楊李玲+陳宇豐+周登博+高祝芬+黃綿佳+張錫炎

摘要：從我國云南地區(qū)采集藥用植物密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）植株為樣品，采用稀釋涂布平板法進行內(nèi)生放線菌的分離，以香蕉枯萎病菌4號小種為靶標(biāo)菌，通過平板對峙試驗，篩選出對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制作用最強的生防菌株2株，通過形態(tài)觀察、生理生化特性比對并結(jié)合 16S rDNA 序列分析對這2種菌株進行鑒定，采用濾紙片擴散法測定其內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物對感病香蕉的抑菌活性。結(jié)果表明：經(jīng)鑒定DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1 菌株為Streptomyces celluloflavus（纖維黃鏈霉菌），這2種菌株對香蕉枯萎病菌菌絲抑制率分別為 5446%、 7012%。所分離的菌株對多種植物病原真菌均有抑制效果，為無環(huán)境公害型微生物資源的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：密毛山梗菜；內(nèi)生放線菌；香蕉枯萎菌；鑒定；次生代謝產(chǎn)物；抗菌活性

中圖分類號： S436.68+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0199-04

密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）為半邊蓮科半邊蓮屬植物，民間用于治療腮腺炎、跌打損傷、風(fēng)濕痛、疹癥，全草或根、葉（有毒）藥用，分布于云南西南部至南部。其提取物中分離的齊墩果酸存在于許多中草藥中，生理活性較為廣泛，對其結(jié)構(gòu)修飾后合成的齊墩果酸磷酸醋單鈉，經(jīng)體外藥理試驗證實，其抗腫瘤活性比齊墩果酸高5倍[1-2]。

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，簡稱Foc）侵染而引起的危害香蕉生產(chǎn)的毀滅性土傳真菌病害，該病可導(dǎo)致植物莖葉萎蔫，嚴(yán)重時整株枯死，是世界上分布最廣、危害最大、造成損失最嚴(yán)重的植物土傳病害之一[3]。為了減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用，應(yīng)用生物防治方法對香蕉枯萎病進行綜合防控已成為國內(nèi)外的研究熱點[4]。戴青冬等對抗香蕉枯萎病生防菌進行了篩選及生防效應(yīng)方面的研究[5]。胡偉等報道了添加生防菌株解淀粉芽孢桿菌的生物有機肥在不同耕作模式下對香蕉生長和香蕉枯萎病防治效果的影響，發(fā)現(xiàn)這種菌株有機肥能降低香蕉枯萎病病情指數(shù)[6]。目前防治香蕉枯萎病的生防菌株主要有以下幾大類：生防細(xì)菌、生防真菌、生防放線菌等[7-9]。本研究以云南密毛山梗菜作為試驗材料，分離出2株對香蕉枯萎病菌具有較好拮抗效果的內(nèi)生放線菌DJ15、XLG-1。通過形態(tài)觀察、生理生化特性比對并結(jié)合 16S rDNA 序列分析對該菌株進行鑒定，對其進行抗菌活性和次級代謝產(chǎn)物活性進行研究，為其今后應(yīng)用于香蕉枯萎病的防治提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品采集密毛山梗菜植株樣品采集于云南省西雙版納植物園（地理位置109°51′17″E、19°47′1″N），樣品分為根、莖、葉3份，采集后混勻，置于無菌封口袋中，封口，放入冰盒中保存，帶回實驗室在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌DNA 提取試劑盒，北京博邁德生物公司生產(chǎn)的Taq DNA聚合酶，愛思進生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒；引物合成、測序由華大基因完成。

1.1.3供試病原菌本研究篩選拮抗菌所用病原菌為香蕉枯萎病菌4號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）。放線菌多抗性測試病原菌有香蕉長形斑病原菌（Curvularia fallax）、香蕉大灰斑病原菌（Curvularia lunata）、香蕉炭疽病原菌（Colletotrichum musae）、草莓炭疽病原菌（C. fragariae）、辣椒炭疽病原菌（C. acutatum）、膠孢炭疽病原菌（C. gloeosporioides）、香蕉樹木潰瘍病原菌（Botoryosphaeria dothidea）、貢蕉煙頭病原菌（Fusarium spp.）、香蕉葉緣枯斑病原菌（Alternaria musae）。此外，還有灰葡萄孢菌病原菌（Botrytis cinerea）等。菌源均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供。

