株，CRE）；真菌：白念珠菌ATCC10231、新型隱球菌ATCC208821；以及海分枝桿菌Mycobacterium marinum BAA-535均為本研究所保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基（g/L） ? ?馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）2.4、海鹽3；察氏培養(yǎng)基4.7、海鹽3。純化培養(yǎng)基采用PDA 2.4、海鹽3。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基（/袋） ? ?大米50 g、鹽水（30 g/L）50 mL。

（3）指示菌株培養(yǎng)基（g/L） ? ?耐藥菌采用MH肉湯培養(yǎng)基（2.1）；白念珠菌和新型隱球菌采用YPD培養(yǎng)基（酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20）；大腸埃希菌使用LB培養(yǎng)基（酵母提取物5、氯化鈉10、胰蛋白胨10）；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌采用營養(yǎng)肉湯（NB）（1.8）。

（4）抑制劑（mg/L） ? ?四環(huán)素50、硫酸鏈霉素50。待培養(yǎng)基溫度自然冷卻至45℃左右時滴入并混勻。

（5）主要試劑及儀器 ? ?ITS基因的PCR擴(kuò)增采用通用引物ITS1（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，超凈工作臺BCM-1000A（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-X100（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）、生化培養(yǎng)箱（中儀國科（北京）科技有限公司）、霉菌培養(yǎng)箱BPMJ-250F（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、高壓滅菌鍋GR60DA（致微（廈門）儀器有限公司）、一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿（廣州潔特生物過濾制品有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA N-1100（埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司）、高通量篩選多功能測試儀（PerkinElmer公司）。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MSD-Trap/SL 1100系列（美國Agilent公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 紅樹林植物樣品的處理

預(yù)先在培養(yǎng)皿中放入兩層濾紙、兩層紗布、鑷子、剪刀，用報紙包好后和無菌水一起放入高壓菌鍋中在121℃滅菌15 min。將植物莖、葉在超凈臺中放入75%乙醇浸泡約1 min后再放入到無菌水中浸泡約30 s，而后放在墊有濾紙、紗布的培養(yǎng)皿中，使其表面水分被吸干。之后用剪刀將植物的莖、葉剪成小塊，分別鋪在含有抑制劑的PDA和察氏培養(yǎng)基平板的表面。將平板用封口膜封好后放到28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 土壤樣品的處理和涂布

從冷凍的海泥沉積物中取出少許，放入50 mL離心管中，超凈臺過夜吹風(fēng)。第二天將干燥的海泥沉積物放入無菌研缽中磨成粉末，倒回50 mL離心管中。分別加入相應(yīng)體積無菌人工海水（30 g/L），渦旋約

10 min，再超聲約15 min。4℃條件下8000 r/min離心

5 min后，將上清液收集在15 mL離心管中。將下層沉淀用人工海水分別稀釋成10-1、10-2濃度。分別將上清液、沉淀、10-1沉淀、10-2沉淀直接涂布在預(yù)先準(zhǔn)備好的含有抑制劑的PDA和察氏培養(yǎng)基平板的表面。將平板用封口膜封好后放到28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 菌落挑選、純化與保存

將平板置于28℃培養(yǎng)2～6周。2周之后，隨時觀察分離培養(yǎng)基中菌落形態(tài)，在無菌條件下挑取真菌單菌落到新的PDA平板上進(jìn)行菌株純化。得到純化菌株后挑取適量菌絲體放入凍存管中并以20%（體積比）滅菌甘油作為保護(hù)劑，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.4 菌株的生物學(xué)鑒定

用無菌竹簽挑取少量真菌菌絲體，置于1.5 mL EP管中，CTAB法提取真菌基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR反應(yīng)體系 （30 μL）：模板DNA 1-2 μL，2×PCR mix 15 μL，Primer F（10 mmol/L），

Primer R（10 mmol/L）1 μL，ddH2O補(bǔ)足至30 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃， 5 min；94℃， 30 s，50℃， 30 s，72℃， 1 min，35個循環(huán)；72℃， 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，檢索相似性序列，初步確定分離菌株的種屬，并用SnapGene比對序列進(jìn)行排重。

