李肖寒 程雪丹 張智博 胡博凱 段少峰

摘要：目的 合成透明質(zhì)酸（HA）-綠原酸（CGA）的水溶性綴合物HA-CGA并對其結(jié)構(gòu)進行表征，并比較該綴合物與單體藥物CGA的抗菌活性。方法 將HA溶于水中，用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）將其活化，然后加入溶于DMF的CGA進行酯化反應(yīng)，最后將反應(yīng)溶液在水中透析除雜，凍干，得到綴合物HA-CGA，并采用核磁共振氫譜法、紅外光譜法對HA-CGA結(jié)構(gòu)進行表征；采用平板計數(shù)法來比較CGA和HA-CGA對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等2種細菌的抑制作用。結(jié)果 CGA和HA-CGA對2種細菌均有不同程度的抑制作用，其中HA-CGA抗菌活性強于CGA。結(jié)論 通過HA對CGA的結(jié)構(gòu)進行修飾，增加了CGA的水溶性，進一步提高了CGA的抗菌性能。

關(guān)鍵詞：綠原酸；透明質(zhì)酸；綴合物；水溶性；抗菌活性

中圖分類號：R9文獻標(biāo)志碼：A

Abstract Objective To synthesize and characterize the water-soluble conjugate of hyaluronic acid （HA）-chlorogenic acid （CGA） （HA-CGA）， and to compare the antibacterial activity of the conjugate with that of the free drug CGA. Methods? ?HA was dissolved in water， activated by 1-ethyl-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride （EDC·HCl）， and followed by the addition of a solution of CGA dissolved in DMF for esterification reaction. Finally， the reaction solution was dialyzed in water to remove impurities and then lyophilized to obtain the conjugate HA-CGA. The structure of HA-CGA was characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy （1H NMR） and infrared spectroscopy （FT-IR）. The inhibitory effects of CGA and HA-CGA on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were compared by the plate counting method. Results CGA and HA-CGA had different inhibitory effects on the two bacteria， and the antibacterial activity of HA-CGA was stronger than that of CGA. Conclusion By modifying the structure of CGA with HA， the water solubility of CGA was increased and its antibacterial activity was further improved.

Key words Chlorogenic acid; Hyaluronic acid; Conjugated; Water soluble; Antimicrobial activity

綠原酸（chlorogenic acid， CGA）又名咖啡寧酸，屬于苯丙素類物質(zhì)，主要存在于忍冬科忍冬屬和菊科嵩屬植物中，是人類飲食中含量最豐富的多酚類化合物之一，是某些植物產(chǎn)生的一組酚類次生代謝產(chǎn)物，是咖啡的重要成分[1-3]。CGA表現(xiàn)出很好的生物學(xué)特性，具有抗病毒、抗菌、消炎、清除自由基等多種藥理作用[4-6]。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）又名玻璃酸，在高等動物體內(nèi)以及人體各組織內(nèi)廣泛分布[7]，是天然存在于細胞外基質(zhì)和滑膜液的一種線性大分子酸性黏多糖[8]，是細胞外基質(zhì)的重要組成部分[9]。HA具有高親水性、優(yōu)異的生物相容性以及生物可降解性，因此HA多用于結(jié)構(gòu)修飾其他藥物，進而來增加該藥物的水溶性，提高其生物利用度[10-12]。

本研究重點對CGA的抗菌性能進行了研究，但發(fā)現(xiàn)CGA的水溶性差，在25℃水中的溶解率僅5%[13]，這大大影響了它的抗菌性能。利用水溶性良好的透明質(zhì)酸對綠原酸進行結(jié)構(gòu)修飾，得到的綠原酸綴合物水溶性良好，其抗菌性能也得到了大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 儀器

VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）；AVANCE-400 MHz型核磁共振氫譜儀（瑞士Bruker BioSpin有限公司）；LDZX-75KBS型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；PHSJ-4F型PH計（中國上海儀器公司）；BSD-YX2200型立式智能精密搖床（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療制備廠）；SW-SJ-2D型雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺（中國蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；BCD-516WKM（E）型電冰箱（合肥美的電冰箱有限公司）；LGJ-18B型冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；BSA224AS-CW型電子分析天平（賽多利斯儀器有限公司）；WLF-250型純化水設(shè)備（泰州萬隆水處理工程有限公司）；移液槍（各種規(guī)格，上海佳安分析儀器廠）；90 mm玻璃培養(yǎng)皿（江蘇華夏瑞泰塑業(yè)有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸（純度98%）購于埃法生物有限公司；透明質(zhì)酸（批號1905012，分子量8000 Da）購于山東福瑞達生物有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCL）均購于國藥試劑公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP）購于上海阿拉丁公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購于天津德恩有限公司；酵母浸粉、瓊脂、蛋白胨購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.3 綠原酸綴合物的合成

