張浩鵬，張麗君，紀(jì) 琴，侯少華，常 鑫，李 海

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兗州院區(qū)呼吸內(nèi)科，濟(jì)寧 272000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，銀川 750004）

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲以及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移是癌癥惡性潛能的特征，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因[1]，大約15%的結(jié)直腸癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移后，其平均生存時(shí)間不到3 年[2]。腫瘤微環(huán)境可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[3]，來(lái)自原發(fā)性腫瘤的機(jī)械應(yīng)力可誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化的相鄰細(xì)胞群中的致瘤信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤增加。同時(shí)，生物力學(xué)可以通過(guò)在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中誘導(dǎo)間充質(zhì)樣開(kāi)關(guān)來(lái)驅(qū)動(dòng)腫瘤攻擊，使它們獲得腫瘤起始特性[4]。Piezo2 作為機(jī)械力活化的離子通道，將機(jī)械應(yīng)力-細(xì)胞內(nèi)信號(hào)-癌癥緊密地聯(lián)系在一起，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究主要通過(guò)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116 細(xì)胞的Piezo2 表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)兩種細(xì)胞在干預(yù)前后增殖、遷移、侵襲能力的變化。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

NCM460（人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系）、SW480（原發(fā)結(jié)腸腺癌細(xì)胞系）、HCT116（原位腸癌細(xì)胞系）和SW620（結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞系）均購(gòu)于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），McCoy’s 5A 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），蛋白含量檢測(cè)試劑盒、凱基全蛋白提取試劑盒、彩色蛋白Maker（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（BI 公司），PVDF 膜（美國(guó)密理博公司），Transwell 小室（CORNING 公司），ki67 抗體（Abcam 公司），重組慢病毒LV-Piezo2-RNAi、陰性對(duì)照病毒CON313、HiTransGP 病毒感染試劑（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技有限公司），Trizol 試劑（美國(guó)賽默飛公司），反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒（天根生化科技北京有限公司），Piezo2 及GAPDH 引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，GAPDH 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），Piezo2 抗體（Abcam 公司）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（ABclonal 公司）、Western blot 高敏型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

陰性對(duì)照組（LV-NC）為陰性慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染敲低組（LV-shPiezo2）為慢病毒敲低Piezo2 的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)癌組織及癌旁組織Piezo2 的mRNA 表達(dá) 使用Trizol 試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用SYBRTMGreen Mix 試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，引物序列為：Piezo2：正向：5’－ ATGGCCTCAGAAGTGGTGTG－3’，反向：5’－ATGTCCTTGCATCGTCGTTTT－3’；GAPDH：正向：5’－AATGGACAACTGGTCGTGGAC－3’，反 向：5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG－3’。反應(yīng)條件為：在PCR 儀中預(yù)變性10 min、95 ℃1 個(gè)循環(huán)，然后95 ℃15 s，62 ℃30 s 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算采用2-ΔΔCt 法。

1.3.2 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌組織及癌旁組織Piezo2 的蛋白表達(dá) 取組織或者細(xì)胞，RIPA裂解液提取蛋白后用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取40 μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入稀釋后一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入稀釋后二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，滴加高敏ECL 化學(xué)發(fā)光液后于化學(xué)發(fā)光儀下曝光拍照，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 Piezo2 敲低慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116 和SW620 細(xì)胞 按照慢病毒轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將HCT116 細(xì)胞和SW620 細(xì)胞密度調(diào)整至3×104個(gè)/mL，取500 μL 加入24 孔板，細(xì)胞密度在20%～30%時(shí)加入對(duì)應(yīng)感染復(fù)數(shù)（MOI）的慢病毒，轉(zhuǎn)染Piezo2 敲低慢病毒和對(duì)照空載慢病毒于HCT116細(xì)胞和SW620 細(xì)胞中，然后用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染敲低Piezo2 的HCT116 細(xì)胞和SW620 細(xì)胞，進(jìn)而得到穩(wěn)定敲低的HCT116 和SW620 細(xì)胞。

1.3.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 在96 孔板中加入100 μL（細(xì)胞量約為7 000 個(gè)）的HCT116、SW620 細(xì)胞懸液。培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（在37 ℃，5%CO2的條件下）。細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間（0、6、12、24、48、60、72 h）分別加入10 μL 的CCK-8 溶液，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的光密度（OD）值。

