岳曉琪，牛騰耀，詹靜慧，高 強(qiáng)，張艷麗

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，銀川 750004）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜增生為特征的慢性炎性自身免疫病。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Tregs）發(fā)揮免疫抑制作用，屬于CD4+T 細(xì)胞亞群，可誘導(dǎo)免疫耐受，預(yù)防自身免疫性疾病發(fā)生。其關(guān)鍵性表型特征在于表達(dá)叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）。Foxp3 在CD4+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要功能。研究發(fā)現(xiàn)，T 淋巴細(xì)胞數(shù)目減少或功能缺陷可能與RA發(fā)病相關(guān)，特別是濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）和Treg 細(xì)胞失衡造成免疫功能的紊亂[1-2]。由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分化而來的濾泡調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（follicular T regulatory cell，Tfr）表達(dá)Treg 細(xì)胞標(biāo)記物細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）和Foxp3。Tfr 細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（interlenkin，IL）-1R2 和IL-1Ra 抑制Tfh 活化，并通過CTLA-4 抑制B7-1 和B7-2 在生發(fā)中心（germinal center，GC）B 細(xì)胞的表達(dá)，具有抑制GC 形成和B 細(xì)胞發(fā)育的功能[3-4]。濾泡輔助性T 細(xì)胞對(duì)于B 細(xì)胞的激活、抗體類別轉(zhuǎn)換和GC 的形成至關(guān)重要。Tfh 細(xì)胞的特征在于高度表達(dá)程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）分子，主要抑制T 細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）和CD28 共刺激。研究[5]發(fā)現(xiàn)，Tfh 細(xì)胞對(duì)同源B細(xì)胞呈遞的抗原敏感，Tfh 細(xì)胞PD-1 的高表達(dá)反映了抗原刺激的經(jīng)歷，尤其是在GC 內(nèi)[6]。CTLA-4（CD152）是T 細(xì)胞上的一種跨膜受體，可以與CD28 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7 分子配體誘導(dǎo)T 細(xì)胞無反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)[7]。

氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）是從寧夏道地藥材苦參中提取的單體生物堿[8]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，OMT 可糾正膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠脾Tfr 細(xì)胞和Tfh 細(xì)胞的數(shù)量失衡，降低自身抗體的產(chǎn)生，從而緩解小鼠的RA，但未涉及T 細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控機(jī)制的研究。本研究擬通過建立CIA 小鼠模型，探討OMT 是否可調(diào)節(jié)T 細(xì)胞CTLA-4 和PD-1 的表達(dá)而緩解RA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物模型建立 從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買36 只SPF 級(jí)、6～7 周齡、體質(zhì)量18～22 g/只的雄性DBA/1J 小鼠SCXK（京2016-0011），飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥物 地塞米松磷酸鈉注射液（產(chǎn)品批號(hào)：獸070011145）［5 mg/（2 mL/支）］購自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司；OMT（產(chǎn)品批號(hào)：20200102）購自寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司，純度99%。

1.1.3 試劑 牛源性Ⅱ型膠原（產(chǎn)品批號(hào)：20022）、不完全弗氏佐劑（批號(hào)：7002）及完全弗氏佐劑（批號(hào)：7001）購于Chondrex 公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（批號(hào)：RR820A）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR036A）均購于TaKaRa 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（批號(hào)：RS0001）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（批號(hào)：RS0002）、兔抗Foxp3 多克隆抗體（批號(hào)：YT6169）、兔抗CTLA-4 多克隆抗體（批號(hào)：YT5933）、小鼠抗β-actin 多克隆抗體（批號(hào)：YM3128）均購于ImmunoWay 公司；小鼠抗PD-1 多克隆抗體（批號(hào)：ab52587）購于Abcam 公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 RT-qPCR 儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：FTC-3000H）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher 飛公司，型號(hào)：1510）；凝膠成像儀（GE，型號(hào)：AI600 images）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：Universal Power Supply）；乳化儀（上海昂尼儀器儀表有限公司，型號(hào)：AD145S-P）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建CIA 小鼠模型 將DBA/1J 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、OMT 組和地塞米松組，每組9 只。將體積比1∶1 完全乳化后的牛源性Ⅱ型膠原與等體積完全弗氏佐劑皮下多點(diǎn)注射于除正常組以外的各組小鼠背部以及尾部，0.1 mL/只，正常組注射等體積生理鹽水，21 d 后改用不完全弗氏佐劑同樣的方式加強(qiáng)免疫。造模后第15 天，地塞米松組采取藥物干預(yù)措施，持續(xù)7 d，腹腔注射地塞米松2.8 mg·kg-1，7 d 后以1.4 mg·kg-1劑量維持；OMT 組依據(jù)Wang 等[11]和本課題組前期研究，本次實(shí)驗(yàn)OMT 的濃度為180 mg·kg-1；每次0.1 mL/只，每日給藥1 次，直至造模結(jié)束；正常組和模型組注射等體積生理鹽水。治療30 d 后根據(jù)相關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)定處死全部小鼠。

