景曉瑩，彭 亮，謝娜娜，呂環(huán)環(huán)，黨 潔，2，馬占兵，2

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004）

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一種惡性程度極高并具有高度侵襲性的消化道惡性腫瘤。因其5 年生存率不足7%，是惡性腫瘤中預后最差的[1-2]。PDAC 早期的癥狀隱匿、不典型[3]，約80%的患者被確診時為中晚期或出現轉移，已錯失最佳手術根治的窗口和機會。即使成功實施手術干預，術后12 個月內的復發(fā)率和轉移率仍高達60%[4]。因此，準確有效的生物標記物篩選及其分子機制研究對于PDAC的診斷、治療和不良預后改善具有十分重要的臨床意義和研究價值。

加權基因共表達網絡（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）已被廣泛用于尋找各種癌癥中的樞紐基因。癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫中缺乏正常組織的PDAC 樣本，差異表達數據不完整。因此，本研究整合基因型-組織表達數據庫（genotypetissue expression，GTEx）數據庫中正常對照組織的表達數據，有效地克服TCGA 數據庫對照樣本不足的問題。通過差異表達分析，獲得PDAC 原發(fā)癌全面的轉錄組表達譜，并使用WGCNA、蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI）網絡分析結合表達生存分析，獲得核心風險基因，以識別潛在準確的PDAC 生物標記物。

1 材料與方法

1.1 數據獲取與處理

PDAC 組織的RNA-seq 數據來自TCGA，匹配的正常組織表達數據來自GTEx[5]。過濾去除基因表達值低于lcpm 剪切閾值80%以上的樣本，通過filterByExpr 函數去除表達矩陣中不表達或低表達的基因。最后納入共312 個樣本，包含147 例原發(fā)腫瘤組織，165 例正常組織（圖1）。

圖1 數據下載、處理和分析流程

1.2 差異表達分析

使用edgeR 包篩選差異表達基因（differential expression genes，DEGs），以>1且調整P<0.05 為標準，篩選DEGs 并繪制熱圖和火山圖。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

基因本體（gene ontology，GO）包含生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）3 個部分的信息，可用于基因歸類注釋[6]。京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）是整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的通路注釋數據庫[7]。本研究采用FunRich 軟件對PDAC 的DEGs 進行GO 和KEGG富集分析及可視化[8]。

1.4 WGCNA 的構建和分析

通過WGCNA R 包構建加權基因共表達網絡[9]。根據無尺度網絡擬合指數和平均連接度，選擇合適的軟閾值，以確保無標度拓撲，使其滿足無尺度網絡和較好的網絡連接性。利用拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix，TOM）相似度和相應的不相似度（diss TOM）將鄰接度轉換為TOM。用動態(tài)樹切分法將至少30 個高度相關的共表達基因聚集成不同顏色的模塊[10]。WGCNA 采用分層聚類方法識別基因模塊，并用不同顏色來表示。通過計算模塊和臨床表型之間的相關性（correlation），篩選出與臨床表型顯著相關的基因。最后，計算模塊內的基因表達與性狀的相關性GS 值和某個基因表達與模塊內基因主成分表達的相關系數MM 值，設置參數cor.gene Module Membership>0.8 和cor.gene Trait Significance>0.2，從而識別和鑒定出模塊基因。

1.5 PPI 的構建和核心基因篩選

獲得候選核心風險基因，利用Cytoscape Gene MINIA 插件，構建PPI 網絡和MCODE 插件篩選網絡核心基因。采用默認參數，聚類算法為MCC。

1.6 核心風險基因的功能分析

使用GEPIA2 在線數據庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）對篩選出的PDAC 核心風險基因進行表達、生存分析，其生存分析主要包括生存率和風險比（hazard ratio，HR）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.7 核心風險基因的臨床診斷價值評價

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線，并計算ROC 曲線下的面積（area under curve，AUC），評估對腫瘤和正常組織的區(qū)分能力。

2 結果

2.1 DEGs 的篩選

經選取上調和下調各Top 50 的基因進行無監(jiān)督垂直聚類分析，結果顯示，DEGs 能夠顯著區(qū)分PDAC 組織和正常組織（圖2A）。經差異表達分析，共篩選出4 346 個DEGs，其中包含2 284個上調基因和2 062 個下調基因（圖2B）。

圖2 差異表達基因聚類熱圖和火山圖

2.2 DEGs 的GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

為進一步分析DEGs 的功能，將DEGs 輸入FunRich 進行GO 和KEGG 富集分析。DEGs 中BP 主要包括細胞外和質膜整體等（圖3A）；CC主要包括細胞通訊和細胞生長等（圖3B）；MF 主要包括細胞黏附分子活性和受體活性等（圖3C）。KEGG 通路富集分析PDAC 中的DEGs 與間充質向上皮細胞轉變（EMT）、上皮細胞向間充質轉變（MET）和整合素細胞表面相互作用等信號通路密切相關（圖3D）。

