李雪玲　陳華紅　崔文艷等

摘要： 分別從生長于云南楚雄的核桃根、莖、葉中分離內(nèi)生放線菌，并對分離菌株進行純化、保存。通過對分離菌株生長特性、形態(tài)觀察、分子分類等研究，對菌株進行初步鑒定與抗菌活性研究。結(jié)果表明，共分離得到42株內(nèi)生放線菌，其中從根中分離11株、從莖中分離12株、從葉中分離19株，分離菌株均屬于鏈霉菌屬。試驗內(nèi)生放線菌菌株SA8對擬盤多毛孢、鏈格孢、德氏孺孢、灰葡萄孢、疫霉這5種病原菌均有抑菌作用。

關(guān)鍵詞： 核桃；內(nèi)生放線菌；分離；鑒定；抗菌活性

中圖分類號：S664.101 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）08-0106-04

放線菌（actinomycete）是抗生素的主要產(chǎn)生菌，目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的8 000多種活性物質(zhì)中，有近70%是放線菌產(chǎn)生的，目前放線菌已被廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 [1-2]。如我國研制開發(fā)的井岡霉素、多效霉素農(nóng)用鏈霉素等生物農(nóng)藥已經(jīng)大量使用，產(chǎn)生了較大的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益 [3]。植物內(nèi)生菌（plant endophyte）作為一類重要的微生物資源具有重要的理論研究價值和開發(fā)潛力，其中植物內(nèi)生放線菌具有獨特的代謝和遺傳機制，在植物病害生物防治中有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景，現(xiàn)已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點 [4-5]。內(nèi)生放線菌可用于控制植物病害，已分離得到的一些內(nèi)生放線菌菌株，多數(shù)對引起植物病害的真菌具有抗菌作用。從小麥中分離到的38株內(nèi)生放線菌，大部分對小麥病原菌Gaeumannomyces graminis var. tritici表現(xiàn)出抑制活性 [6]。從1株野生的烈香杜鵑中分離到的Streptomyces sp. R-5，對杜鵑花屬植物的2種主要的病原真菌Phytophthora cinnamomi、Pestalotiopsis sydowiana具有拮抗活性，對革蘭氏陽性細菌、酵母菌和絲狀真菌也具有廣泛的抗菌性，可產(chǎn)生actinomycin X2和fungichromin [7-8]。從香蕉中分離得到的Streptomyces sp. S96可增強植物對香蕉鐮刀菌萎蔫病的抗性，促進植物的生長 [9]。此外，從植物內(nèi)生放線菌中篩選的生防菌及其分泌的抗菌素在植物各種病害中均取得了良好的防治效果 [10]。地球上植物種類繁多，從豐富的植物宿主中尋找新內(nèi)生菌菌種資源的機率較高 [11]。而植物內(nèi)生放線菌可作為進一步篩選生物活性物質(zhì)的種質(zhì)資源，因此，植物內(nèi)生放線菌研究有著廣闊的發(fā)展前景和重要的研究意義。

核桃（Juglans regia）是我國栽培歷史悠久的經(jīng)濟樹種之一，在全國20多個省（市、區(qū)）均有栽培。在云南省楚雄，核桃是極為重要的經(jīng)濟作物，2001年大姚被國家林業(yè)局授予“中國核桃之鄉(xiāng)”。但隨著核桃的大面積種植，核桃病害的危害日趨嚴重，如由真菌引起的枝枯病、腐爛病、潰瘍病等對核桃品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生了較大影響。因此，通過對生長于云南楚雄的核桃內(nèi)生放線菌進行研究，旨在為核桃內(nèi)放線菌資源分析、防治核桃病害提供一定的理論依據(jù)，有助于核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為取自楚雄不同地區(qū)無病斑、無蟲害的健康核桃樹的根、莖、葉。