1.2.5 真菌發(fā)酵粗提物的制備

將分離純化鑒定排重后得到的106株真菌由PDA平板中轉(zhuǎn)接到裝有5 mL馬鈴薯葡萄糖（PDB）培養(yǎng)基的搖菌管中，28℃、160 r/min培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接到預(yù)先經(jīng)滅菌處理的大米培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)30 d后用3倍體積的乙醇提取，對粗提物經(jīng)3倍體積的乙酸乙酯萃取后減壓濃縮，得到106份發(fā)酵粗提物。

1.2.6 活性測定

（1）發(fā)酵粗提物抗菌活性檢測 ? ?抗菌活性檢測：取少量粗提物 （20 mg/mL）用DMSO溶解后轉(zhuǎn)移至96孔板中，將2 μL粗提物加入到100 μL待測細(xì)菌液和真菌液中（濃度：105 CFU/mL），細(xì)菌和真菌分別在37℃和28℃靜置培養(yǎng)，并分別于16 h和10 h后肉眼觀察孔的澄清度，肉眼觀察為澄清的樣品認(rèn)為具有抑菌效果。

（2）抗新冠病毒靶標(biāo)活性篩選——Mpro抑制劑熒光偏振模型[10] ? ?將400 nmol/L Mpro以29 μL/孔加入到96孔半底板中，再加入發(fā)酵提取物1 μL/孔到96孔半底板中，室溫避光孵育35～40 min?；衔锓跤戤吅?，以20 μL/孔加入60 nmol/L FITC-S-Biotin反應(yīng)液（用DMSO溶解熒光探針FITC-Substrate-Biotin，再用熒光偏振緩沖液（10 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1mmol/L DTT pH 8.0稀釋），室溫避光繼續(xù)孵育20～25 min。再以10 μL/孔繼續(xù)加入300 nmol/L親和素反應(yīng)液（Avidin以熒光偏振緩沖液稀釋），室溫避光孵育5～8 min，用多功能酶標(biāo)儀檢測mP值。苗頭發(fā)酵提取物抑制率（%）=（mP_Hit-mP_陰性對照）/（mP_陽性對照-mP_陰性對照）×100%，選取抑制率﹥50%的為陽性菌株。

（3）抗結(jié)核活性表型篩選（海分枝桿菌） ? ?將海分枝桿菌用7H9培養(yǎng)基（含10% OADC，0.05%吐溫80）培養(yǎng)，每孔加入200μL接種有對數(shù)期海分枝桿菌的7H9培養(yǎng)液（終濃度A600≈0.1），發(fā)酵提取物檢測的終濃度為200 μg/mL，異煙肼做陽性對照，30℃靜置培養(yǎng)5-7天，觀察結(jié)果，以完全抑制海分枝桿菌生長的發(fā)酵提取物視為陽性菌株。

（4）抗動脈粥樣硬化（KLF2上調(diào)活性）[11] ? ?利用本實驗室前期建立的與動脈粥樣硬化相關(guān)的KLF2模型對粗提物進(jìn)行活性篩選。實驗對象為KLF2-COS7細(xì)胞，利用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基稀釋消化后的處于對數(shù)生長期的COS7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，同時瞬時轉(zhuǎn)染KLF2質(zhì)粒，接種到96孔板（150 μL/孔），4～6 h待細(xì)胞貼壁后，更換為5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（200 μL/孔），每孔加入1 μL粗提物，18～24 h后檢測。以熒光素酶為報告基因，EnVision多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶與底物反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，用相對發(fā)光單位（relative luminescence unit， RLU）的數(shù)值來表示。實驗過程中設(shè)置空白對照孔，按公式：上調(diào)KLF2的倍數(shù)值=加藥孔熒光強(qiáng)度/空白對照孔熒光強(qiáng)度得到樣品的上調(diào)倍數(shù)，選取上調(diào)倍數(shù)大于1.5的樣品認(rèn)定為具有上調(diào)KLF2的活性。

（5）體外抑制胰腺癌細(xì)胞增殖活性測試[12] ? ?將對數(shù)生長期的吉西他濱耐藥胰腺癌細(xì)胞（Mia-Paca-2）用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個/mL。在96孔板中加入調(diào)整好濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔

