孫祎平，李曉玉，謝永鑫，趙 吉，孫 健，王 瑞，宋亞男，楊惠芳

（1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004）

農藥的廣泛使用可以提高農作物的產量，但在環(huán)境中的農藥殘留會對人和動物的身體健康造成很大的影響。擬除蟲菊酯因具有高效、易降解、低毒等特點，在全球范圍內都有著廣泛的應用[1]。課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，在銀川市近郊蔬菜大棚內農藥殘留中，氟氯氰菊酯的殘留量最多。氟氯氰菊酯作為重要的Ⅱ型擬除蟲菊酯類農藥，廣泛應用于衛(wèi)生害蟲防治[3]。有研究[4]顯示，擬除蟲菊酯可引起腎臟形態(tài)結構異常改變、腎功能障礙，而氟氯氰菊酯對腎臟的毒性機制尚不清楚。生長停滯和DNA 損傷誘導β（growth arrest and DNA damage-inducible 45β，GADD45B）是一種應激蛋白，與細胞周期停滯、細胞凋亡和致癌應激的反應等密切相關[5]。抑制GADD45B 可以防止蛋白尿以及減輕足細胞的損傷，從而保護腎小球[6]。在腎臟損傷過程中，MAPK 作為一條關鍵的信號通路，其中的關鍵因子p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）明顯上調[7]。GADD45B 介導JNK/p38MAPK通路在氟氯氰菊酯所致大鼠腎臟損傷中的關系尚不明確，因此，本研究旨在探討在氟氯氰菊酯誘導大鼠腎臟損傷中MAPK 通路的作用，為進一步闡明毒性機制，建立早期預防策略提供理論依據(jù)和方法。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選擇40 只Wistar 雄性大鼠，SPF 級，體質量260～280 g，購自遼寧昌盛生物技術有限公司［動物合格證號：SCXK（Liao）2015-0001］。所有大鼠飼養(yǎng)于標準動物房，飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度60%～70%，保持12 h光照（8：30～20：30）和12 h 黑暗（20：30 至次日8：30）交替循環(huán)。大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，設置對照組（玉米油），氟氯氰菊酯低劑量組（6.25 mg·kg-1）、中劑量組（12.50 mg·kg-1）和劑量組（25.00 mg·kg-1），每組10 只。對大鼠進行隔天稱重，根據(jù)前一天稱取的體質量配制染毒藥物。采用等濃度法進行灌胃染毒，對照組大鼠灌胃等量玉米油，隔天染毒，持續(xù)28 d，隨后麻醉處死大鼠，在無菌條件下收集腎臟組織，各動物處理方法均嚴格遵守中華人民共和國實驗動物操作的相關規(guī)定，本研究項目獲得寧夏醫(yī)科大學倫理委員會（IACUC-NYLAC-2021-101）批準。

1.2 主要試劑與儀器

氟氯氰菊酯（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；丙二醛（malondialde hyde，MDA）試劑盒（北京索萊寶公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白檢測試劑盒（江蘇凱基公司）；全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司）；GAPDH、GADD45B、p-p38MAPK、p-JNK、p38MAPK、JNK 抗體（中國Affinity 公司）。蛋白Marker（美國Thermo Fisher 公司）；Trizol（美國Invitrogen 公司）；引物由上海生工公司合成。

1.3 觀察指標

1.3.1 HE 染色 取出切割好的腎臟組織和對應的標簽放入脫水箱，分別在75%、85%、90%和95%的乙醇梯度中脫水1 h，在無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ中分別脫水30 min，接著放置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別脫水5 min。經(jīng)過包埋、切片、染色，用顯微鏡（×40）觀察腎臟組織的形態(tài)結構變化。

1.3.2 透射電鏡 取3 mm×1 mm×1 mm 的新鮮腎臟組織，放入4 ℃固定液中2～4 h，然后放入1%滲透壓0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中固定2 h。經(jīng)過50%→70%→80%→90%→95%→100%→100%乙醇→100%丙酮脫水，每次15 min；環(huán)氧樹脂包埋樣本；超薄切片機切60～80 nm 超薄切片；醋酸鈾染色30 min，待切片室溫干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.3.3 MDA 檢測 使用MDA 試劑盒檢測其含量，取0.1 g 腎臟組織，加入1 mL 提取液進行冰浴勻漿；8 000×g 4 °C 離心10 min，取上清，置冰上待測。根據(jù)說明書將樣本加入96 孔板中，測定各樣本在532 nm 和600 nm 處的吸光度，計算MDA 含量，實驗重復3 次。