1.2 分離培養(yǎng)基

內(nèi)生菌分離培養(yǎng)基：TWYE培養(yǎng)基（0.25 g yeast extract，0.5 g KH2PO4，1 L蒸餾水，15 g 瓊脂），琥珀酸鈉培養(yǎng)基（2 g琥珀酸鈉，0.3 g KH2PO4，0.1 g MgSO4·7H2O，1 g CaCO3，001 g FeSO4·7H2O，15 g 瓊脂，1 L ddH2O，pH值7.2），蘋果酸鈉培養(yǎng)基（0.6 g蘋果酸鈉，0.2 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，0.6 g CaCO3，0.3 g KH2PO4，0.5 g KNO3，15 g 瓊脂，1 L ddH2O，pH值7.2），纖維素培養(yǎng)基（0.5 g纖維素，0.5 g Na2HPO4，3 g yeast tract，0.05 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，3 g KNO3，2 g CaCO3，15 g瓊脂，1 L ddH2O），ISP5培養(yǎng)基[1 g L-天門冬氨酸，10 g甘油，1 g K2HPO4，1 mL 微量鹽（0.1 g FeSO4·7H2O，0.12 g MnSO4，0.1 g ZnSO4，100 mL 蒸餾水），pH值7.0～7.4，20 g瓊脂，1 L蒸餾水]。

使用高氏Ⅰ號培養(yǎng)基（20 g可溶性淀粉，1 g KNO3，0.5 g NaCl，0.5 g K2HPO4，0.5 g MgSO4，0.01 g FeSO4，pH值7.0～7.4，20.0 g瓊脂，1 L蒸餾水）富集培養(yǎng)。

1.3 指示菌

擬盤多毛孢（Pestalotiopsis spp.）、鏈格孢（Alternaria spp.）、德氏孺孢（Drechslera spp.）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、疫霉（Phytophthora spp.）。

1.4 菌種分離

分別選取不同核桃組織，沖洗干凈后，將根、莖、葉分別進行表面消毒（0.01% Tween 20 浸泡1 min→ 70%乙醇溶液處理2 min→無菌去離子水洗4～5次→有效氯含量為5%的次氯酸鈉浸泡5 min→硫代硫酸鈉溶液浸泡10 min→無菌去離子水洗4～5次）。取0.5 mL最后一遍清洗植物樣品的水涂布于TSA 固體培養(yǎng)基（15 g酪蛋白胨，5 g大豆蛋白胨，5 g NaCl，15 g瓊脂，pH值7.2）上，28 ℃條件下培養(yǎng)1周，檢測表面消毒效果。將表面消毒的植物組織打碎，均勻接種于分離培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3周，至組織塊上出現(xiàn)內(nèi)生放線菌菌絲后，挑取菌絲用TWYE培養(yǎng)基進行劃線純化，純化的菌株移入高氏Ⅰ號 [12]斜面中培養(yǎng)后保存。

1.5 DNA提取和16S rRNA 基因擴增

組DNA采用螯合樹脂法（chelex）提取分離放線菌菌株DNA [13-15]。擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 PA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；PB：5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，54 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 擴增產(chǎn)物測序

16S rRNA基因擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，用ABI 3730 DNA Sequencer （applied biosystems）測序。測序引物：P1：5′-CGGAATTATTGGGCGTA-3′； P2：5′-CCTTACCTGGGCTTGACAT-3′；P3：5′-CCTTACCTGGGCTTGACAT-3′。

1.7 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

將測得的序列利用Eztaxon Server 2.1 在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，選取同源性高的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象。采用MEGA 4軟件進行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.8 內(nèi)生放線菌的形態(tài)特征

采用搭片法觀察分離菌株顯微形態(tài)特征 [14]，根據(jù)菌株菌落和菌絲形態(tài)特征排除重復(fù)菌株。

1.9 分離菌株生長特性試驗

1.9.1 生長溫度

使用高氏Ⅰ號平板，接種后分別在4 ℃、10 ℃、15 ℃、室溫（約22 ℃）、28 ℃、37 ℃、45 ℃、55 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d觀察記錄1次，連續(xù)培養(yǎng)1周，重復(fù)1次。

1.9.2 生長鹽濃度

別配制含0、3%、5%、7%、10%、15%NaCl的高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基，接種后在28 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d觀察記錄1次，連續(xù)培養(yǎng)1周，重復(fù)1次。

1.9.3 生長pH值

使用高氏Ⅰ號培養(yǎng)基加入相應(yīng)緩沖劑，分別配制pH值4.0～5.0、6.0～8.0、9.0～10.0、11的液體培養(yǎng)基，接種后于28 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d觀察記錄1次，連續(xù) 培養(yǎng)10 d，重復(fù)1次。緩沖液配方：pH值4.0～5.0，0.1 mol/L 檸檬酸- 0.1 mol/L 檸檬酸鈉；pH值6.0～8.0，0.1 mol/L KH2PO4+0.1 mol/L NaOH；pH值9.0～10.0，0.1 mol/L NaHCO3+0.1 mol/L Na2CO3；pH值11，0.05 mol/L Na2HPO4+0.1 mol/L NaOH。