200 μL，用無血清的培養(yǎng)基封閉96孔板的周邊，并將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期。用完全培養(yǎng)基將發(fā)酵提取物稀釋5000倍作為藥物溶液，將原培養(yǎng)液棄掉，每孔加入200 μL藥物溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后MTT檢測細(xì)胞存活水平。選取抑制率大于50%的認(rèn)為具有活性。

1.2.7 發(fā)酵粗提物的HPLC及LC-MS檢測

選取具有兩種活性的菌株YBY-F2和YBY-F63的發(fā)酵粗提物進(jìn)行HPLC和LC-MS檢測。粗提物經(jīng)甲醇溶解，微孔濾膜（0.22 μm）過濾后進(jìn)行HPLC-DAD及LC-MS檢測，觀察樣品的紫外吸收峰特征及分子量。HPLC分析條件：色譜柱（Cosmosil 5C18-PAQ，

5 μm， 4.6 mm×150 mm），流速（1 mL/min），洗脫條件[5%～50% ACN/H2O （0.1% TFA）， 0～10.00 min; 50%～100% ACN/H2O （0.1% TFA）， 10.01～35.00 min; 100%ACN， 35.01～40.00 min]，時間：40 min；LC-MS分析條件：色譜柱（Cosmosil 5C18-PAQ，

5 μm， 4.6 mm× 150 mm），流速（1 mL/min），洗脫條件[5%～50% ACN/H2O （0.1% TFA）， 0～10.00 min; 50%～100%ACN/H2O （0.1% TFA）， 10.01～35.00 min; 100%ACN，35.01～40.00 min]，時間：40.00 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的生物學(xué)鑒定結(jié)果

從6份植物樣品和3份沉積物中一共分離鑒定出164株真菌，通過菌落形態(tài)特征對比，BLAST檢索相似性序列，以及SnapGene比對序列進(jìn)行排重等分析測序結(jié)果，共鑒定出了106株真菌（圖1、表2），它們分布在17個目33個科44個屬。其中鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）占比例最高，分別有13株，占總數(shù)的12.26%；其次是曲霉屬（Aspergillus）有10株，占比達(dá)9.43%；炭疽菌屬（Colletotrichum）共7株，占6.60%；其他屬共66株，占59.45%（圖1）。

其中菌株YBY-F80與有效發(fā)表菌株Guignardia sp.（KX065260.1）的相似度最高為99.64%，與有效發(fā)表菌株P(guān)hyllosticta carochlae（NR147354.1）的相似度為95.70%。另外，以rDNA- ITS基因序列為基礎(chǔ)，采用鄰接法（Neighbour Joining，N-J）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株YBY-F80與葉點霉屬（Phyllosticta sp.）有效發(fā)表菌株P(guān)hyllosticta alliacea （MT908519.1）、球座菌屬（Guignardia sp.）有效發(fā)表菌株Guignardia camelliae （GU066668.1/GU066719.1/GU595026.1/JQ086349.1）以及Guignardia alliacea （MUCC0155）聚成一簇并形成一個獨(dú)立的分支，結(jié)果如圖2所示，因此推測菌株YBY-F80為葉點霉科球座菌屬或葉點霉屬的潛在新種。菌株YBY-F148與有效發(fā)表菌株Cylindrosympodium sp. （MK018951.1）的相似度最高為96.06%，與有效發(fā)表菌株Veronaeopsis simplex （LC632038.1） 的相似度為94.31%。另外，以 ITS rRNA基因序列為基礎(chǔ)，采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株YBY-F148與有效發(fā)表菌株Cylindrosympodium variabile （NG 070448.1）聚成一簇并形成一個獨(dú)立的分支， 結(jié)果如圖3所示，因此推測菌株YBY-F148為Cylindrosympodium sp.的潛在新種。

2.2 真菌在樣品中的分布

從各個樣品得到的真菌數(shù)量如圖4所示，從老鼠簕樣本中獲得了10株內(nèi)生真菌；木欖樣本1-3中獲得內(nèi)生真菌共44株；彎枝黃檀中得到內(nèi)生真菌8株；從海泥沉積物樣本7-9中共得到了45株真菌。對紅樹林植物和沉積物分離出的真菌種屬和數(shù)量分別進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)從紅樹林植物中得到的菌株種屬更為豐富（表3）。

