馬世玲，黃李雅

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

胰腺癌是一種致命的惡性腫瘤，主要起源于胰腺導(dǎo)管上皮，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的原因之一[1]。胰腺癌起病隱匿，約80%的患者在明確診斷時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)。晚期患者行化療、放射治療或其他綜合治療效果有限，即使近年來興起的腫瘤免疫療法，也因腫瘤細(xì)胞表面缺乏免疫原性及其獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境存在很大的挑戰(zhàn)和窘境[2]。

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblase growth factors，F(xiàn)GFs）由23 個(gè)成員組成，人類FGF 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及發(fā)育、腫瘤、代謝和神經(jīng)疾病[3]。成纖維細(xì)胞生長因子21（FGF21）被認(rèn)為是一種重要的內(nèi)分泌代謝調(diào)節(jié)因子，主要在肝臟、胰腺和脂肪中表達(dá)，此外，在腎臟中也有所表達(dá)[4]。研究[5]表明，F(xiàn)GF21 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也具有潛在調(diào)節(jié)作用。目前，F(xiàn)GF21 在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不清楚。為探究FGF21 對(duì)胰腺癌細(xì)胞表型的影響，本研究將FGF21 過表達(dá)技術(shù)應(yīng)用于胰腺癌細(xì)胞PANC-1，觀察FGF21 對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞凋亡的影響，以闡釋FGF21 抑制胰腺癌細(xì)胞發(fā)展機(jī)制，以期為胰腺癌尋找新的有效靶向治療位點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及重組慢病毒載體 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 購自中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫。在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。含過表達(dá)FGF21 基因序列的重組慢病毒載體HBLVh-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO 及慢病毒空載體HBLV-ZsGreen-PURO 購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco 公司；兔抗人FGF21 單克隆抗體、兔抗人Cleaved-caspase3 單克隆抗體、兔抗人Caspase3 單克隆抗體、兔抗人Caspase9 單克隆抗體均購自美國Abcam 公司；GAPDH、Tublin 購自美國Proteintech 公司；ECL 試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；引物購自上海生工生物工程有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒和CCK-8 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；流式凋亡試劑盒購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司；吉西他濱購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及重組慢病毒感染 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的PANC-1 細(xì)胞，以1.5×105個(gè)/孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞融合度達(dá)到70% 時(shí)，依據(jù)病毒的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為5，分別加入重組慢病毒載體HBLV-h-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO 和空載體HBLV-ZsGreen-PURO 進(jìn)行病毒感染。72 h 后用熒光顯微鏡（放大倍數(shù)為100）觀察病毒感染效率，用含嘌呤霉素抗性的培養(yǎng)液篩選獲得FGF21 過表達(dá)的穩(wěn)定感染細(xì)胞株，命名為PANC-1/FGF21 OE 細(xì)胞（OE 組）；感染空病毒載體HBLV-ZsGreen-PURO的PANC-1 細(xì)胞命名為PANC-1/FGF21 OC 細(xì)胞（OC 組）和空白細(xì)胞組。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)FGF21 過表達(dá)PANC-1細(xì)胞中FGF21 及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 分別收集病毒感染、培養(yǎng)72 h 后的空白細(xì)胞組、OC 組和OE 組細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷丙酮沉淀，離心（14 000×g）10 min，PBS 重懸，Loading Buffer 加熱（100 ℃）變性5 min。蛋白經(jīng)還原SDS-PAGE 處理，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h；加入一抗（兔單克隆抗體FGF21 1∶1 000 稀釋）4 ℃過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），室溫反應(yīng)1 h；TBST 洗膜3次，每次15 min，用ECL 試劑盒曝光顯影。以O(shè)E組與OC 組蛋白條帶的灰度值之比，以及OE 組與空白細(xì)胞組蛋白條帶的灰度值之比表示OE組蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

分別收集病毒感染72 h 后的OE 和OC 組以及空白細(xì)胞組細(xì)胞，用全蛋白提取試劑盒分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，Loading Buffer 加熱變性（5 min 100 ℃），取蛋白質(zhì)20 μg/ 孔，經(jīng)還原SDS-PAGE 處理，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h；加入一抗（兔單克隆抗體Caspase3 1∶5 000 稀釋；兔單克隆抗體Cleaved-caspase3 1∶1 000 稀釋；兔單克隆抗體Caspase9 1∶1 000）；GAPDH 1∶1 000 稀釋；Tublin（1∶1 000）4 ℃過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），室溫反應(yīng)1 h；TBST 洗膜3 次，每次15 min，用ECL 試劑盒曝光顯影。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 RT-qPCR 檢測(cè)FGF21 過表達(dá)PANC-1 細(xì)胞中FGF21、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的mRNA 表達(dá) 應(yīng)用TRIzol 提取細(xì)胞總RNA 后，從總RNA 中反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real -Time 試劑盒從總RNA 中反轉(zhuǎn)錄cDNA。mRNA 表達(dá)用SYBRTMGreen PCR Master Mix 和7300 Real-Time PCR 系統(tǒng)，反應(yīng)容積20 μL，熱循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃1 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。定量mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。獲取Ct 值，以β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照，應(yīng)用2-ΔΔCt值計(jì)算FGF21、TNF-α、IL-6 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量［Ct=（過表達(dá)組樣品的目的基因的Ct 平均值-內(nèi)參基因的Ct 平均值）-（對(duì)照組樣品的目的基因的Ct平均值-內(nèi)參基因的Ct 平均值）］。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成。