1.3.5 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 提前將用不含血清的McCoy’s 5A 和Leibovitz’sL-15 培養(yǎng)基稀釋的matrigel 膠（1 mg·mL-1）鋪到小室上層底部，將轉(zhuǎn)染前后HCT116 和SW620 細(xì)胞，用不含血清的McCoy’s 5A 和Leibovitz’sL-15 培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整至濃度為1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，向24 孔Transwell 小室的上層加入200 μL細(xì)胞懸液。隨后向小室下層加入500 μL 含有10%FBS 的McCoy’s 5A 和Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h。小室從培養(yǎng)箱取出，吸凈小室上下層的培養(yǎng)基，用干凈棉簽以適當(dāng)力度擦去Transwell 上層小室內(nèi)殘留的基質(zhì)膠、細(xì)胞，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，水分風(fēng)干后顯微鏡拍照并使用Image J 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取LV-NC 組和LV-shPiezo2 組的HCT116 和SW620細(xì)胞，按5×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于6 孔板中，每孔1 mL，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用100 μL 移液槍頭對(duì)6 孔板進(jìn)行劃痕，PBS 清洗后加入相應(yīng)的McCoy’s 5A 和Leibovitz’s L-15 無(wú)血清培養(yǎng)基，按時(shí)間點(diǎn)0、24 h 進(jìn)行拍照，使用Image J 圖像分析軟件比較細(xì)胞劃痕的間距。

1.3.7 裸鼠皮下移植瘤模型制備及其增殖能力檢測(cè) 選用3 周齡的BALB/c-Nude 裸鼠，待裸鼠適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的未處理的以及分別轉(zhuǎn)染敲低Piezo2 和空載慢病毒的HCT116 和SW620 細(xì)胞，常規(guī)消化并計(jì)數(shù)，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×107個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液置于冰上待用。用1 mL 注射器抽取0.2 mL（2×106個(gè)細(xì)胞）皮下接種于一側(cè)腋下，接種后每周3 次觀察，并記錄腫瘤的大小和質(zhì)量，直至第3 周腫瘤大小成型后處死裸鼠并測(cè)量腫瘤體積和質(zhì)量。

1.3.8 免疫組織化學(xué)法 檢測(cè)皮下腫瘤中ki67表達(dá)。裸鼠皮下移植瘤，石蠟包埋固定，切片，烤片3 h 脫蠟、脫水，檸檬酸鹽高壓修復(fù)后3%H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封閉后滴加一抗ki67（1∶300）工作液，4 ℃下孵育過(guò)夜，抗鼠二抗孵育1 h，蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、清水反藍(lán)，脫水，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，于Leica 正置顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 和GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件作圖。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：ki67 染色標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞核出現(xiàn)清晰棕色或棕褐色、棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Image J 和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析繪圖，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用Student’s t-test、單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 在人結(jié)直腸癌組織中Piezo2 高表達(dá)、癌旁組織中低表達(dá)

通過(guò)RT-qPCR 及Western blot 實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中Piezo2 的mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示,癌組織Piezo2 的mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（P 均＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 RT-qPCR 與Western blot 檢測(cè)人結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的Piezo2 表達(dá)

2.2 Piezo2 蛋白在NCM460、SW480、HCT116 和SW620 中的表達(dá)情況

Piezo2 蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480、HCT116 和SW620）中的表達(dá)高于癌旁上皮細(xì)胞（P 均＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot 檢測(cè)NCM460、SW480、SW620、HCT116 細(xì)胞的Piezo2 蛋白表達(dá)（n=3）

2.3 Piezo2 敲低慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116 和SW620細(xì)胞系

為了進(jìn)一步研究Piezo2 在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，選擇以上篩選的HCT116 和SW620 細(xì)胞系作為研究對(duì)象，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Piezo2 敲低慢病毒載體，利用RT-qPCR、Western blot 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HCT116 和SW620 細(xì)胞中Piezo2 的表達(dá)，結(jié)果顯示，在HCT116 與SW620 細(xì)胞內(nèi)成功敲低Piezo2，見(jiàn)圖3。

圖3 RT-qPCR 與Western blot 檢測(cè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 與SW620 的Piezo2 表達(dá)

2.4 敲低Piezo2 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與LV-NC 組相比，敲低Piezo2 的LV-shPiezo2 組的HCT116 和SW620細(xì)胞的增殖均被抑制（P 均＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 CCK-8 檢測(cè)敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 細(xì)胞的增殖能力

2.5 敲低Piezo2 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲

Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明，與LV-NC 組相比，敲低Piezo2 的LV-shPiezo2 組的HCT116和SW620 細(xì)胞的侵襲力被抑制（P 均＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 Transwell 檢測(cè)敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 細(xì)胞的侵襲能力