2.3 活性篩選結(jié)果

2.3.1 抗菌活性篩選結(jié)果

采用2種真菌（白念珠菌、新型隱球菌）、6種耐藥菌（金黃色葡萄球菌181223、屎腸球菌310682、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌181230、大腸埃希菌181221、肺炎克雷菌181248）以及2種標(biāo)準(zhǔn)菌株（金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922）對得到的106份粗提物進(jìn)行抗菌活性篩選。

結(jié)果表明，粗提物在100 μg/mL時，至少對一株檢定菌顯示活性的共有24株，總陽性率為22.64%，結(jié)果如表4和圖5所示。其中9株具有抗真菌活性，13株有抗革蘭陽性菌活性，9株有抗革蘭陰性細(xì)菌活性；特別值得關(guān)注的是，篩選到了對耐萬古霉素屎腸球菌有抑制活性的菌株4株，對碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌具有抑制活性的菌株3株，這些研究結(jié)果為抗耐藥菌抗生素的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

2.3.2 抗新冠病毒靶標(biāo)篩選結(jié)果

新冠病毒靶標(biāo)Mpro蛋白抑制劑熒光偏振模型實驗結(jié)果表明，共有6株真菌的發(fā)酵粗提物對Mpro蛋白活性的抑制率在50%以上，占總數(shù)的5.66%（表5）。

2.3.3 抗結(jié)核活性（海分枝桿菌）篩選結(jié)果

實驗結(jié)果表明，有3株真菌粗提物在200 μg/mL時能夠顯著抑制海分枝桿菌的生長（肉眼看澄清），占總數(shù)的2.83%（表6）。

2.3.4 抗動脈粥樣硬化（KLF2上調(diào)活性）篩選結(jié)果

實驗結(jié)果表明，共有19株真菌粗提物在100 μg/mL

具有不同程度的KLF2上調(diào)活性（上調(diào)倍數(shù)大于1.5倍），占總數(shù)的17.92%，其中有4株的活性較為顯著（上調(diào)倍數(shù)大于2倍），占總數(shù)的3.77%（表7）。

2.3.5 體外胰腺癌細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

實驗結(jié)果表明，共有4株真菌粗提物在稀釋5000倍后，體外對胰腺癌細(xì)胞（Mia-paca-2）增殖的抑制率在50%以上，占總數(shù)的3.77%（表8）。

2.4 菌株YBY-F2和YBY-F63發(fā)酵粗提物的HPLC和LC-MS檢測結(jié)果

通過對YBY-F2粗提物進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)其主要包含3種類型的紫外吸收，即有2個類似吸收峰的最大紫外吸收在200 nm處；有至少2個類似吸收峰的最大紫外吸收在233和278nm處；有多個類似吸收峰的最大紫外吸收在271nm處（圖6）。YBY-F63粗提物的HPLC分析結(jié)果表明，其主要包含五種類型的紫外吸收，有2個類似吸收峰的最大紫外吸收在230 nm處，有2個類似吸收峰的最大紫外吸收在282 nm處，有至少3個類似吸收峰的最大紫外吸收在260 nm處，有2個類似吸收峰的最大紫外吸收在207 nm處，有2個類似吸收峰的最大紫外吸收在270 nm處（圖7）。同時也對該兩株菌株粗提物進(jìn)行了LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)兩株菌株的離子峰還是比較豐富的，YBY-F2在

m/z 300-500區(qū)間有多個離子峰（圖8），而YBY-F63的LC-MS結(jié)果顯示，其在m/z 700-800區(qū)間有多個離子峰（圖9）。從這些結(jié)果看出，這兩株菌均有豐富的次級代謝產(chǎn)物，值得進(jìn)一步分離純化，以期獲得活性產(chǎn)物。