FGF21正義引物5’-GAAGCCGGGAGTTATTCA AATC-3’；

FGF21 反義引物5’-ACATTGTATCCGTCCTCAAGAA-3’；

TNF-α 正義引物5’-AGCCCTGGTATGAGCCCATCTATC-3’；

TNF-α 反義引物5’-TCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC-3’；

IL-6 正義引物5’-CACTGGTCTTTTGGAGTTTG AG-3’；

IL-6 反義引物5’-GGACTTTTGTACTCATCTGCAC-3’。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 細(xì)胞增殖能力 各組細(xì)胞接種于96 孔板中（5×103個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁生長后，分別于0、24、48、72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，檢測(cè)450 nm 波長處各孔的 光密度（OD）值。分別進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率（%）=（24、48、72 h 時(shí)增殖OD 值-0 h時(shí)增殖OD 值）/（0 h 時(shí)增殖OD 值）×100%。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FGF21 過表達(dá)PANC-1 細(xì)胞的遷移和侵襲能力 將各組PANC-1 細(xì)胞接種于6 孔板中（1.0×106個(gè)/孔），細(xì)胞生長至融合度近100%時(shí)，用無菌的200 μL 移液器槍頭在細(xì)胞層均勻劃線，低血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕的0 h和48 h，光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù)為40）下拍照、測(cè)定劃痕面積。劃痕愈合率（%）＝（0 h 劃痕面積－48 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

24 孔Transwell 小室（孔徑為8 μm）的上室中鋪入90 μL 基質(zhì)膠（體積稀釋比例為1∶2），37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜使之凝固。將各組PANC-1 細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液重懸后，接種于上室中（1×105個(gè)/孔），下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液；24 h 后取出上室，PBS 清洗2 次，用4% 多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，甲醇通透細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色25 min，PBS 清洗后，用棉簽擦拭各小室內(nèi)沒有遷移的細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野（放大倍數(shù)為200），觀察每個(gè)小室的穿膜細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)FGF21 對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 凋亡的影響 各組細(xì)胞接種于12 孔板中（1×106個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁生長后分別給予空白細(xì)胞組、OC 組和OE 組最終濃度為80 μg·mL-1的吉西他濱，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行對(duì)照組（空白組、PE 組、7 AAD 組），培養(yǎng)48 h 后，收集1×105個(gè)細(xì)胞，加入5 μL PE 和7 AAD避光染色15 min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行3 次重復(fù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGF21 重組慢病毒成功感染人胰腺癌PANC-1 細(xì)胞

PANC-1 細(xì)胞經(jīng)FGF21 重組慢病毒感染72 h后，重組病毒感染的OE 組和OC 組細(xì)胞中，80%以上可見綠色熒光蛋白表達(dá)。Western blot 檢測(cè)慢病毒感染后PANC-1 細(xì)胞中FGF21 蛋白的表達(dá)水平結(jié)果顯示，OE 組細(xì)胞中FGF21 蛋白表達(dá)水平高于OC 組細(xì)胞（P 均＜0.05），見圖1，提示重組慢病毒感染成功。

圖1 FGF21 重組慢病毒感染人胰腺癌PANC-1 細(xì)胞情況

2.2 FGF21 過表達(dá)PANC-1 中FGF21、TNF-α、IL-6 的mRNA 表達(dá)情況

RT-qPCR 檢測(cè)FGF21 重組慢病毒感染后PANC-1 細(xì)胞中FGF21、TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平結(jié)果顯示，OE 組細(xì)胞中FGF21 mRNA 表達(dá)水平高于OC 胞和空白細(xì)胞組細(xì)胞；TNFα 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平均低于OC 細(xì)胞組和空白細(xì)胞組（P 均＜0.01），見圖2。

圖2 RT-qPCR 檢測(cè)FGF21 過表達(dá)PANC-1 細(xì)胞中FGF21、TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達(dá)

2.3 FGF21 抑制PANC-1 細(xì)胞的增殖

空白細(xì)胞組、OC 組和OE 組的不同時(shí)間點(diǎn)（0 h，24 h，48 h 和72 h）CCK-8 測(cè)定結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21 過表達(dá)抑制了PANC-1 的增殖能力，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，各時(shí)間點(diǎn)OE 組細(xì)胞增殖均低于空白細(xì)胞組與OC 組（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 CCK-8 試驗(yàn)檢測(cè)FGF21 過表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞增殖的影響

