馬慧穎，李 玲，2，3，郭曉英，德小明，2，3，李麗萍，2，3，郝 羽，閆鳳梅

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004；3.生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004）

鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalic acid esters，PAEs）作為增塑劑，常被用在兒童玩具、食品外包裝和醫(yī)療器械等產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中[1]。在對中國23 個城市水源中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)濃度進行檢測時發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］的檢出率高達87.9%[2]。在生物體內(nèi)，DEHP 經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)形成活性代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP具有生殖和發(fā)育毒性等[3]，其在生物組織中蓄積時間長達6 個月，因此MEHP 的毒性評估不容忽視[4]。在哺乳動物細胞中，自噬是一種非常保守的機制，自噬可介導(dǎo)受損的細胞成分向溶酶體傳遞以維持體內(nèi)平衡[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MEHP染毒能夠誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生自噬體[6]。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核細胞中最豐富的RNA 甲基化形式，研究[7]表明，m6A 甲基化在精子發(fā)生和胚胎發(fā)育中起到了重要的調(diào)控作用，m6A 去甲基化酶可影響小鼠睪丸精子的生成[8]，m6A 甲基化酶缺失導(dǎo)致精子發(fā)生相關(guān)基因的改變，從而使精原細胞分化等功能無法正常進行[9]。本實驗通過加入甲基化抑制劑3-脫氮腺苷（3-deoxyioden osine，DAA）觀察m6A 甲基化在MEHP 致小鼠睪丸間質(zhì)細胞自噬中的作用，為進一步研究m6A 甲基化在PAEs中致雄性生殖毒性的作用提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要儀器與試劑

1.1.1 細胞株 小鼠睪丸間質(zhì)細胞株（TM-3）（中國科學(xué)院細胞庫）。

1.1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、發(fā)光成像系統(tǒng)、超微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司），凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），康寧細胞計數(shù)儀（上?？祵幑芾碛邢薰荆?，細胞成像系統(tǒng)倒置生物顯微鏡（深圳愛可機械有限公司），高速冷凍離心機（上海力申科學(xué)儀器有限公司），多功能酶標儀（美國珀金埃爾默股份有限公司）。

1.1.3 試劑 MEHP、DMSO溶劑（美國Sigma 公司），DAA（美國Cayman Chemical 公司），DMEM、雙抗、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（上海逍鵬生物科技有限公司），胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司），總RNA 提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司），m6A RNA 甲基化定量檢測試劑盒（艾美捷科技有限公司），全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒、自噬檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），LC3 和Beclin-1 抗體（Abcam 公司）。

1.2 TM-3 細胞培養(yǎng)、染毒液配制及分組

復(fù)蘇TM-3 細胞，每瓶加入含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基至4 mL，放置于37 ℃、100%相對濕度、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48 h 至細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%，傳代2～3次，在生長至對數(shù)生長期時收集TM-3 細胞，進行后續(xù)相關(guān)實驗。

MEHP 染毒液配制：稱取100 mg MEHP 標準品，加入1 mL DMSO 將其稀釋成濃度為359.27 mmol·L-1的MEHP 溶液，其中DMSO 終濃度為0.1%，分裝儲存于-20 ℃條件下，依照課題組前期實驗劑量[6]，加入無菌培養(yǎng)基，梯度稀釋成對照組（0 μmol·L-1）、MEHP 低劑量組（200 μmol·L-1）、中劑量組（400 μmol·L-1）、高劑量組（800 μmol·L-1）的染毒液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

DAA 組給予終濃度為40 μmol·L-1的DAA，DAA+MEHP 組給予40 μmol·L-1DAA+400 μmol·L-1MEHP。

1.3 CCK-8 法檢測不同濃度甲基化抑制劑對細胞活力的影響

將TM-3 細胞制成單細胞懸液并進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度后將細胞接種到96 孔板中（每孔1×104個細胞），在37 ℃、5%CO2和100%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，待細胞貼壁后，加入濃度梯度為0（DAA 對照組）、5、10、20、40、80 μmol·L-1的DAA 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光加入適量的檢測液，多功能酶標儀中37 ℃孵育0.5～1 h，檢測其吸光度值，計算細胞活力[10]。

1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察TM-3 細胞形態(tài)、CCK-8法檢測其存活率