1.10 分離菌株的抗菌活性篩選

1.10.1 分離菌株發(fā)酵

選取18個放線菌菌株接種于高氏液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 d，發(fā)酵液用乙酸乙酯浸提48 h，高速離心，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入無菌水制成發(fā)酵樣品。

1.10.2 指示菌的活化及培養(yǎng) 將擬盤多毛孢、鏈格孢、德氏孺孢、灰葡萄孢和疫霉5種指示菌菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)4～6 d，活化，用于抑菌試驗?；罨玫牟≡臃N于PDA 液體培養(yǎng)基，在28 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.10.3 抑菌試驗

取200 μL菌液加入PDA培養(yǎng)基制成含菌平板，采用濾紙片法進行抑菌試驗，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈的直徑，以兩性霉素溶液40 g/mL為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基的分離效果

核桃根、莖、葉組織接入5種不同培養(yǎng)基中，共得到42株內(nèi)生放線菌，其中從葉中分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，共19株，占分離菌株總數(shù)的45.2%；其次為莖，分離到12株，占28.7%；根部分離到的菌株最少，僅為11株，占26.1%（表1）。對核桃不同器官進行內(nèi)生放線菌分離的結(jié)果為：從葉中分離的最多，其次為莖，根中分離的最少。

植物根、莖、葉組織塊分別接入5種不同培養(yǎng)基中，在纖維素培養(yǎng)基中分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，分離到13株；其次是TWYE培養(yǎng)基和蘋果酸鈉培養(yǎng)基，ISP5培養(yǎng)基分離效果較差。由試驗結(jié)果可得，5種培養(yǎng)基中，纖維素培養(yǎng)基最適合分離植物內(nèi)生放線菌，TWYE培養(yǎng)基和蘋果酸鈉培養(yǎng)基次之，最不適宜分離植物內(nèi)生放線菌的是ISP5培養(yǎng)基。

2.2 生長溫度

在不同溫度下，核桃內(nèi)生放線菌生長的情況不同，所有分離菌株在28 ℃下均可觀察到生長現(xiàn)象，而在4 ℃、10 ℃、15 ℃、室溫、37 ℃、 45 ℃下僅有部分菌株生長，而在55 ℃條件下分離的菌株均不生長。因此，在28 ℃最適宜下菌株生長，這可能與核桃生長的環(huán)境溫度為28 ℃左右有關(guān)。

2.3 生長鹽濃度

核桃內(nèi)生放線菌分離株在不同NaCl濃度下，生長的情況不同。核桃內(nèi)生放線菌在含3%、5%、7%NaCl的高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上均可觀察到生長現(xiàn)象，在含10%、15%NaCl的培養(yǎng)基中則不能觀察到生長現(xiàn)象；在不含NaCl的培養(yǎng)基中，所有放線菌分離菌株均生長最為旺盛，所有分離菌株在含3%NaCl的培養(yǎng)基上生長也較好。42個分離菌株中，有2個分離菌株不能在含5%NaCl的培養(yǎng)基上生長，有4個分離菌株不能在含7%NaCl的培養(yǎng)基上生長。菌株RA7和L8號菌耐受的NaCl濃度范圍較狹窄，僅可以在3%及以下的NaCl濃度下生長。其次是菌株SA8和菌株R9，僅能在3%、5%NaCl濃度下生長。以上結(jié)果表明，核桃內(nèi)生放線菌生長NaCl濃度范圍是3%～7%，在不含NaCl條件下最適合核桃內(nèi)生放線菌的生長。在一定生長鹽濃度范圍內(nèi)，其生長隨NaCl濃度升高而受抑制，高鹽環(huán)境可抑制核桃內(nèi)生放線菌的生長。

2.4 生長pH值范圍

本試驗結(jié)果表明，在不同pH值條件下，核桃內(nèi)生放線菌生長情況各不相同。在pH值6.0～8.0條件范圍內(nèi)，所有試驗菌株都生長旺盛，在pH值9.0～10.0時，有28株生長，占66%；在pH值4.0～5.0時，大部分試驗菌株未觀察到生長現(xiàn)象，僅有4株菌生長，占所有菌株的9.5%；在pH值11.0時，無菌株生長。因此，pH值6.0～8.0為核桃所有內(nèi)生放線菌分離株的最適生長pH值范圍，過高pH值環(huán)境和過低pH值環(huán)境均抑制其生長。