1.3.4 SOD 檢測 稱取50 mg 組織，加入0.45 mL生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，3 000 r·min-1，離心10 min，取10%勻漿上清液冰上待測。樣本準備好后用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)說明書將樣本加入96 孔板中，測定各樣本在450 nm處的吸光度。SOD 抑制率（%）=［（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）］/（A對照-A對照空白）×100%，SOD活力（U·mg prot-1）=SOD 抑制率（%）/50%×12/待測樣本蛋白濃度（mg prot·mL-1），實驗重復3 次。

1.3.5 qPCR 檢測 取出腎臟組織放置于冰上，使用Trizol 法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物序列見表1，擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、60 ℃延長30 s，45 個循環(huán)。根據(jù)擴增曲線數(shù)據(jù)，分析擴增曲線后計算2-ΔΔCt，分析相關因子的mRNA 表達水平，每個樣品重復試驗3 次。

表1 引物序列

1.3.6 Western blot 檢測 取50 mg 腎臟組織，加入0.5 mL 的組織裂解液進行冰浴勻漿研磨，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，提取腎臟組織全蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，配制SDSPAGE 凝膠，80 V 穩(wěn)定電壓電泳后轉模，3%BSA封閉1 h，于1∶1 000 稀釋的一抗中4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST 清洗3 次，10 min/次，再于1∶1 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，用TBST 清洗3 次，10 min/次，使用ECL 發(fā)光液于避光條件下進行曝光。應用Image J 軟件計算各條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氟氯氰菊酯對大鼠體質量的影響

經(jīng)過氟氯氰菊酯染毒，各組大鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義，染毒前與染毒14 d、28 d 相比，差異無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05），見表2。

表2 氟氯氰菊酯對大鼠體質量的影響（，g）

表2 氟氯氰菊酯對大鼠體質量的影響（，g）

2.2 氟氯氰菊酯對大鼠腎臟質量及臟器系數(shù)的影響

經(jīng)過氟氯氰菊酯染毒各組大鼠腎臟質量和臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05），見表3。

表3 氟氯氰菊酯對大鼠腎臟質量及器官系數(shù)的影響

2.3 氟氯氰菊酯染毒對大鼠腎臟組織結構的影響

2.3.1 光鏡下HE 染色病理切片觀察大鼠腎臟形態(tài)結構變化 對照組顯示，腎小球和腎小管形態(tài)和結構清晰，未見明顯異常，腎小球系膜細胞、內皮細胞等結構均正常，毛細血管腔未見異常擴張；氟氯氰菊酯染毒組顯示腎小管水腫，腎小管上皮細胞脫落，腎小球萎縮，且隨染毒劑量增加損傷越明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟形態(tài)病理切片（HE×40，↑：腎小球）

2.3.2 透射電鏡觀察大鼠腎臟超微結構變化 電鏡下對照組可見腎小管上皮細胞排列規(guī)則，線粒體、內質網(wǎng)結構正常。氟氯氰菊酯染毒組顯示腎臟小管細胞基底膜逐漸增厚，線粒體出現(xiàn)腫脹，在高劑量組中出現(xiàn)了空泡樣病變，見圖2。

圖2 透射電鏡觀察氟氯氰菊酯暴露對大鼠腎臟細胞影響（標尺=1 μm）

2.4 氟氯氰菊酯染毒對大鼠腎臟組織氧化應激指標SOD、MDA 水平的影響

與對照組相比，隨著氟氯氰菊酯染毒劑量的升高，SOD 活力呈現(xiàn)降低趨勢，MDA 含量呈現(xiàn)升高趨勢（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 氟氯氰菊酯染毒后大鼠腎臟中SOD 及MDA 的變化