1.2.2 觀測(cè)和評(píng)估CIA 小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）和關(guān)節(jié)腫脹度 由同一個(gè)檢測(cè)人員每隔3 d 對(duì)小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行AI 分級(jí)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，小鼠足紅腫程度評(píng)為0～4 分，最高為16 分，AI 評(píng)分≥1 分為造模成功[12]。在評(píng)分的過程中使用游標(biāo)卡尺測(cè)量并計(jì)算CIA 小鼠關(guān)節(jié)腫脹度［關(guān)節(jié)腫脹度=踝關(guān)節(jié)厚度×爪關(guān)節(jié)厚度］，連續(xù)記錄至第45 天。

表1 AI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察關(guān)節(jié)滑膜組織的異位GC 將關(guān)節(jié)和脾臟切片提前置于68 ℃烘箱中2 h 以上，進(jìn)行固定和脫水處理后，蘇木精染色10 min，1%鹽酸乙醇溶液處理10 s，氨水返藍(lán)20 s，超純水沖洗1 min，1%伊紅染色1 min，完成后續(xù)步驟以后滴加中性樹膠封片觀察。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中Foxp3、CTLA-4 和PD-1 的表達(dá) 無菌取小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜并脫鈣處理，對(duì)脫鈣后的小鼠踝關(guān)節(jié)進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋及切片和脫蠟處理。分別將兔抗Foxp3 多克隆抗體、兔抗CTLA-4 多克隆抗體和小鼠抗PD-1 多克隆抗體1∶1 000 稀釋后室溫孵育3 h。滴加適量的HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠或兔IgG 抗體，室溫孵育30 min，用PBS 沖洗3 次。滴加現(xiàn)配DBA 顯色液并不斷地觀察顏色變化情況，8 min 后終止顯色反應(yīng)。封片，干燥后在顯微鏡下進(jìn)行觀察并記錄。

1.2.5 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備 無菌條件下取脫頸處死小鼠的新鮮脾臟，充分研磨脾臟；在15 mL 離心管中加入4 mL 小鼠淋巴細(xì)胞分離液，800×g 離心30 min；吸取云霧狀白膜層，用PBS 補(bǔ)齊至5 mL，再250×g 離心10 min，棄上清并收集脾臟淋巴細(xì)胞沉淀。

1.2.6 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中總RNA 提取及qPCR 檢測(cè) 將上述得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行總RNA 提取，收集總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列見表2。反應(yīng)條件：95 ℃的條件下變性5 s，60 ℃的條件下退火10 s，72 ℃的條件下延伸5 s，循環(huán)40 次；通過2-ΔΔct計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

1.2.7 Western blot 檢測(cè)Foxp3、CTLA-4 和PD-1蛋白的表達(dá)水平 將收集好的小鼠脾細(xì)胞于冰上裂解25 min 后4 ℃12 000×g 離心5 min，提取上清即為全蛋白。使用BCA 蛋白定量法檢測(cè)提取蛋白的總量，經(jīng)8%的SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5%的脫脂奶粉封閉2 h。將兔抗Foxp3 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗CTLA-4 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗PD-1 多克隆抗體（1∶500）滴加于目的條帶，4 ℃孵育過夜。隨后二抗室溫孵育2 h，PBS 洗滌后滴加ECL 發(fā)光液曝光，隨后采用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用one-way ANOVA 分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OMT 緩解CIA 小鼠關(guān)節(jié)腫脹度并降低關(guān)節(jié)評(píng)分

從初次免疫后開始計(jì)算到第15 天，模型組、地塞米松組、OMT 組的小鼠關(guān)節(jié)與正常組相比差異無明顯變化。第15 天以后，相比正常組，模型組、地塞米松組、OMT 組的小鼠關(guān)節(jié)腫脹度和評(píng)分開始升高。在初次免疫18 d 后，相比于模型組，OMT 組與地塞米松組關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)評(píng)分的升高較為緩慢，并且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，其腫脹程度逐漸緩解，關(guān)節(jié)評(píng)分亦降低（P 均<0.05），見圖1A。HE 結(jié)果顯示，正常組的小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)幾乎不存在炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，模型組小鼠炎性細(xì)胞呈大面積浸潤(rùn)，OMT 組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度有所改善，見圖1B。