1.1.4供試培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基進行分離，滅菌后在1 L培養(yǎng)基中加入3 mL經(jīng)過過濾除菌處理的1%重鉻酸鉀溶液、0.5 mL 5%制霉菌素；采用酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基純化菌株、保藏，同時進行形態(tài)觀察；采用PDA培養(yǎng)基進行平板對峙培養(yǎng)；采用酵母膏麥芽膏（YE）液體培養(yǎng)基進行菌株發(fā)酵。

1.2內(nèi)生放線菌的分離

具體分離方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.3拮抗放線菌的篩選

具體篩選方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.4菌株鑒定

1.4.1形態(tài)與培養(yǎng)特征觀察具體方法參照文獻(xiàn)[12-14]。

1.4.2生理生化特征具體方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.4.3系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取樣品DNA；采用細(xì)菌通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3′）進行16S rDNA的PCR擴增；產(chǎn)物純化后測定基因序列；采用EzTaxon與GenBank搜索序列相似性，選取相似性最高的模式菌序列，用MEGA5.0中的鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）法比較同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5菌株抗菌活性評價

1.5.1平板對峙對病原菌的拮抗作用將拮抗放線菌與香蕉炭疽病菌等11種病原真菌于28 ℃對峙培養(yǎng)7～14 d，以不接拮抗菌的平板為對照，每個處理3次重復(fù)，以抑菌帶寬度來衡量菌株對病原真菌的抑制作用。

1.5.2混合菌液對病原菌的拮抗作用以及對病原菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)的抑制作用具體方法參照文獻(xiàn)[16-17]。

1.5.3次生代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用具體方法參照文獻(xiàn)[18-19]。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12軟件進行方差分析及多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1放線菌的分離與篩選

根據(jù)分離的菌株在純化培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顏色去重，獲得126株放線菌；經(jīng)過平板對峙培養(yǎng)法篩選后，得到產(chǎn)生抑菌圈最大的2株放線菌，分別編號為DJ15、XLG-1。

2.2菌株DJ15、XLG-1的分類鑒定

2.2.1形態(tài)特征菌株DJ15的基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)、不斷裂，氣生菌絲多分枝，孢子絲波曲狀，孢子呈橢圓形，表面光滑。

2.2.2培養(yǎng)特征菌株DJ15、XLG-1在供試的7種培養(yǎng)基上生長良好，其菌落形態(tài)特征見表1。

2.2.4系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征將所獲得的DJ15、XLG-1菌株的16SrDNA序列通過EzTaxon與GenBank上登錄的序列進行基因序列相似性比對，得到21株分別與菌株DJ15、XLG-1同源性最高、已定名的模式菌的序列信息，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，可見DJ15菌株與Streptomyces yatensis NBRC 101000T （AB249962）同源性最高，可達(dá)99.96%；XLG-1菌株與Streptomyces kasugaensis M338-M1T （AB024441）、Streptomyces celluloflavus NRRL B-2493T （JOEL01000102）2株菌同源性最高，均為99.09%，且均處于同一分支。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征比對，鑒定DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1菌株為Streptomyces celluloflavus（纖維黃鏈霉菌）。

2.3菌株抗菌活性評價

2.3.1菌株抑菌譜測定平板對峙試驗結(jié)果（表3） 表明，菌株DJ15、XLG-1抑菌效果較廣，對供試的11種植物病原真菌菌絲的抑制率均超過50%，具有較好的抑制效果。2種菌株對病原真菌抑制作用中，XLG-1對貢蕉煙頭病原菌的抑制率為74.99%，抑菌帶寬度達(dá)到2.16 cm，抑制作用最強。除了DJ15對香蕉長形斑病原菌、灰葡萄孢菌原菌、草莓炭疽病原菌及香蕉炭疽病原菌的抑菌帶寬度小于1.5 cm， 其余的