3 討論

2001年，天然產(chǎn)物化學(xué)研究者在一株紅樹林植物來源真菌Xylaria sp.中發(fā)現(xiàn)了一類新穎骨架聚酮類化學(xué)成分xyloketals[13]，以及2003年從一株紅樹林土壤來源放線菌Salinispora tropica中發(fā)現(xiàn)了一個對多株腫瘤細(xì)胞具有顯著抑制作用的salinosporamide A（marizomib）[14]，目前該化合物已先后被FDA批準(zhǔn)為治療多發(fā)性骨髓瘤和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的孤兒藥進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗研究[15]。這些結(jié)果預(yù)示著紅樹林微生物中孕育著豐富的新穎獨(dú)特結(jié)構(gòu)及藥用活性成分。近二十年來，人們已從紅樹林土壤和植物來源的微生物中獲得了大量的新穎活性次級代謝產(chǎn)物，數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，其中85%的化學(xué)成分來源于真菌[4，16-18]。

海南東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)是我國建立的第一個紅樹林保護(hù)區(qū)，有學(xué)者已從該保護(hù)區(qū)采集的14種真紅樹植物中分離得到146株放線菌，分布在18個屬，并對部分菌株發(fā)酵液進(jìn)行了抗菌活性測試，得到了40株具有抗菌活性的菌株，充分說明該區(qū)域紅樹林內(nèi)生放線菌的多樣性及藥用開發(fā)價值[9]。而目前對于該保護(hù)區(qū)植物的內(nèi)生真菌研究報道卻較少。此前有學(xué)者對該保護(hù)區(qū)的兩種紅樹林植物紅海欖和秋茄內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行了考察[19]，分別從紅海欖和秋茄的枝、葉中分離到內(nèi)生真菌30株和27株，優(yōu)勢屬分別是莖點霉屬Phoma和擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis，但文中并沒有對所分離菌株進(jìn)行藥用活性的考察。鑒于此，本研究從該保護(hù)區(qū)采集了另外3種紅樹林植物（木欖、老鼠簕和彎枝黃檀）和木欖植物周圍沉積物共7份樣品，從中分離得到164株真菌，鑒定并排重后為106株真菌，它們分布在17個目34個科43個屬，其中菌株YBY-F80為葉點霉科球座菌屬或葉點霉屬的潛在新種，菌株YBY-F148為Cylindrosympodium sp.的潛在新種。

木欖（Bruguiera gymnorrhiza）為我國傳統(tǒng)藥用紅樹植物，其樹皮、葉和果實均可入藥。木欖葉在民間主要用于治療瘧疾，而樹皮可用于治療咽喉腫痛、泄瀉腹痛等。現(xiàn)代藥理研究表明木欖有抗腫瘤、抗真菌和抗病毒等藥理作用[20]。近些年對木欖來源微生物（根際土壤及其內(nèi)生環(huán)境）的次級代謝產(chǎn)物也有研究。Bin-Gui Wan等在木欖葉中發(fā)現(xiàn)一株枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides MA-299），并從中發(fā)現(xiàn)了5個新的聚酮類化合物[21]以及4個新的少見的C-2硫取代的十二元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物[22]，其中新化合物Cladospolide G對兩株植物病原菌Glomerella cingulate和Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum的MIC值均為1 μg/mL[21]。Yue-Wei Guo研究團(tuán)隊從木欖莖中得到一株青霉屬真菌Penicillium sp. GD6，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物對Staphylococcus aureus的MIC值為6.4 μg/mL，經(jīng)過一系列的色譜分離純化，從中發(fā)現(xiàn)了一類新穎骨架的吡咯里西啶類化合物penibruguieramine A，但因為該化合物量少的原因并未進(jìn)行抗菌活性測試[23]。本研究中對木欖莖、葉和樹皮的內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物進(jìn)行了多種抗菌活性測試，共從中得到抗新型隱球菌、抗耐藥屎腸球菌和抗耐藥銅綠假單胞菌活性菌株各1株，抗白念珠菌和抗大腸埃希菌活性菌株各2株，抗金黃色葡萄球菌活性菌株3株。此外，本研究還從木欖來源內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)1株鐮刀菌屬真菌YBY-F63能夠抑制海分枝桿菌的生長和抑制新冠病毒靶標(biāo)Mpro的活性，以及1株球毛殼屬真菌YBY-F97和1株炭角菌屬真菌YBY-F90能夠抑制胰腺癌細(xì)胞（Mia-paca-2）的增殖。