圖1 OMT 對(duì)CIA 小鼠關(guān)節(jié)的影響

2.2 OMT 處理增加CIA 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Foxp3、CTLA-4 表達(dá)并降低PD-1 表達(dá)

通過RT-qPCR 和Western blot 檢測(cè)位于脾臟淋巴細(xì)胞的Foxp3、CTLA-4 和PD-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。采用免疫組化法檢測(cè)小鼠后肢踝關(guān)節(jié)滑膜中Foxp3、CTLA-4 和PD-1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的脾臟淋巴細(xì)胞CTLA-4 和Foxp3 的mRNA 和蛋白表達(dá)量降低，PD-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)量升高（P 均<0.05）。與模型組相比較，OMT 組、地塞米松組的脾臟淋巴細(xì)胞PD-1 mRNA 和蛋白表達(dá)量降低，CTLA-4 和Foxp3 的mRNA 和蛋白表達(dá)量升高（P 均<0.05），見圖2A、圖2B。小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中免疫組化檢測(cè)結(jié)果與脾臟淋巴細(xì)胞中的結(jié)果相一致，見圖2C。

圖2 OMT 對(duì)CIA 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Foxp3、CTLA-4、PD-1 表達(dá)的影響

3 討論

RA 是一種滑膜和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥變化、間充質(zhì)組織中廣泛纖維蛋白樣變性以及骨結(jié)構(gòu)的萎縮和稀疏的慢性全身性疾病，自身抗體的異常產(chǎn)生是其發(fā)病的主要機(jī)制之一[13-15]。CIA 動(dòng)物模型在臨床特征和免疫學(xué)改變等方面與人類RA相似，在RA 的研究中被廣泛應(yīng)用[16-18]。本課題組前期研究[19]發(fā)現(xiàn)，OMT 可下調(diào)CIA 小鼠脾濾泡輔助性T 細(xì)胞和B 細(xì)胞數(shù)量，抑制小鼠血清IL-21表達(dá)，緩解關(guān)節(jié)炎癥，但對(duì)免疫負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制未做探討。

RA 的發(fā)展與淋巴細(xì)胞免疫紊亂和異?；罨牧馨图?xì)胞亞群密切相關(guān)，特別是在CD4+T 細(xì)胞相關(guān)的亞群中[20-22]。IL-21 通過誘導(dǎo)CD4+T 分化為Tfh 細(xì)胞，與GC B 細(xì)胞表面的IL-21 受體結(jié)合，促進(jìn)B 細(xì)胞向漿細(xì)胞分化并最終產(chǎn)生大量抗體，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜損傷[23-24]。在CD4+T 細(xì)胞分化為負(fù)性免疫調(diào)控細(xì)胞Treg 的過程中，IL-21和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）起著重要的作用，Treg細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受從而發(fā)揮免疫抑制作用，預(yù)防自身免疫性相關(guān)疾病的發(fā)生。Tfr 細(xì)胞由Treg 細(xì)胞分化而來，它與Treg 細(xì)胞具有某些共同的特征，高表達(dá)Foxp3 和CTLA4 還可促進(jìn)機(jī)體分泌細(xì)胞炎性因子IL-10 和TGF-β，具有抑制GC 形成、Tfh 細(xì)胞和自身反應(yīng)性B 細(xì)胞發(fā)育的功能[25]。協(xié)同刺激分子PD-1 與PD-L1、PD-L2 結(jié)合可以抑制T、B 細(xì)胞的活化與相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在維持機(jī)體免疫耐受的過程中具有重要作用。

研究[5]顯示，當(dāng)Tfh 細(xì)胞的PD-1 與組成表達(dá)PD-1 配體1（PD-L1）的B 細(xì)胞結(jié)合時(shí)，PD-1 進(jìn)一步限制了Tfh 細(xì)胞CXCR3 的上調(diào)，使這些細(xì)胞向GC 聚集，因此，PD-1 以共刺激非依賴和依賴的方式工作，控制Tfh 細(xì)胞的組織定位和功能[26-27]。Tan 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1 缺陷小鼠的血液和淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Foxp3+）增加，從而增強(qiáng)了抑制能力，并在體內(nèi)有效地抑制了Tfh 細(xì)胞。Foxp3+需要CD28 和ICOS 信號(hào)，但被PD-1/PD-L1 抑制，因此，PD-1 亦會(huì)抑制Tfr細(xì)胞的免疫負(fù)調(diào)控作用，調(diào)節(jié)進(jìn)入外周血的Tfr細(xì)胞數(shù)量。CTLA-4 通過與T 淋巴細(xì)胞表面的CD28 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7 分子配體參與了免疫反應(yīng)進(jìn)程中的負(fù)性調(diào)節(jié)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OMT 可降低CIA 小鼠關(guān)節(jié)評(píng)分并緩解CIA 小鼠關(guān)節(jié)腫脹度，增加脾淋巴細(xì)胞Foxp3 及CTLA-4 的表達(dá)，降低PD-1 的表達(dá)。推測(cè)OMT 可能通過降低PD-1 的表達(dá)、增加CTLA-4 的表達(dá)調(diào)控Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量和功能，從而緩解RA，但詳盡的負(fù)向免疫學(xué)調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)深入研究。