2.6 敲低Piezo2 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與LV-NC 組相比，敲低Piezo2 的LV-shPiezo2 組的HCT116 和SW620 細(xì)胞的遷移均被抑制（P 均＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 細(xì)胞的遷移能力

2.7 敲低Piezo2 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)致瘤性

將LV-NC 組與LV-shPiezo2 組的HCT116細(xì)胞、LV-NC 組與LV-shPiezo2 組的SW620 細(xì)胞分別接種至BALB/c－Nude 裸鼠一側(cè)腋下，皮下成瘤結(jié)果顯示，接種LV-shPiezo2 組細(xì)胞的小鼠腫瘤體積小于LV-NC 組，LV-shPiezo2 組腫瘤質(zhì)量少于LV-NC 組（P 均＜0.01），見(jiàn)圖7。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，接種LV-shPiezo2 組小鼠腫瘤組織中的ki67 表達(dá)低于LV-NC 組（P＜0.001），見(jiàn)圖8。

圖7 接種敲低Piezo2 的HCT116 和SW620 細(xì)胞小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較

圖8 接種敲低Piezo2 的結(jié)腸癌細(xì)胞小鼠腫瘤組織中ki67 的表達(dá)

3 討論

機(jī)械信號(hào)在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演了重要角色，其中在CRC 的侵襲轉(zhuǎn)移中機(jī)械信號(hào)Piezo2上調(diào)。結(jié)直腸癌中Piezo2 敲低后可能介導(dǎo)了Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)的衰減，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)鈣信號(hào)激活的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT1 信號(hào)通路抑制了CRC 細(xì)胞的增殖和遷移，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)。Piezo2 的高表達(dá)與癌癥增殖和血管生成有關(guān)[5]。腫瘤新血管參與腫瘤組織O2和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，清除腫瘤組織中CO2和代謝產(chǎn)物[6]。腫瘤脈管系統(tǒng)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的主要途徑之一。敲除Piezo2 后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力以及腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均下降[7]。說(shuō)明敲除Piezo2 可影響內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞功能。Piezo2 敲除后可降低膠質(zhì)瘤的血管生成和血管高通透性，抑制血管滲漏和腫瘤血管生成。敲除Piezo2 還減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）或白細(xì)胞介素-1β 介導(dǎo)的病理性血管生成，并可使胞內(nèi)Ca2+改變，Wnt11/β-catenin 信號(hào)下調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活動(dòng)發(fā)生改變[8]。

侵襲轉(zhuǎn)移為惡性腫瘤的重要特征，是引起腫瘤患者死亡的首要因素，多數(shù)癌癥患者死于轉(zhuǎn)移癌[9]。Piezo2 在多種腫瘤疾病中高表達(dá)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子的變化進(jìn)而引起結(jié)腸炎[10]，而結(jié)腸炎在結(jié)腸癌的發(fā)生中起重要作用。Piezo2 在多種腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)影響鈣離子變化進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Piezo2 的表達(dá)水平與癌癥患者的預(yù)后緊密相關(guān)，并且Piezo2 通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞功能和影響免疫相關(guān)因子在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮潛在作用[11]。Piezo2 也導(dǎo)致三陰性乳腺癌患者轉(zhuǎn)移增加和較差的臨床預(yù)后[12]。本研究驗(yàn)證Piezo2 在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，選用穩(wěn)定高表達(dá)Piezo2 的結(jié)腸癌細(xì)胞系（HCT116 和SW620）后，通過(guò)慢病毒敲低兩種細(xì)胞系的Piezo2 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都較未處理組降低。因此推測(cè)Piezo2 在腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力方面起重要作用。裸鼠皮下成瘤結(jié)果也顯示，敲低Piezo2組腫瘤體積和質(zhì)量低于未處理組。并且免疫組化檢測(cè)顯示，敲低Piezo2 后ki67 表達(dá)降低，敲低Piezo2 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)致瘤性，進(jìn)一步證明了Piezo2 對(duì)結(jié)直腸癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，但具體的產(chǎn)生機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。以上結(jié)果初步證實(shí)了本研究的猜測(cè)，也為下一步探究Piezo2 在CRC 中的分子機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

Piezo2 及其下游的信號(hào)通路可能在CRC 進(jìn)展中起重要的作用，本研究初步證明了Piezo2 調(diào)節(jié)CRC 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用，提示Piezo2可能成為臨床CRC 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物，可能是用于癌癥治療的新靶點(diǎn)，但其作用和機(jī)制還需更進(jìn)一步研究。