老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳平喘之功效，在我國海南民間廣泛將其用作治療乙型肝炎的特效藥[24]。老鼠簕提取物具有保肝、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗氧化等藥理活性，目前已從中分離鑒定出生物堿、黃酮類、苯乙醇苷、木脂素、三萜和甾醇等近百種成分，并發(fā)現(xiàn)部分生物堿具有顯著的保肝作用[25]。2007年，洪葵研究團(tuán)隊從老鼠簕中總共分離到27株放線菌、44株細(xì)菌以及26株真菌，并從中獲得了一些抗細(xì)菌、真菌以及細(xì)胞毒性菌株[24]。近期，我國學(xué)者從中國南海海岸的老鼠簕莖和葉，以及其根際土壤中分離得到102株真菌，優(yōu)勢菌屬為青霉屬、曲霉屬和鐮刀菌屬，并對其中55份PDA粗提物進(jìn)行了多株腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗，發(fā)現(xiàn)31株菌株在50 μg/ml時有細(xì)胞毒性。利用活性導(dǎo)向以及指紋分析技術(shù)，他們從一株青霉屬真菌Penicillium sp. （HS-N-27）中分離得到了一個具有顯著細(xì)胞毒性的化學(xué)成分brefeldin A，其對A549、HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值分別為101.2、171.9和239.1 nmol/L [25]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，至2020年12月，共從老鼠簕來源的22株真菌中分離得到了95個新的次級代謝產(chǎn)物[25]。因此，老鼠簕的內(nèi)生真菌是天然產(chǎn)物研究者比較感興趣的研究對象之一。本研究從老鼠簕莖和葉中分離得到了10株內(nèi)生真菌，并對其發(fā)酵提取物進(jìn)行了廣泛活性篩選，得到5株具有抗菌活性的菌株，1株抑制海分枝桿菌生長的菌株，以及2株能夠上調(diào)抗動脈粥樣硬化靶標(biāo)KLF2活性的菌株，但并沒有發(fā)現(xiàn)對胰腺癌細(xì)胞株具有顯著細(xì)胞毒性的菌株。

此外，彎枝黃檀（Dalbergia candenatensis）為豆科植物，多年生草本，常攀附于紅樹植物上，有強(qiáng)筋活絡(luò)、破積止痛之功效[26]。對于該植物的化學(xué)成分及其藥理活性報道較少，僅有國外學(xué)者從泰國的彎枝黃檀分離得到了一些具有抗菌活性的異黃酮類[27]，以及具有輕微細(xì)胞毒性的黃烷類和其他一些酚類化合物[28]。本研究首次對彎枝黃檀的葉進(jìn)行了其內(nèi)生真菌的研究，從中得到7株內(nèi)生真菌，并發(fā)現(xiàn)其中YBY-F2菌株能夠抑制金黃色葡萄球菌和抑制新冠病毒靶標(biāo)Mpro的活性，以及YBY-F4能夠上調(diào)KLF2的活性。

本研究雖然對海南東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)的3種紅樹林植物及木欖植株周圍的沉積物進(jìn)行了真菌的分離，并對菌株的大米發(fā)酵粗提物進(jìn)行了廣泛的活性篩選，得到了一些具有藥理活性的菌株。研究結(jié)果一定程度地表明了海南東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)中存在種類豐富、活性多樣的藥用真菌資源，具有發(fā)現(xiàn)真菌新物種及新藥用活性分子的潛力。但本研究選取的紅樹林植物和沉積物樣本在豐富度上有一定的局限性，因此， ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?海南東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)中紅樹林植物內(nèi)生真菌的多樣性及其藥用活性還有很大潛力值得挖掘，為天然產(chǎn)物研究工作者探尋紅樹林植物及其內(nèi)生菌的關(guān)系提供更多的微生物資源和數(shù)據(jù)支撐。

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收稿日期：2022-09-07

基金項目：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助（No. 2021-I2M-1-028）；國家自然科學(xué)基金（No. 81302675）

作者簡介：閆璧瀅，女，生于1997年，在讀碩士研究生，E-mail： yanbiying@163.com

通訊作者，E-mail： chenminghua@imb.pumc.edu.cn