2.5 16S rRNA系統(tǒng)分析

根據(jù)菌株形態(tài)特征，選取22個菌株提取組DNA，進行16S rRNA PCR擴增，擴展產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將測出有效序列用Blast程序與GenBank 中相關(guān)屬種的16S rRNA序列比對，初步判定菌株的類群，結(jié)果顯示22個測序放線菌菌株均屬于鏈霉菌屬，分別與鏈霉菌屬16個有效發(fā)表種的序列同源性最高（表2），這說明鏈霉菌屬是核桃內(nèi)生放線菌中的優(yōu)勢菌群。

2.6 核桃內(nèi)生放線菌抑菌效果

由表3可知，18株分離自核桃的內(nèi)生放線菌中，有13株菌株對德氏孺孢的生長有抑制作用，所占百分比為72.2%；其中，有2株菌株對德氏孺孢的生長有較強抑制作用，占檢測菌株的11.1%；分離自核桃莖的菌株SA8對德氏孺孢的生長有明顯抑制效果，因此菌株SA8可進一步研究，應(yīng)用于防治德氏孺孢引起的植物病害。18株內(nèi)生放線菌菌株中，有11株菌對鏈格孢生長有抑制作用，占檢測菌株的61.1%；其中，有6株菌株對鏈格孢的生長有較為明顯的抑制效果，占檢測菌株的33.3%；菌株SA8和LA17對鏈格孢生長的抑制作用最為明顯。有9株菌株對灰葡萄孢的生長有抑制作用，占檢測菌株的50%；其中，有2株菌株對灰葡萄孢生長的抑制效果較為明顯，占檢測菌株的11.1%；有9株試驗菌株對擬盤多毛孢的生長有抑制作用，占檢測菌株的50%；其中，菌株SA8對擬盤多毛孢生長有較強的抑菌效果。有9株試驗菌株對疫霉的生長有抑制作用，占檢測菌株的50%；其中，菌株SA8對疫霉生長有較強的抑菌效果。

檢測的內(nèi)生放線菌中，有4株菌株對德氏孺孢、鏈格孢、灰葡萄孢、疫霉、擬盤多毛孢這5種病原菌均有抑制作用，占檢測菌株的22.2%；有2株菌株對4種病原菌有抑制作用，占檢測菌株的11.1%；有4株菌株對3種病原菌有抑制作用，占檢測菌株的22.2%；有4株菌株對2種病原菌有抑制作用，占檢測菌株的22.2%；有3株菌株對1種病原菌有抑制作用，占檢測菌株的16.7%；有1株菌株對所有病原菌均無抑制作用。試驗菌株SA8對5種病原菌均有明顯抑制作用。

比較從核桃不同器官中分離到的內(nèi)生放線菌發(fā)現(xiàn)，植物不同部位分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量、種類均差異較大。從 核桃不同器官中分離到的內(nèi)生放線菌數(shù)量從多到少依次為葉> 莖>根。這表明植株葉內(nèi)的內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，而從根部獲得的內(nèi)生放線菌數(shù)量最少。這可能是由于根部分布細菌較多，影響了內(nèi)生放線菌的分離，內(nèi)生放線菌的分布規(guī)律還須要進一步結(jié)合免培養(yǎng)法進行研究。

從不同分離培養(yǎng)基對核桃內(nèi)生放線菌的分離效果看，不同培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量和類群各不相同。在5種分離培養(yǎng)基中，纖維素培養(yǎng)基的分離效果最好，分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，種類也最豐富；ISP5培養(yǎng)基的分離效果最差，蘋果酸鈉培養(yǎng)基與TWYE培養(yǎng)基分離效果相近。這可能是由于纖維素在植物體內(nèi)的含量豐富，對核桃內(nèi)生放線菌的生長有一定的促進作用。蘋果酸鈉培養(yǎng)基和TWYE培養(yǎng)基的有機物含量均較少，營養(yǎng)較為貧瘠，可在一定程度抑制細菌的生長，有利于分離內(nèi)生放線菌，因此分離效果尚可。而ISP5培養(yǎng)基營養(yǎng)較為豐富，細菌生長迅速，因此不利于分離內(nèi)生放線菌。在本研究中所用的琥珀酸鈉培養(yǎng)基有機物含量也較少，但分離效果不理想，不適合核桃內(nèi)生菌的分離。