2.4 FGF21 抑制PANC-1 細(xì)胞的遷移和侵襲能力

細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21 過表達(dá)抑制了PANC-1 的遷移能力，各組培養(yǎng)48 h，OE組愈合率低于空白細(xì)胞組與OC 組（P 均＜0.01），見圖4A。Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別與空白細(xì)胞組和OC 組相比，OE 組侵襲細(xì)胞數(shù)目均減少（P 均＜0.01），見圖4B。

圖4 FGF21 過表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5 FGF21 促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)FGF21 對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1 細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21 過表達(dá)OE 組凋亡率均高于空白細(xì)胞組和OC 組（P均＜0.01），見圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)FGF21 過表達(dá)對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1 細(xì)胞凋亡的影響

2.6 FGF21 可促進(jìn)PANC-1 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot 法檢測(cè)FGF21 重組慢病毒感染后PANC-1 細(xì)胞中Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9 蛋白的表達(dá)水平結(jié)果顯示，OE 組細(xì)胞中Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9 蛋 白 表達(dá)水平均高于空白細(xì)胞組和OC 組（P 均<0.05），見圖6。

圖6 Western blot 檢測(cè)凋亡蛋白相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

胰腺癌由于起病隱匿，早期診斷困難，5 年生存率僅為7.2%[6]。目前尚缺乏有效的治療手段。因此，為胰腺癌尋找有效的靶向治療位點(diǎn)意義重大。

FGF21 是FGF 基因家族中的一員，屬于FGF19 亞族，與傳統(tǒng)的FGF 亞家族顯著不同，F(xiàn)GF19 亞族缺少肝素結(jié)合區(qū)域，且需要與專性共受體β-Klotho（KLB）蛋白結(jié)合成共同復(fù)合體從而激活FGF 受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs）的信號(hào)[7]。FGF21 基因位于19 號(hào)染色體上（19q13.33），編碼一個(gè)含209 個(gè)氨基酸的蛋白體，其中N 末端含有一個(gè)由28 個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽與FGFR 反應(yīng)，C 端與KLB 結(jié)合，需保證C 端與N 端的完整性才能保證其發(fā)揮正常功能[8]。FGF21 可能代表了一種有效的預(yù)防或治療方法，通過預(yù)防脂肪肝疾病，從而阻止隨后發(fā)展為肝癌[9]，并且與心血管疾病和肝臟疾病的演變有明顯相關(guān)性[10-11]。FGF21 被認(rèn)為是一種外分泌胰腺分泌物，外分泌胰腺中的腺泡細(xì)胞比其他類型細(xì)胞合成和分泌的FGF21 都多，缺乏FGF21 的小鼠經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖后，會(huì)出現(xiàn)明顯的胰島增生和導(dǎo)管周圍淋巴細(xì)胞炎癥[12]。FGF21 能夠?qū)C(jī)體糖脂代謝產(chǎn)生重要影響[13]，由于腫瘤細(xì)胞代謝增強(qiáng)，易受營養(yǎng)饑餓的影響[14]，F(xiàn)GF21 可能會(huì)影響其表型。最近的研究[15]表明，在前列腺癌中，F(xiàn)GF21 促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制其增殖。細(xì)胞凋亡是一種進(jìn)化保守的程序性細(xì)胞死亡形式，是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵一步，由Bcl-2 家族和Caspase 家族蛋白質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)[16]。它可以通過與細(xì)胞外因子的相互作用和內(nèi)在（細(xì)胞內(nèi)）事件觸發(fā)。Caspases 負(fù)責(zé)啟動(dòng)凋亡降解階段的特征，Caspase3 是半胱氨酸-脂肪蛋白酶家族的成員，介導(dǎo)特定靶蛋白分裂，最初都是由非活性酶原體產(chǎn)生的，然后通過各種特定的內(nèi)部和或外部信號(hào)激活，激活的Caspase3 會(huì)切割各種下游底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。Caspase9 引發(fā)的凋亡被認(rèn)為反映了癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的易感性，是調(diào)控凋亡過程的關(guān)鍵信號(hào)元件[18]。

本研究表明，F(xiàn)GF21 過表達(dá)抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。此外，Western blot 結(jié)果表明，這一過程依賴于Caspase3、Cleaved-caspase3 和Caspase9 的激活，進(jìn)一步證明了FGF21 促進(jìn)凋亡的作用是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因來實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21 過表達(dá)可促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1 細(xì)胞凋亡，并抑制PANC-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，血清FGF21 水平因透明細(xì)胞腎癌、肝細(xì)胞癌和乳頭狀甲狀腺癌而增加，介導(dǎo)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，F(xiàn)GF21 與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其具體的作用機(jī)制還需深入研究，并進(jìn)一步探索FGF21 涉及的細(xì)胞信號(hào)通路，從而更全面地評(píng)估FGF21 對(duì)胰腺癌的影響，以期為尋找胰腺癌治療潛在靶點(diǎn)提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。