圖3 DEGs 的GO 和KEGG 富集分析

2.3 WGCNA 的構建及分析

通過繪制樣本聚類樹，設定剪切高度為90，去除異常值（圖4A），進行樣本聚類和表型關聯分析（圖4B）。根據無尺度網絡擬合指數和平均連接度計算軟閾值（圖4C），根據基因模塊連通性確定軟閾值（圖4D），選取β=10（無標度R2=0.8，斜率=-2.11）作為網絡構建軟閾值（圖4E），并根據TOM 矩陣構建基因間的分層聚類樹（圖4F）。表型-模塊關聯分析結果顯示，lightgreen 模塊與TNM 分期有相關性（r=0.33，P=0.02），magenta模塊與腫瘤大小程度有相關性（r=0.3，P=0.03），grey 模塊與組織學分級有相關性（r=0.34，P=0.02）（圖5A～圖5C），且能夠較好區(qū)分腫瘤組織和正常對照（圖5D）。進一步將lightgreen、magenta 和grey 模塊分別作為關鍵模塊進行GS 和MM 分析，lightgreen 模塊的GS 與MM 有相關關系（r=0.27，P<0.001）（圖6A）；magenta 模塊的GS與MM 有相關關系（r=0.39，P<0.001）（圖6B）；grey模塊的GS 與MM 有相關關系（r=0.54，P<0.001）（圖6C）。對各顏色模塊的連通性進行分析，發(fā)現lightgreen 模塊的基因顯著性與連通性有相關關系（r=0.33，P=0.001 3）；magenta 模塊的基因顯著性與連通性有相關關系（r=0.12，P=0.046）；grey模塊的基因顯著性與連通性有相關關系（r=-0.26，P=0.006 8）（圖6D）。最后，經過多重檢驗矯正后P<0.01，剔除非編碼基因后，lightgreen 模塊篩選出42 個基因，magenta 模塊篩選出271 個基因，grey 模塊篩選出96 個基因，后結合差異表達分析結果，最終篩選出50 個基因（表1）。

圖4 加權基因共表達網絡的構建

圖5 共表達模塊與臨床表型的相關性分析

表1 從每個模塊中選擇的核心基因

2.4 PPI 構建和核心基因篩選

采用Cytoscape 構建WGCNA 模塊基因的PPI 網絡。設置參數cor.gene Module Membership>0.8 和cor.gene Trait Significance>0.2 用于篩選模塊中的核心基因。共獲得36 個候選基因，采用聚類分析方法和MCC 算法，最后獲得22 個核心基 因（TOP2A、MAD2L1、TPX2、RACGAP1、PRC1、KIF23、NUSAP1、PLK1、SMC4、CHEK1、CENPU、CENPN、TYMS、FEN1、PCNA、CDC6、INCENP、ARHGAP11A、SPAG5、ATAD2、RRM1、NCAPG2）（圖7）。PPI 網絡中顏色是MCC 分析的度量值映射，圈的大小是PPI 得分映射。

圖7 PPI 構建和核心基因篩選

2.5 核心風險基因的表達和生存分析

通過在線網站GEIPA 搜尋PPI 網絡得分前10 個的核心風險基因在PDAC 和正常組織中的表達趨勢。結果顯示，核心基因在PDAC 樣本中的表達量均高于正常對照組（P 均>0.05）（圖8A～圖8J）。生存分析顯示，TPX2（HR=2.2，P=0.000 26）、PRC1（HR=2，P=0.001 3）、KIF23（HR=1.9，P=0.002 9）、RACGAP1（HR=1.9，P=0.003 1）和NUSAP1（HR=1.8，P=0.004 6）等核心基因高表達與PDAC不良預后均相關（圖9A～圖9J）。

圖8 前10 個核心基因在腫瘤組織和非腫瘤組織中差異表達的箱線圖

圖9 前10 個核心基因的生存分析曲線

2.6 核心風險基因的診斷價值

10 個基 因 的AUC 值（MAD2L：0.999、TPX2：0.998、TOP2A：0.997、RACGGAP1：0.995、KIF23：0.995、NUSAP1：0.995、PLK1：0.992、PRC1：0.989、SMC4：0.986、CHEK1：0.986）均>0.5，表明核心風險基因對腫瘤和正常組織具有良好的區(qū)分和診斷能力（表2）。

表2 基于不同核心風險基因預測PDAC 的ROC 分析

3 討論

PDAC 是一種病死率高、診療困難的消化道惡性腫瘤，預后極差。對于腫瘤發(fā)生潛在機制的研究可能是PDAC 診斷、治療和延長患者生存時間的關鍵。高通量測序技術的發(fā)展為其分子病理、臨床診斷和靶向治療提供了新的希望[11]。

WGCNA 作為有效的基于表型-基因表達權重關聯分析的方法，能夠有效提取高維基因表達數據中有效的模塊信息，已被廣泛用于疾病相關基因的挖掘[12]。在本研究中，通過聯合GTEx 中正常組織數據，有效克服TCGA 數據庫中PDAC 正常對照缺乏的問題，剔除異常和低表達樣本，通過差異表達分析，最終獲得了PDAC 全面的轉錄組表達譜，為PDAC 基因表達和功能研究提供了較好的數據集。