精密稱定403 mg（1.05 mmol）的透明質(zhì)酸（HA，分子量為8000 Da）溶于4 mL蒸餾水，在磁力攪拌器下使HA溶脹均勻；然后將768 mg（4 mmol）的EDC和12.9 mg（0.1 mmoL）的DMAP加入到HA水溶液中，在冰浴的條件下，經(jīng)攪拌活化2 h；將354.3 mg（1 mmol）的CGA完全溶解于4 mL DMF并加入上述反應(yīng)中；室溫攪拌24 h，將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量3500 Da）進行透析。透析后，將溶液轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，在-20℃冰箱預(yù)冷凍2 h后置于冷凍干燥機中進行凍干，2 d后取出即得HA-CGA。

1.4 抑菌實驗

1.4.1 液體培養(yǎng)基的制備

1 g蛋白胨、1 g氯化鈉和0.5 g酵母粉溶解在100 mL蒸餾水制成細菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)基，進行高壓滅菌，備用。

1.4.2 菌液制備

取500 μL凍存的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，分別接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫搖床上振搖12 h，再從上述液體培養(yǎng)基中取500 μL，加入新的50 mL的滅菌液體培養(yǎng)基中，再在37℃恒溫搖床上振搖12 h，按此方法培養(yǎng)到第三代，后續(xù)抗菌實驗均用第三代菌種進行。

1.4.3 藥液制備

以滅菌后的PBS（pH 7.4）為溶劑，將HA、CGA、HA-CGA分別配置成15、10 和1 mg/mL的母液備用。臨配置前，需將所需藥物照紫外滅菌。在這里需要注意的是，在配置1 mg/mL HA-CGA母液時，根據(jù)其接枝率約為24%來算得HA-CGA中CGA的含量來進行母液濃度配置。

1.4.4 最低殺菌濃度（MBC）的測定

首先將金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌菌液稀釋成1×104 CFU/mL備用，再將配置的母液依次稀釋成所需的藥物濃度。以金黃色葡萄球菌為例，分為HA、CGA、HA-CGA 3組，各取7只滅菌試管并進行編號，無菌操作，每管共分別加入0.9 mL不同藥物濃度的HA、CGA、HA-CGA以及PBS試劑，第7管加入滅菌后的0.9 mL PBS（pH 7.4）作為陽性對照。各管再加入0.1 mL稀釋好的菌液，在37℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h，然后再從各管中取出0.1 mL均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板表面，再將其放置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h，取出后，對瓊脂板的菌落數(shù)進行讀數(shù)。重復(fù)該實驗3次，未見菌落生長的最低濃度則為最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振氫譜分析

2.1.1 HA的核磁圖譜表征結(jié)果

1H NMR （400 MHz， D2O） δ4.63～4.53 （m， 1H）， 4.49 （d， J=6.8 Hz， 1H）， 3.99～3.28 （m， 11H）， 2.07 （d， J=17.2 Hz， 3H），結(jié)果如圖1所示。

2.1.2 CGA的核磁圖譜表征結(jié)果

1H NMR （300 MHz， MeOD） δ 7.49 （d， J=15.9 Hz， 1H）， 6.97 （d， J=2.0 Hz， 1H）， 6.90～6.82 （m， 1H）， 6.70 （d， J=8.2 Hz， 1H）， 6.19 （d， J=15.9 Hz， 1H）， 5.26 （td， J=9.1， 4.5 Hz， 1H）， 4.09 （dt， J=6.3， 3.2 Hz， 1H）， 3.68～3.52 （m， 1H）， 3.24 （dt， J=3.2， 1.6 Hz， 3H）， 2.06 （tdd， J=17.8， 13.6， 6.4 Hz， 4H）。結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 HA-CGA的核磁圖譜表征結(jié)果

合成的HA-CGA為淡綠色粉末，δ（4.25～4.75 ppm）處的位移為HA上的特征氫，δ（7.5～8.0 ppm）處的位移為CGA上的特征氫，通過積分計算可以得知HA和CGA的接枝率約為24%。核磁數(shù)據(jù)如圖3所示。

2.1.4 HA、CGA、HA-CGA的FT-IR分析

HA、CGA 、HA-CGA的FT-IR圖譜如圖4所示。在HA中，在3385 cm-1處的吸收峰為-OH伸縮振動峰，1613 cm-1為羧基上的C=O伸縮振動峰；在CGA中，在3347 cm-1處的吸收峰為-OH伸縮振動峰，1687 cm-1為酯基上的C=O伸縮振動峰。在HA-CGA中，在3391 cm-1處的吸收峰為HA和CGA上的-OH伸縮振動峰，1613 cm-1為HA-CGA上的羰基峰，和CGA上1687 cm-1的C=O伸縮振動峰相比，峰形變寬，說明HA和CGA以酯鍵連接。這也證明了HA-CGA的生成。