生長特性試驗結(jié)果表明，多數(shù)分離菌株的生長溫度范圍是15～45 ℃，最適生長溫度是28 ℃；生長NaCl濃度范圍是 0～7%，在不含NaCl時生長最好；生長pH值范圍是6.0～100，最適范圍是pH值6.0～8.0，因而核桃內(nèi)生放線菌的生長特性與多數(shù)土壤放線菌類似。

對試驗菌株的16S rRNA 基因進行PCR擴增、測序，序列分析結(jié)果表明，分離菌株與鏈霉菌屬多個有效發(fā)表種序列相似性較高，因此，從核桃分離到的內(nèi)生放線菌均為鏈霉菌屬的菌株，鏈霉菌是核桃的優(yōu)勢放線菌類群。

灰葡萄孢菌能引起蔬菜、瓜果、花卉等作物的灰霉病、腐爛病和霉爛病。20世紀70年代以來人們相繼采用多種殺菌劑控制此病菌的危害，但由于該病菌的遺傳變異大、適應(yīng)性強，已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性 [16-17]，因此該病害的防治沒有得到徹底的根治，篩選生防菌進行生物防治的研究日趨必要。本研究的抑菌試驗結(jié)果表明，RA9和SA8菌株對灰葡萄孢的生長有較強的抑菌效果，可作為灰葡萄孢引起的植物病害的生防菌，但其抑菌成分及機制還應(yīng)進一步研究，以便為研發(fā)安全高效的微生物農(nóng)藥和菌肥的開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

擬盤多毛孢屬在云南大理州對核桃的葉、花、枝和果產(chǎn)生嚴重危害，影響核桃生長和產(chǎn)量 [18]。目前，對擬盤多毛孢引起的植物病害的防治仍主要采用傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治。疫霉屬可誘發(fā)許多植物病害，但該病菌生理分化明顯、遺傳變異迅速，現(xiàn)有措施難以完全有效控制該病。本研究結(jié)果表明，分離菌株SA8對擬盤多毛孢和疫霉的生長具有明顯的抑制作用，因此可作為研發(fā)安全高效的微生物農(nóng)藥的菌種資源。

鏈格孢屬主要引起核桃的頂端壞死病、褐斑病和黑斑病等 [19]。針對這些病害采取多種防治方法，德氏孺孢能引起許多植物病害如離孺孢葉枯病、彎孢霉葉枯病、德氏霉葉枯病、葉斑病等 [20]。本研究從核桃內(nèi)生組織中分離出的SA8和YA17菌株對鏈格孢和德氏孺孢的生長具有明顯的抑制作用，可為核桃病害的生物防治研究提供菌種資源。

本研究結(jié)果表明，核桃內(nèi)生放線菌數(shù)量豐富；核桃不同部位的內(nèi)生放線菌在數(shù)量、類群分布和優(yōu)勢類群方面存在較大差異，這可能與核桃不同部位組織不同，微生態(tài)環(huán)境不同有密切關(guān)系。同時用不同分離培養(yǎng)基分離得到的核桃內(nèi)生放線菌類群、數(shù)量及其優(yōu)勢類群都具有較為明顯的差異。這說明不同分離培養(yǎng)基可選擇性分離不同的內(nèi)生放線菌，同時也說明通過進一步改進分離技術(shù)有可能獲得更多的可培養(yǎng)內(nèi)生放線菌。部分分離菌株對多種常見植物病原真菌具有拮抗活性，分離自核桃莖的內(nèi)生放線菌菌株SA8對本研究中檢測的5種指示菌均具有明顯的拮抗活性，在植物病害的生物防治方面具有較大的開發(fā)潛力。菌株SA8的16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，其與有效發(fā)表種Streptomyces yokosukanensis NRRL B-3353T的關(guān)系最近，序列同源性為98.65%，其具體分類地位還須要進一步研究。

[JP3]植物內(nèi)生放線菌在新型農(nóng)用抗生素的研究方面具有較大開發(fā)潛力，本研究結(jié)果表明，從核桃內(nèi)生放線菌分離株中篩選到具有開發(fā)潛力的活性菌株的概率較高。因此，內(nèi)生放線菌資源可作為生防菌株篩選和新生物活性物質(zhì)研究的重要微生物資源。

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