2.3.2次生代謝產(chǎn)物對分生孢子萌發(fā)的抑制作用菌株DJ15、XLG-1不同濃度的發(fā)酵液對香蕉枯萎病菌4號小種分生孢子的萌發(fā)具有不同程度的抑制作用，發(fā)酵液原液的抑制率最高，10%發(fā)酵液抑制率則最低，發(fā)酵濾液濃度增加至50%時，病原菌孢子的裂解增加（表4），說明隨著拮抗菌發(fā)酵濾液濃度增加，濾液對病原菌孢子的生長抑制作用也增強。

2.3.3次生代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用菌株DJ15、XLG-1的發(fā)酵產(chǎn)物對11種供試植物病原真菌都有較好的抑制效果（表5）。其中DJ15對香蕉樹木潰瘍病原菌的抑制作用最強，抑菌帶寬度達(dá)到2.11 cm；XLG-1對貢蕉煙頭病原菌的抑制作用作用最強，抑菌帶寬度達(dá)到2.62 cm；2種菌株對香蕉枯萎病4號小種均有較強的抑制作用，抑菌帶寬無明顯差異性，分別為1.99、2.40 cm。

3討論和結(jié)論

隨著人們對生態(tài)環(huán)境的日益重視，目前利用生防菌防治香蕉枯萎病病害已是國內(nèi)外學(xué)者研究的重要內(nèi)容，但是由于微生物定殖能力不強，容易受濕度、溫度、化學(xué)農(nóng)藥和其他環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致生物防治的效果不穩(wěn)定，從而限制了微生

戴青冬等通過對香蕉進行施用BLG01、BDF11與有機液肥的試驗，篩選出高效生防枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis BLG01和BDF11，這2種菌株對香蕉枯萎病病原菌的抑制率最高可達(dá)77%[5]。然而從植株內(nèi)尤其是藥用植物內(nèi)分離篩選出的微生物用于香蕉枯萎病的防治卻鮮有報道。本研究中，從藥用植物密毛山梗菜中分離篩選鑒定出的菌株，對香蕉枯萎病菌在內(nèi)的11種病原菌具有廣譜抗性，特別是對香蕉枯萎病菌菌絲生長抑制率分別達(dá)54.46%、70.12%，抑制效果良好。原因可能是這些生防菌能抑制病原菌，降低土壤中的尖孢鐮刀菌數(shù)量，使病害得到了有效控制[5]。由于內(nèi)生菌生長于植株內(nèi)，不易受外界環(huán)境影響，具有可以在植物體內(nèi)定殖和運轉(zhuǎn)的特殊性質(zhì)[25]，按照內(nèi)共生理論，內(nèi)生菌可能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，因此從藥用植物中分離具有抗菌活性放線菌，成為病害生物防治中具有潛力的微生物農(nóng)藥。

譚力等通過對銀杏內(nèi)生放線菌進行研究，發(fā)現(xiàn)由分離、篩選得到具有抑菌作用的菌株KLBMP 5501為淺紫鏈霉菌Streptomyces violascens[20]。本研究從密毛山梗菜體內(nèi)分離到2株對香蕉枯萎病菌4號小種拮抗作用較強的菌株DJ15、XLG-1，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA 序列分析，鑒定出DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1菌株為纖維黃鏈霉菌（Streptomyces celluloflavus），目前還未發(fā)現(xiàn)2株菌應(yīng)用于土傳病害防治方面的報道。同時該菌株發(fā)酵濾液對香蕉枯萎病菌4號小種的孢子萌發(fā)抑制率隨著稀釋濃度變化而變化，其中原液對香蕉枯萎病菌4號小種的孢子萌發(fā)抑制率最大，分別為84.44%、89.10%，表明該菌株的次生代謝產(chǎn)物含有抑菌物質(zhì)，值得對DJ15、XLG-1菌株在植物病害的防治、抗生素的分離純化及其抑菌機理等方面進行深入研究。目前，從密毛山梗菜中分離得到的內(nèi)生放線菌應(yīng)用于防治植物病害的研究尚未見報道，因此開展對DJ15、XLG-1菌株在植株體內(nèi)定殖、田間應(yīng)用、次生代謝產(chǎn)物的分離、生防菌劑的研制等方面作深入研究具有一定的實踐意義，為進一步優(yōu)化提高抑菌活性以及后期大田生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

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