將制成單細胞懸液的TM-3 細胞，按每孔2×105個細胞接種到6 孔板中，待細胞鋪滿孔底70%～80%，分別加入0、200、400、800 μmol·L-1的MEHP，40 μmol·L-1DAA 和40 μmol·L-1DAA+400 μmol·L-1MEHP 干預(yù)24 h，于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。加入CCK-8 檢測液在450 nm波長處檢測吸光度值，計算TM-3 細胞存活率。

1.5 提取TM-3 細胞總RNA 并檢測不同組別染毒對m6A 甲基化水平的影響

將處于對數(shù)生長期的TM-3 細胞按每孔2×105個細胞接種到6 孔板中，待細胞鋪滿孔板底部70%～80%，每孔加入2 mL 不同組別的染毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照總RNA 提取試劑盒說明書操作，提取TM-3 細胞的總RNA，隨后準備相應(yīng)數(shù)量的8 聯(lián)管，使用高效RNA 結(jié)合液將TM-3細胞總RNA 結(jié)合到孔板上，利用捕捉和檢測抗體在多功能酶標儀下檢測450 nm 處的吸光值，并計算m6A 甲基化水平。m6A（%）＝［（ODsample-ODNC）÷S］/［（ODPC-ODNC）÷P］×100%，其中S 為樣本RNA 的質(zhì)量，P 為陽性對照組RNA 的質(zhì)量。

1.6 丹酰尸胺（MDC）染色檢測自噬

將TM-3 細胞以每孔2×104個細胞的濃度接種到24 孔板中，待細胞鋪滿孔板底部80%左右，加入不同組別的染毒液放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。洗滌緩沖液洗2 次，每孔加入100 μL 配制好的MDC 染色液，避光在室溫下孵育20～30 min，洗滌緩沖液洗3 次，熒光顯微鏡下觀察，并對每個組別進行隨機拍照，用Image J 軟件分析各組的熒光信號強度。

1.7 Westernblot檢測TM-3細胞相關(guān)蛋白表達情況

TM-3 細胞經(jīng)過不同組別染毒24 h，加入蛋白裂解液超聲裂解20 min，12 000 r·min-1離心5 min，收集上清為TM-3 細胞的全蛋白，用BCA試劑盒和多功能酶標儀檢測蛋白濃度，配制合適的蛋白上樣體系。根據(jù)蛋白分子質(zhì)量進行配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，1×PBST 清洗后，加入相應(yīng)的一抗稀釋液（LC3 為1∶2 000；Beclin-1 為1∶5 000）放在4 ℃冰箱孵育過夜，使用洗膜液清洗3 次，在室溫下孵育二抗1～2 h，洗膜30 min后配制ECL 發(fā)光液對目的條帶進行曝光。應(yīng)用Image J 軟件對目的蛋白進行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9 和SPSS 26.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甲基化抑制劑對TM-3 細胞活力的影響

隨著DAA 濃度的增加，TM-3 細胞活力先增加后降低，當DAA 濃度為5、10、20、40 μmol·L-1時，細胞活性分別為（104.36±14.01）%、（101.26±11.04）%、（99.24±8.70）%、（97.43±7.49）%，與DAA 對照組相比均無明顯變化（P＞0.05）；當DAA濃度為80 μmol·L-1時，細胞活性為（84.94±5.95）%，較DAA 對照組降低（P＜0.01），見圖1。

圖1 不同濃度DAA 對TM-3 細胞活力的影響

2.2 不同染毒方式對TM-3 細胞形態(tài)的影響

MEHP 對照組TM-3 細胞大多為梭形和多邊形，細胞間排列較密集，MEHP 染毒組隨著劑量加大，各細胞間的空隙變大，圓形細胞變多，貼壁細胞的數(shù)量明顯減少，DAA+MEHP 組與中劑量MEHP 組相比，細胞發(fā)生皺縮，細胞間隔稍有增大，見圖2。

圖2 不同組別對TM-3 細胞形態(tài)的影響（×100，標尺為270 μm 處）

2.3 不同組別染毒對TM-3 細胞活力的影響

不同組別染毒24 h 測定其吸光度值，結(jié)果顯示，與MEHP 對照組相比，MEHP 低、中、高劑量組和DAA+MEHP 組TM-3 細胞活力均下降（P均＜0.01），與MEHP 中劑量組相比，MEHP+DAA組細胞活力下降（P＜0.01），見表1。