2.5 氟氯氰菊酯染毒對大鼠腎臟組織中GADD45B、JNK 和p38MAPK、p-JNK 和p-p38MAPK表達的影響

qPCR 與Western blot 結果均顯示，與對照組相比，中、高劑量組GADD45B 的mRNA 和蛋白表達水平均隨染毒劑量的增高而上調（P 均＜0.05），JNK 和p38MAPK 的蛋白和mRNA 表達水平均隨染毒劑量的增高而下降（P 均＜0.05），p-JNK 和pp38MAPK 的蛋白表達水平均隨染毒劑量的增高而上調（P 均＜0.05），見圖4～圖6。

圖4 氟氯氰菊酯染毒后大鼠腎臟中GADD45B 的表達變化

圖5 氟氯氰菊酯染毒后大鼠腎臟中MAPK 通路相關因子的蛋白表達變化

圖6 氟氯氰菊酯染毒后大鼠腎臟中MAPK 通路相關因子的mRNA 表達變化

3 討論

擬除蟲菊酯對人類和哺乳動物具有不同程度的毒性，包括神經(jīng)系統(tǒng)毒性、生殖毒性、肝臟毒性和腎臟毒性[8]。研究[9]顯示，擬除蟲菊酯的蓄積可通過多種機制導致腎臟損害，如氧化應激、細胞凋亡、炎癥等。高效氯氟氰菊酯和溴氰菊酯對鵪鶉腎臟的損傷體現(xiàn)在腎小管和腎小球組織結構的破壞[10-11]。本研究通過HE 染色顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著染毒劑量的增加，腎小管渾濁腫脹，腎小球萎縮，腎小管上皮細胞逐漸壞死脫落，伴有炎性細胞浸潤，與Deng 等[12]的研究結果一致。研究[13]發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯可導致大鼠腎臟中核染色質濃縮，細胞核濃縮分裂，線粒體腫脹，嵴斷裂或消失，說明氟氯氰菊酯可對大鼠腎臟超微結構造成損傷，與本實驗結果一致。

研究[14]表明，擬除蟲菊酯會打破體內氧化-抗氧化平衡狀態(tài)，導致過量的ROS 產生，從而影響腎臟結構、代謝功能，進而對機體造成危害。ROS是導致腎臟損傷發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素[15]。ROS可以使機體產生脂質過氧化反應，從而引發(fā)鏈式反應，最終將損傷放大。而MDA 作為脂質過氧化反應的標志性產物，能夠間接地反映機體氧化損傷的程度[16]。SOD 是一種抗氧化酶，在體內能夠清除氧自由基，促進氧自由基分解，使其處于生成與消除的平衡狀態(tài)，降低自由基對細胞膜的損傷[17]。本研究顯示，隨著染毒劑量的增加，SOD 活力下降，MDA 含量增加，說明氟氯氰菊酯染毒使大鼠腎臟組織氧化應激水平增加，最終導致氧化損傷的發(fā)生。

GADD45B 是一種普遍表達的蛋白質，是GADD45 基因家族的成員，參與介導細胞周期停滯、DNA 損傷修復和細胞凋亡等[18]。在腎臟疾病中，GADD45B 可激活MAPK 通路導致疾病進一步發(fā)展，通過調控MAPK 級聯(lián)反應，使p38MAPK 磷酸化從而誘導足細胞凋亡[19]。有報道[7]稱，Heymann腎炎大鼠和足細胞特異性缺失小鼠中GADD45B表達上調，表明其參與對腎臟的損傷。有研究[20]觀察到，斑馬魚腎小球足細胞損傷中，GADD45B過表達會促進足細胞的凋亡和蛋白尿，同時抑制GADD45B 的表達可以緩解足細胞損傷并減少蛋白尿，ROS 可介導GADD45B 的上調，同時GADD45B 過表達可激活p38MAPK 通路，使其誘導足細胞損傷。在本研究中，GADD45B、p-JNK、p-p38MAPK 表達水平均隨染毒劑量的升高而升高，JNK、p38MAPK 表達水平均隨染毒劑量的升高而降低，提示氟氯氰菊酯暴露可引起GADD45B表達異常，進而誘導JNK 和p38MAPK 信號通路的磷酸化導致腎臟損傷。

綜上所述，氟氯氰菊酯具有一定的腎臟毒性，可使大鼠腎臟氧化應激水平增加，GADD45B可能通過調控JNK/p38MAPK 促使大鼠腎臟損傷，后續(xù)還將構建細胞模型進一步證明及研究。