徐方晶，王 潔，范玉成，張 瑜，孫美琪，何 靜，何 軍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬石嘴山市第一人民醫(yī)院病理科，石嘴山 753600）

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是目前世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，給個人和社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。心肌缺血時，心肌細(xì)胞線粒體有氧呼吸減弱、三磷酸腺苷（ATP）合成減少，致使心肌細(xì)胞能量供應(yīng)不足，無法維持正常的生理功能，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡或壞死。心臟是富含線粒體的器官，線粒體占心肌細(xì)胞體積的1/3，心臟收縮所需能量的90%以上由線粒體生成和提供[3]。因此，線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)態(tài)對維持正常的心臟功能十分重要。

線粒體泛素連接酶1（mitochondrial ubiquitin ligase 1，Mul1）是一種線粒體外膜錨定蛋白，也被稱為線粒體錨定蛋白連接酶（mitochondrial-anchored protein ligase，MAPL）或生長抑制及死亡E3連接酶（growth inhibition and death E3 ligase，GIDE），在心、腦、肝、腎、脾、骨骼肌、小腸、肺及外周血白細(xì)胞等組織與細(xì)胞中表達(dá)。Mul1 分子的N 端和C 端均含有跨膜結(jié)構(gòu)域，其位于C 端的環(huán)指結(jié)構(gòu)域具備E3 連接酶活性，發(fā)揮蛋白質(zhì)泛素化或類泛素化（small ubiquitin-like modifier，SUMO）修飾功能[4-6]，通過調(diào)控核因子κB（nuclear factor-KappaB，NF-κB）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p53 蛋白和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）等信號分子[7-10]，直接或間接參與細(xì)胞生長、線粒體動力學(xué)及炎癥與免疫反應(yīng)。本課題組的前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，Mul1 在急性缺血心肌組織中呈特異性高表達(dá)，由此推測Mul1 參與調(diào)控缺氧心肌的病理生理變化。本研究利用缺氧大鼠心肌細(xì)胞模型，通過對Mul1 過表達(dá)和沉默干預(yù)，觀察Mul1 對大鼠缺氧心肌細(xì)胞存活率和結(jié)構(gòu)的影響，探討Mul1 對缺氧心肌細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

大鼠心肌細(xì)胞H9C2（上海中科院細(xì)胞庫）；Mul1 過表達(dá)慢病毒載體LV-Mul1 和Mul1 敲減慢病毒載體LV-Mul1-RNAi 及其相關(guān)空載體（上海吉凱基因公司）；HitransG P 感染增強(qiáng)液（上海吉凱基因公司）；RNA 提取試劑盒（天根生化公司）；HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（諾唯贊公司）；QuantiNovaTMGreen PCR Kit（凱杰企業(yè)管理有限公司）；無糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco 公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基和青鏈霉素雙抗（BI 公司）；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒和SDS-PAGE 快速凝膠配制試劑盒（凱基生物公司）；Mul1 抗體（兔多克隆抗體，16133-1-AP，Proteintech 公司）；GAPDH（兔多克隆抗體，bs-2188R，博奧森公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ZB-2301，中杉金橋公司）；Hoechst 33342 染色液（索萊寶公司）；三氣培養(yǎng)箱（Steri-Cycle i250，美國Thermo Fisher 公司）；熒光定量PCR 儀（ABI 7500，美國Thermo Fisher 公司）；CBM 智能細(xì)胞檢測平臺（Cytation 5，美國BioTek 公司）；透射電子顯微鏡（HT-7800，日本Hitachi 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠心肌細(xì)胞H9C2 常規(guī)培養(yǎng) 以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時進(jìn)行實驗。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染及分組命名 分別構(gòu)建Mul1過表達(dá)、過表達(dá)空質(zhì)粒、Mul1 敲減質(zhì)粒和敲減空質(zhì)粒，進(jìn)行慢病毒包裝后用于實驗。將H9C2 細(xì)胞接種至6 孔板內(nèi)（2×104/孔），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合至20%～30%時，以復(fù)感染指數(shù)（MOI）＝10 加入病毒以及HitransG P感染增強(qiáng)液40 μL/孔。感染18 h 后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。將各組H9C2 細(xì)胞分別命名為陰性對照組（NC）、Mul1 過表達(dá)組（LV-Mul1）、Mul1敲減組（LV-Mul1-RNAi）、Mul1 過表達(dá)空載體組（LV-Vector）、Mul1 敲減空載體組（LV-RNAi-Vector），其中LV-Mul1-RNAi 的干擾靶序列為5’-GGAGCTAAGAAGATTCATTTG-3’。