2.2 抑菌實驗結(jié)果

HA的抗菌效果如圖5所示，高濃度的HA作用于大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，菌落和空白對照組相比，無明顯變化，由此可以判定HA幾乎沒有抗菌作用?？咕荂GA的生物特性之一，實驗結(jié)果見圖6，不同濃度下的CGA表現(xiàn)出不同的抗菌效能，濃度越高，殺菌能力越強，對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MBC均為7 mg/mL。由圖7可知，HA-CGA對大腸埃希菌的MBC大約為0.7 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC大約為0.8 mg/mL，與CGA單體的殺菌效果相比，HA-CGA的殺菌效果明顯更為顯著。

3 討論與展望

抗菌性是CGA的藥理作用之一，但因其水溶性差，生物利用度低，嚴(yán)重影響了它的抗菌性能。因此，本課題中，選用水溶性天然高分子材料HA作為藥物載體，通過酯化反應(yīng)對CGA的結(jié)構(gòu)進行改造，使其通過酯鍵與HA形成水溶性綴合物，以期提高CGA的水溶性差和生物利用度低，進而改善其抗菌性能。HA為天然高分子材料，易于降解，對實驗的影響可以忽略。本反應(yīng)條件溫和，操作簡單，便于一次性大劑量合成。

本實驗通過采用核磁共振氫譜法、紅外光譜法對合成的綠原酸綴合物HA-CGA的結(jié)構(gòu)進行了表征。結(jié)果證明，CGA成功地接枝到了HA上，且CGA接枝率為24%；采用平板計數(shù)法得出CGA和HA-CGA對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌這2種細菌均有不同程度的抑制作用，并且HA-CGA的抗菌活性比單體藥物CGA強，初步證實了通過HA結(jié)構(gòu)修飾，CGA的水溶性得到了提高，且抗菌能力得到了改善。因此，水溶性HA-CGA作為一種新型抑菌材料，具有較大的應(yīng)用前景。同時，本研究工作也為改造其他難溶性抗菌藥物提供了新思路。

參 考 文 獻

王慶華， 杜婷婷， 張智慧， 等. 綠原酸的藥理作用及機制研究進展[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 2020， 55（10）： 2273-2280.

王玲娜， 姚佳歡， 馬超美. 綠原酸的研究進展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報， 2017， 36（11）： 1121-1130.

Naveed M， Hejazi V， Abbas M， et al. Chlorogenic acid （CGA）： A pharmacological review and call for further research[J]. Biomed Pharmacother， 2017， 97： 67-74.

Meng S， Cao J， Feng Q， et al. Roles of chlorogenic acid on regulating glucose and lipids metabolism： A review[J]. Evid Based Complement Altern Med， 2013， 2013： 801457.

魏宇超， 孫磊， 徐美利， 等. 綠原酸的體外抑菌效果研究[J]. 飼料研究， 2020， 43（7）： 69-72.

Farah A， Monteiro M， Donangelo C M， et al. Chlorogenic acids from green coffee extract are highly bioavailable in humans[J]. J Nutr， 2008， 138（12）： 2309-2315.

楊潔， 祝宏， 劉永瓊， 等. 透明質(zhì)酸的制備及其應(yīng)用進展[J]. 化學(xué)與生物工程， 2005， 22（1）： 7-9.

陳建澍， 王婧茜， 易喻， 等. 透明質(zhì)酸及其衍生物研究進展[J]. 中國生物工程雜志， 2015， 35（2）： 111-118.

張蕾， 吳迪， 孫巍， 等. 透明質(zhì)酸的制備及應(yīng)用研究進展[J]. 微生物學(xué)雜志， 2006， 26（2）： 100-103.

李霞， 王玉玲， 郭學(xué)平. 透明質(zhì)酸在外用傳遞系統(tǒng)中的應(yīng)用研究進展[J]. 中國美容醫(yī)學(xué)， 2021， 30（1）： 177-180.

張堃， 簡軍， 張政樸. 透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)、性能、改性和應(yīng)用研究進展[J]. 高分子通報， 2015， 28（9）： 217-226.

胡樂堅， 劉富壘， 李凌超， 等. 兩親性透明質(zhì)酸衍生物的合成及其在抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用[J]. 藥學(xué)進展， 2017， 41（11）： 804-811.

Karunanidhi A， Thomas R， Van B A， et al. In vitro antibacterial and antibiofilm activities of chlorogenic acid against clinical isolates of stenotrophomonas maltophilia including the trimethoprim/sulfamethoxazole resistant strain[J]. Biomed Res Int， 2012， 2013（2013）： 392058.

基金項目：河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關(guān)）項目（No. 212102311025）；大學(xué)生創(chuàng)新項目（No. MSCXSY-2020-079）

作者簡介：李肖寒，女，生于1998年，在讀碩士研究生，主要研究方向為藥劑學(xué)，E-mail： 2841226891@qq.com