經差異表達分析，本研究共篩選出4 346 個DEGs，其中上調基因2 284 個，下調基因2 062個。對前125 個上調和下調基因聚類分析顯示，DEGs 可以顯著區(qū)分PDAC 組織和正常組織。通過富集分析，模塊基因所涉及的BP 主要包括細胞外、質膜整體和質膜；CC 主要包括細胞通訊、細胞生長和信號轉導；MF 主要包括細胞黏附分子活性、受體活性和催化活性。利用WGCNA 分析篩選了與PDAC 組織學分級、腫瘤大小和TNM分期密切相關的grey 模塊、magenta 模塊和lightgreen 模塊，進一步區(qū)分共表達網絡和36 個PPI網絡候選基因。通過生物信息學分析鑒定出10個核心基因，包括TOP2A、MAD2L1、TPX2、RACGAP1、PRC1、KIF23、NUSAP1、PLK1、SMC4、CHEK1，最后經過ROC 曲線的驗證，與PDAC 的進展和預后密切相關。這些核心基因的表達在PDAC 和正常組織之間差異有統(tǒng)計學意義。同時，它們與PDAC 的組織學分級高度相關，可能是潛在的生物標記物。以上結果可能有助于改善PDAC 患者的治療決策、風險分層和預后預測。

這10 個核心基因通過對腫瘤細胞周期的調控，參與了腫瘤的發(fā)生和增殖。本研究中，篩選獲得的NUSAP1、PRC1 和SMC4 基因在PDAC 中研究相對較少。其中，NUSAP1 是一種在多種生物學功能中起著關鍵作用的微管相關蛋白，包括紡錘體組裝、染色體分離、胞質分裂、微管交聯、捆綁和附著在染色體上[13]。研究[14]表明，NUSAP1 參與了多種人類惡性腫瘤的生物學行為調控，如胰腺癌、膠質母細胞瘤、肝細胞癌、前列腺癌、胃癌等。PRC1 是有絲分裂早期CDK1（Cdc2/細胞周期蛋白B）磷酸化的細胞質分裂所必需的微管相關蛋白。PRC1 被敲除的細胞通常經歷間期、前期和中期；但紡錘體中心區(qū)域的結構在后期出現異常，導致細胞因子的異常表達和雙核或多核細胞的形成[15]，從而促進腫瘤的發(fā)生和進展[16]。PRC1的過表達可通過調節(jié)Wnt 信號通路的致癌作用，導致早期復發(fā)和患者的不良預后。PRC1 的下調也被證明可以顯著抑制胃癌細胞的增殖，減少單層集落的形成，并抑制胃癌細胞的侵襲性和轉移[16]。PRC1 在PDAC 中異常表達，并顯著富集于EMT過程中，提示PRC1 基因可能通過Wnt 信號通路參與PDAC 的EMT 過程，但需要進一步實驗研究證明。SMC4 是細胞分裂中的凝縮蛋白，參與細胞分裂過程中的染色體凝集、姐妹染色單體的凝聚、DNA 修復和復制[17]。SMC4 可通過激活宮頸癌中的NF-κB 通路促進宮頸癌的發(fā)生[18]。在侵襲性乳腺癌細胞中，SMC4 的mRNA 表達上調。上調的mRNA 可以提高CDK1 在進入有絲分裂時驅動染色質壓縮的敏感性，增強癌細胞的侵襲性、增殖活性和去分化能力[18]。SMC4 的高表達可能通過增強TOP2A 的作用而增加雙鏈DNA 斷裂，并導致乳腺上皮細胞中的突變、錯配和獨特的染色體重排[19]。過表達SMC4 可激活JAK2/Stat3和TGFβ/Smad 通路，促進癌細胞的侵襲性[20]。SMC4 與PDAC 的發(fā)病機制密切相關，其高表達導致PDAC 的預后差[17，21]。

綜上所述，本研究經過不同生物信息學分析方法，發(fā)現grey 模塊與PDAC 組織學分級高度相關，結合表達和生存分析，從模塊中篩選出了TPX2、PRC1、KIF23、RACGAP1、NUSAP1、PLK1、SMC4、MAD2L1、TOP2A、CHEK1 等核 心風險基因。以上基因中，部分已在PDAC 相關研究中報道，而大部分基因在PDAC 中作用機制尚無明確報道。通過注釋發(fā)現，核心風險基因可能通過調控細胞周期、DNA 復制、EMT 等生物學過程參與PDAC 的發(fā)病和預后，但上述基因的功能需要進一步實驗證實?？傊?，本研究通過系統(tǒng)的基因差異表達和WGCNA 分析，進一步結合生存分析和ROC 曲線的驗證，發(fā)現了一系列重要的PDAC 核心風險基因，為PDAC 未來的臨床診療與更好的預后干預提供了潛在的分子理論基礎。