1.2.3 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株 慢病毒感染H9C2細(xì)胞72 h 后（80%～90%細(xì)胞匯合），將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含4 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行藥篩，篩選48 h 后，未感染病毒的對照組細(xì)胞全部死亡，而感染病毒組未再出現(xiàn)細(xì)胞死亡時，調(diào)整嘌呤霉素至維持濃度2 μg·mL-1，繼續(xù)對感染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，同時收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 RT-qPCR 檢測Mul1 表達(dá)載體mRNA 水平 使用RNA 提取試劑盒提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RNA，HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。加入Mul1 基因引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。Mul1 上游引物：5’-GGAGCATAAGATGGTGTGGAA-3’，下 游 引 物：5’-GTGTTAGTCCTCTGGTGAAT-3’。并使用QuantiNovaTMGreen PCR Kit 在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH 為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計算Mul1 mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot 檢測Mul1 表達(dá)載體的蛋白水平 將各組細(xì)胞置于細(xì)胞裂解液中，勻漿振蕩裂解靜置30 min 后，4 ℃、17 000×g 離心10 min，收集上清后BCA 法測定蛋白濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，每個泳道加樣蛋白量為30 μg，并轉(zhuǎn)于聚偏二氟乙烯膜上，10%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（Mul1 1∶1 000；GAPDH 1∶5 000），4 ℃孵育過夜。復(fù)溫后洗膜3 次，加入二抗（山羊抗兔，稀釋比為1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜3 次后化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白的相對表達(dá)量，并用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.6 觀察缺氧培養(yǎng)下細(xì)胞的形態(tài)變化 常規(guī)培養(yǎng)各組細(xì)胞至細(xì)胞融合度約90%時，更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的無糖DMEM，置于含5%CO2、94%N2、1%O2的三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。同時，另將各組細(xì)胞進(jìn)行常氧培養(yǎng)作為對照。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.7 檢測缺氧培養(yǎng)下細(xì)胞的存活率 將各組細(xì)胞以PBS 清洗后加入Hoechst 33342（1∶1 000）染液、室溫孵育30 min，再以PBS 洗滌，經(jīng)CBM智能細(xì)胞檢測平臺動態(tài)觀察同一視野并采集圖片進(jìn)行定量分析。

1.2.8 透射電鏡觀察缺氧培養(yǎng)下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 收集上述各組正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞，室溫、700×g 離心5 min，4 ℃、戊二醛固定2 h，然后進(jìn)行常規(guī)電鏡樣品固定、脫水、滲透、包埋，超薄切片，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察并攝片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mul1 慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達(dá)情況

各組H9C2 細(xì)胞生長狀態(tài)均良好；陰性對照組H9C2 細(xì)胞中無綠色熒光表達(dá)，Mul1 過表達(dá)組及Mul1 過表達(dá)空載體組陽性率均為60%～70%；Mul1 敲減組及Mul1 敲減空載體組綠色熒光表達(dá)豐度高，陽性率均為70%～80%，見圖1。

圖1 Mul1 慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達(dá)情況（×100）

2.2 Mul1 慢病毒表達(dá)載體干擾H9C2 細(xì)胞Mul1 mRNA 表達(dá)效率鑒定

RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，Mul1 過表達(dá)組Mul1 mRNA 水平高于陰性對照組和Mul1 過表達(dá)空載體組（P 均＜0.05）；Mul1 敲減組Mul1 mRNA表達(dá)水平低于陰性對照組和Mul1 敲減空載體組（P 均＜0.05），見圖2。