表1 不同組別染毒對TM-3 細胞活力的影響

2.4 不同濃度MEHP 對TM-3 細胞RNA 甲基化m6A 修飾的影響

TM-3 細胞經(jīng)過不同濃度MEHP 處理24 h，MEHP 組對照，低、中、高劑量總體m6A 甲基化水平依次為（0.070 7±0.001 4）%、（0.055 3±0.000 5）%、（0.042 97±0.001 8）%和（0.039 5±0.001 0）%，與MEHP 對照組相比，各組m6A 修飾水平均降低（P 均＜0.01），見圖3。

圖3 不同濃度MEHP 對TM-3 細胞m6A 修飾水平的影響

2.5 甲基化抑制劑對TM-3 細胞RNA 甲基化m6A 修飾的影響

DAA 組m6A 修飾水平為（0.038 5±0.002 2）%，與MEHP 對照組相比下降（P＜0.01）；DAA+MEHP組m6A 修飾水平為（0.024 1±0.001 6）%，與MEHP中劑量組相比降低（P ＜0.01），如圖4。由于40 μmol·L-1DAA 在明顯降低TM-3 細胞的m6A修飾水平的同時對細胞損傷較小，因此后續(xù)DAA 的干預(yù)劑量為40 μmol·L-1。

圖4 甲基化抑制劑對TM-3 細胞m6A 修飾水平的影響

2.6 不同濃度MEHP 及甲基化抑制劑對TM-3細胞自噬發(fā)生的影響

MDC 熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，MEHP低劑量組熒光信號強度為（26.07±8.35），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；MEHP 中、高劑量組和DAA 組熒光信號強度分別為（77.96±8.79）、（127.56±4.65）和（77.79±43.95），與對照組相比增強（P＜0.01）；DAA+MEHP 組熒光信號強度為（112.03±2.45），較MEHP 中劑量組增強（P＜0.05），見圖5。

圖5 不同處理條件下TM-3 細胞MDC 的熒光強度

2.7 不同濃度MEHP 對TM-3 細胞自噬相關(guān)蛋白表達量的影響

與對照組相比，MEHP 各染毒組LC3-Ⅱ的表達量均升高（P＜0.05），伴隨著染毒劑量增大，呈逐漸上升的趨勢，MEHP 低劑量組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ無明顯改變（P＞0.05），MEHP 中、高劑量組LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比例升高（P＜0.01）。MEHP低劑量組Beclin-1 的表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），MEHP 中、高劑量組Beclin-1 的表達量較對照組升高（P＜0.01），見圖6。

圖6 不同濃度MEHP 對TM-3 細胞自噬相關(guān)蛋白表達量的影響

2.8 甲基化抑制劑對TM-3 細胞自噬相關(guān)蛋白表達情況的影響

不同處理條件Western blot 結(jié)果及定量分析結(jié)果顯示，與對照組相比，DAA+MEHP 組和DAA組LC3-Ⅱ的表達水平均升高（P 均＜0.01），DAA組LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ無明顯變化（P＞0.05），DAA+MEHP 組LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ升高（P＜0.01）。DAA+MEHP 組和DAA 組Beclin-1 的表達水平較對照組均上升（P 均＜0.01），見圖7。

圖7 甲基化抑制劑對TM-3 細胞自噬相關(guān)蛋白表達量的影響

3 討論

表觀遺傳學(xué)在內(nèi)分泌干擾物致人類健康損害中起著重要的作用[11]，其中RNA 甲基化在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，其作用不容忽視。m6A修飾主要分布在3’非翻譯區(qū)域、近終止密碼子和長外顯子區(qū)域[12]，能夠調(diào)控RNA 穩(wěn)定性、選擇性剪接、翻譯及核轉(zhuǎn)運等。相關(guān)研究[13]發(fā)現(xiàn)，機體暴露于環(huán)境污染物后，其DNA 甲基化水平、DNA羥甲基胞嘧啶、RNA 甲基化水平以及相關(guān)調(diào)節(jié)基因均發(fā)生改變。另有研究[14]表明，在睪丸間質(zhì)干細胞分化的過程中觀察到了METTL14 降低和ALKBH5 增加，導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細胞中m6A 甲基化水平降低，自噬增加。