圖2 Mul1 慢病毒表達(dá)載體干擾H9C2 細(xì)胞Mul1 mRNA 表達(dá)效率鑒定

2.3 Mul1 慢病毒表達(dá)載體干擾H9C2 細(xì)胞Mul1蛋白表達(dá)效率鑒定

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組和Mul1 過表達(dá)空載體組相比，Mul1 過表達(dá)組Mul1 蛋白表達(dá)水平升高（P 均＜0.05）；與陰性對照組和Mul1 敲減空載體組相比，Mul1 敲減組Mul1 蛋白表達(dá)水平降低（P 均＜0.05），見圖3。該結(jié)果表明，Mul1 過表達(dá)載體和敲減載體以及相應(yīng)對照載體均構(gòu)建成功，并且獲得了Mul1 過表達(dá)細(xì)胞株、Mul1 敲減細(xì)胞株以及相關(guān)空載體細(xì)胞株。

圖3 Mul1 慢病毒表達(dá)載體干擾H9C2 細(xì)胞Mul1 蛋白表達(dá)效率鑒定

2.4 Mul1 對缺氧培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞形態(tài)的影響

采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞生長狀態(tài)，常規(guī)培養(yǎng)下的各組H9C2 細(xì)胞全部貼壁生長，為梭形或多角形，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并形成放射狀排列的細(xì)胞簇，細(xì)胞核突出明顯。缺氧12 h 后各組H9C2 細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生不同程度的變化，細(xì)胞簇周圍有部分脫落的細(xì)胞，細(xì)胞皺縮。與陰性對照組和Mul1 過表達(dá)空載體組相比，Mul1 過表達(dá)組細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡和粗大顆粒樣物質(zhì)，大片細(xì)胞皺縮、脫落；與陰性對照組和Mul1 敲減空載體組相比，Mul1 敲減組細(xì)胞絕大部分細(xì)胞形態(tài)較好，偶見死亡細(xì)胞，透光性強(qiáng)，見圖4。

圖4 Mul1 對缺氧培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）

2.5 Mul1 對缺氧培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞存活率的影響

將各組H9C2 細(xì)胞置于CBM 智能細(xì)胞檢測平臺中持續(xù)缺氧24 h，在同一視野下持續(xù)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。結(jié)果顯示，陰性對照組、Mul1 過表達(dá)空載體組、Mul1 敲減空載體組、Mul1 過表達(dá)組和Mul1 敲減組在缺氧24 h 時，細(xì)胞存活率分別為（91.38±0.98）%、（88.43±1.07）%、（90.17±1.13）%、（65.42±2.60）%和（95.50±1.44）%，缺氧培養(yǎng)24 h時，Mul1 過表達(dá)組細(xì)胞存活率低于陰性對照組及Mul1 過表達(dá)空載體組（P 均＜0.05），Mul1 敲減組細(xì)胞存活率高于陰性對照組和Mul1 敲減空載體組（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 Mul1 對缺氧培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞存活率的影響

2.6 Mul1 對缺氧培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

正常含氧培養(yǎng)條件下各組H9C2 細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核膜邊界清晰完整，染色質(zhì)均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物豐富，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。缺氧12 h 后，陰性對照組和陽性對照組（LV-Vector、LV-RNAi-Vector）H9C2 細(xì)胞線粒體排列紊亂、腫脹，出現(xiàn)局灶型空化現(xiàn)象，細(xì)胞核膜尚完整，染色質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物無異常改變；Mul1 過表達(dá)組H9C2 細(xì)胞線粒體腫脹明顯、嵴斷裂、溶解呈空泡狀，胞質(zhì)內(nèi)容物減少；Mul1 敲減組H9C2 細(xì)胞大部分線粒體結(jié)構(gòu)正常，偶見線粒體嵴斷裂現(xiàn)象，見圖6。

圖6 Mul1 對缺氧培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

心臟收縮和舒張的功能活動需要心肌細(xì)胞獲取足夠的氧氣，并且心肌細(xì)胞較其他類型細(xì)胞對缺氧更為敏感[12]。缺氧可造成心肌細(xì)胞生長減慢、活力降低，細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損，尤其造成線粒體明顯損傷，細(xì)胞色素C 釋放增加，活性氧升高，ATP 合成受阻，引起心肌細(xì)胞能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等[13]。因此，尋找能夠調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的基因?qū)ρ芯咳毖孕呐K病的發(fā)生發(fā)展十分重要。