自噬是一種將自噬體與溶酶體融合進行降解的分解、代謝過程，以滿足細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[15]。自噬相關(guān)基因，在調(diào)節(jié)自噬過程中發(fā)揮重要作用[16]，其中LC3 包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，兩者之間可以互相轉(zhuǎn)換，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜，常用來判斷細胞的自噬水平[17]。在哺乳動物中，Beclin-1 是酵母Atg6 的同源物，其促進形成自噬體膜從而對自噬進行調(diào)控[18]。本實驗通過CCK-8 法檢測不同組別染毒24 h 后TM-3 細胞的存活率，結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加，TM-3 細胞存活率不斷下降，DAA+MEHP組細胞存活率較MEHP 中劑量組降低。光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結(jié)果顯示，對照組TM-3 細胞大多為梭形和多邊形，細胞間排列較緊密，隨著MEHP 染毒劑量的加大，細胞間的空隙變大，圓形細胞變多，貼壁細胞的數(shù)量減少，DAA+MEHP組TM-3 細胞發(fā)生皺縮，細胞間隔較MEHP 中劑量組稍有增大。使用m6A RNA 甲基化定量檢測試劑盒檢測不同處理條件下TM-3 細胞m6A 修飾的水平，結(jié)果提示，隨著MEHP 染毒劑量的增加，m6A 修飾水平降低，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性趨勢；DAA+MEHP 組m6A 修飾水平與MEHP 中劑量組相比降低；DAA 組m6A 修飾水平較對照組下降。既往研究[19]報道，RNA 甲基化的主要功能是促進mRNA 代謝以維持細胞自我更新，m6A水平降低與癌癥進展和低存活率密切相關(guān)，這與本研究結(jié)果相互驗證。MDC 是一種嗜酸性染色劑，通常用來檢測自噬體形成，自噬小體可被染成藍色[20]。本實驗利用MDC 染色法在熒光顯微鏡下觀察自噬小體形成，結(jié)果顯示：對照組熒光信號強度最弱，說明正常的TM-3 細胞中只有極少數(shù)的自噬小體，MEHP 低劑量組與對照組相比，熒光信號強度無明顯變化，而MEHP 中、高劑量組熒光信號強度明顯增強；DAA+MEHP 組熒光信號強度較中劑量MEHP 組呈上升趨勢；DAA 組熒光信號強度與對照組相比增強。本課題組前期研究[6，21]發(fā)現(xiàn)，一定劑量MEHP 染毒可通過PTEN/AKT 信號通路正向調(diào)節(jié)小鼠睪丸間質(zhì)細胞自噬。Liu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯依賴ROS 通過Akt1 途徑誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞自噬。另有研究[23]表明，MEHP 的原型DEHP 導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)細胞自噬和凋亡，并且自噬在DEHP 誘導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮了重要的毒性作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，MEHP 各劑量組LC3-Ⅱ的表達水平與對照組相比均升高；與對照組相比，MEHP 低劑量組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1 的表達水平無明顯變化，而中、高劑量MEHP 組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1 的表達水平均升高。DAA+MEHP 組和DAA 組LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表達水平均升高，DAA+MEHP 組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例也升高。說明一定濃度的MEHP 能引起TM-3 細胞中自噬小體的積累；DAA 作為甲基化抑制劑，能夠降低整體m6A 修飾的水平，進而導(dǎo)致自噬小體的累積。Wang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸吲哚氧基通過調(diào)節(jié)RNA 中的肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和m6A 甲基化來激活自噬通量，3-脫氮腺苷抑制m6A 甲基化后可以阻斷硫酸吲哚氧基對細胞自噬激活的影響，上述發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果相似。有研究顯示，敲除m6A 去甲基化酶FTO 后，降低了Atg5 和Atg7 的表達水平，導(dǎo)致自噬體形成減少，最終自噬被抑制[25]。

綜上所述，MEHP 可能通過降低RNA 甲基化m6A 修飾的水平來誘導(dǎo)TM-3 細胞發(fā)生自噬，這些發(fā)現(xiàn)揭示了m6A 甲基化在MEHP 致TM-3 細胞自噬中的重要作用，為鄰苯二甲酸酯類與雄性生殖毒性的相關(guān)性研究提供研究基礎(chǔ)，但關(guān)于PAEs 的雄性生殖毒性的作用機制還有待進一步探索與研究。