目前研究[4，6，14]發(fā)現(xiàn)，Mul1 作為一種多功能的線粒體泛素連接酶可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減緩生長。但在心肌細(xì)胞中，尤其在缺氧培養(yǎng)下，Mul1 對心肌細(xì)胞損傷的影響報道甚少。為探討Mul1 是否調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞的病理生理功能，本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功實現(xiàn)外源性Mul1 在H9C2心肌細(xì)胞中過表達(dá)和低表達(dá)，在缺氧條件下培養(yǎng)Mul1 對H9C2 細(xì)胞的影響結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)時各組細(xì)胞株之間的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及死亡率無明顯變化，而缺氧培養(yǎng)時過表達(dá)Mul1 可以加重細(xì)胞損傷程度，提高細(xì)胞的死亡率；敲減Mul1 后上述現(xiàn)象則相反；進(jìn)一步觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)提示，缺氧培養(yǎng)下Mul1 可以進(jìn)一步加重線粒體損傷，表現(xiàn)為線粒體嚴(yán)重腫脹、局灶性空化、嵴斷裂及內(nèi)膜消失。由此認(rèn)為，Mul1 引起的心肌細(xì)胞損傷與線粒體損傷密切相關(guān)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的中樞，因此維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整性對細(xì)胞狀態(tài)的維持至關(guān)重要。Mul1 能夠參與調(diào)節(jié)與線粒體功能障礙相關(guān)的蛋白質(zhì)的水平和功能，其中線粒體動力學(xué)變化引起的線粒體代謝紊亂與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6]。線粒體作為一種處于動態(tài)平衡狀態(tài)的細(xì)胞器，當(dāng)細(xì)胞受到代謝或環(huán)境壓力時，通過融合、分裂來維持其形狀、分布和大小。為了維持線粒體分裂和融合之間的平衡，需要4 個進(jìn)化上保守的GTP 水解酶，包括線粒體融合蛋白1（mitofusion 1，Mfn1）、線粒體融合蛋白2（mitofusion 2，Mfn2）和視神經(jīng)萎縮1（optic atrophy 1，OPA1）以及動力相關(guān)蛋白1（dynamic related protein 1，Drp1），其中Drp1 被認(rèn)為是分裂的“主調(diào)節(jié)器”[14-15]。Mul1 作為泛素或SUMO連接酶發(fā)揮作用，具有泛素化或SUMO 化底物的潛力。當(dāng)Mul1 表達(dá)上調(diào)時，Mul1 通過SUMO 化介導(dǎo)Drp1 穩(wěn)定和泛素化介導(dǎo)的Mfn2 降解都會增強(qiáng)，這會阻礙線粒體融合，同時促進(jìn)線粒體分裂，擾亂線粒體動態(tài)平衡穩(wěn)定狀態(tài)，引起線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)崩解、片段化增強(qiáng)以及膜電位損失，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16-17]。另外，Mul1 獨特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使其能夠在膜間“感知”線粒體應(yīng)激，并通過特定底物的泛素化傳遞這些信號。其中Mul1 連接酶失活導(dǎo)致UBX 結(jié)構(gòu)域蛋白7（UBX domain protein 7，UBXN7）的積累，伴隨缺氧誘導(dǎo)因子－1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表達(dá)水平升高，氧化磷酸化減少和糖酵解增加以維持缺氧細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以適應(yīng)缺氧[18]。Wang 等[19]的研究也表明，在缺血再灌注損傷的大鼠心肌中，Mul1通過SUMO 化穩(wěn)定并激活p53，導(dǎo)致p53 介導(dǎo)的線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡。在本研究中，Mul1可增加缺氧培養(yǎng)下大鼠心肌細(xì)胞的損傷程度，加重以線粒體為主的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，并增加細(xì)胞死亡率，原因可能為Mul1 通過擾亂線粒體動力學(xué)變化以及對下游信號分子的相互作用進(jìn)而調(diào)控線粒體功能參與缺氧心肌細(xì)胞損傷及死亡。