陳星月 劉婧嫻 劉瑛

摘要：目的 對上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院引起非妊娠成人患者血流感染的無乳鏈球菌進行毒力基因檢測和分子分型研究。方法收集上海市某三甲醫(yī)院2012—2020年分離的引起非妊娠成人患者血流感染的無乳鏈球菌（group B Streptococcus，GBS）臨床菌株，通過病例系統(tǒng)收集相應患者的臨床資料進行統(tǒng)計分析。采用MALDI-TOF MS對菌株進行鑒定；采用Vitek-2 Compact聯(lián)合紙片擴散法（K-B法）進行藥物敏感試驗；采用PCR方法和瓊脂糖凝膠電泳方法進行與菌株黏附、侵襲和免疫逃逸相關的毒力基因檢測；采用多重PCR方法進行血清學分型；采用MLST方法進行分子分型研究，分型結果采用Bionumeric 8.0軟件分析菌株間親緣關系。結果 2012—2020年共分離到13株符合入組條件的GBS菌株，相應患者人群以中老年為主，占92.4%；男女比例為3.3：1，且大部分患者有心律失常、糖尿病或肝硬化等基礎疾病。藥敏結果提示菌株對氨芐西林、萬古霉素、利奈唑胺、青霉素、頭孢曲松、替加環(huán)素等抗菌藥物仍然保持高度敏感，對克林霉素耐藥率最高達84.6%，其次是四環(huán)素（61.5%）和紅霉素（53.8%）。黏附作用相關基因中fbsB、pavA基因攜帶率100%，而菌毛編碼基因gbsPC1的攜帶率最低（46.15%）；侵襲力相關基因中cylX、cylD、cylG、acpC、cylZ、cylA、cylB、cylE、cylF、cylI、cylJ、cfb、hylB和bca基因的攜帶率100%，cylK和spb1的攜帶率較低分別為7.69%和38.45%，rib基因在13株菌種均未檢出。免疫逃避相關基因中cpsF、cpsE、cpsD、cpsB、neuA、neuD、neuC、neuB和pbp1A的基因攜帶率為100%，bac、cpsJ、cpsI、cpsG的攜帶率較低。菌株的血清學分型以Ⅰb型為主，占38.5%（5/13）；13株菌共分為10種ST型，同源性分析顯示菌株親緣關系較遠。結論 無乳鏈球菌引起非妊娠成人患者血流感染的危險因素可能為高齡、男性以及心律失常等基礎疾病，菌株對克林霉素、四環(huán)素耐藥率較高，且攜帶較多毒力基因，血清分型以Ⅰb型為主，但ST分型較為分散，未出現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢。

關鍵詞：無乳鏈球菌；成人；血流感染；莢膜血清型；毒力基因；多位點序列分型

中圖分類號：R978? ? ? ? 文獻標志碼：A

Abstract Objective To investigate the virulence genes and molecular typing of Streptococcus agalactiae which caused bloodstream infection in non-pregnant adult patients in Xin Hua Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Methods The Streptococcus agalactiae （GBS） isolated from blood culture in non-pregnant adult patients， were collected from 2012 to 2020 in Xinhua Hospital， clinical data of the patients were collected from medical records for statistical analysis. The strains were identified by MALDI-TOF MS. The drug sensitivity test was performed by VITEK-2 Compact combined with paper diffusion method （K-B method）. The virulence genes related to adhesion， invasion and immune escape were detected by PCR and agarose gel electrophoresis. The serotyping was performed by multiplex PCR. MLST method was used for molecular typing study， and Bionumeric 8.0 software was used to analyze the relationship among the strains. Results From 2012 to February 2020， a total of 13 strains of GBS met the inclusion criteria were collected. The majority of patients were middle-aged and elderly， accounting for 92.4%. The male-female ratio was 3.3：1， and most patients had underlying diseases such as arrhythmias， diabetes or cirrhosis of the liver. The strains were still highly sensitive to ampicillin， vancomycin， linezolid， penicillin， ceftriaxone， tigecycline and other antibiotics， but the resistance rate of clindamycin was up to 84.6%， followed by tetracycline （61.5%） and erythromycin （53.8%）. In adhesion related genes， the positive rate of fbsB and pavA genes was 100%， while gbsPC1 was low （46.15%）. Among the invasiveness related genes， the positive rate of cylX， cylD， cylG， acpC， cylZ， cylA， cylB， cylF， cylI， cylJ， cfb， hylB， and bca genes were 100%， while for cylK and spb1 were 7.69% and 38.45%， respectively. rib gene was not detected in 13 strains. Among the genes related to immune evasion， the positive rate of cpsF， cpsE， cpsD， cpsB， neuA， neuD， neuC， neuB and pbp1A was 100%， while for bac， cpsJ， cpsI and cpsG the positive rate was low. The main serotype in these strains was Ⅰb， accounting for 38.5% （5/13）. The 13 isolates were divided into 10 STs， and homology analysis showed that the isolates had a distant genetic relationship. Conclusion The risk factors of Streptococcus agalactiae bloodstream infections in adult patients may be older， male， and basic diseases such as arrhythmia. Streptococcus agalactiae isolated from non-pregnant adults had high resistance rate in clindamycin， tetracycline， and carried many virulence genes. The major serotype of these strains was Ⅰb， but there were no sign of outbreak trend observed since no specific ST was found prevalence.

Key words Group B Streptococcus; Adult; Bloodstream infection; Capsular serotype; Virulence gene; Multi-locus sequence typing

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），是一種革蘭染色陽性、觸酶陰性的兼性厭氧菌，呈球形或卵圓形。因其菌體表面具有革蘭陽性B組抗原，又被稱為B族鏈球菌（group B Streptococcus，GBS）。既往研究表明GBS是導致新生兒及孕婦侵襲性疾病的主要致病菌之一，然而，近年的研究數(shù)據(jù)表明，非妊娠成人群體的GBS感染率逐漸升高，患者多存在基礎疾病、免疫低下或者存在免疫功能缺陷[1-4]。B族鏈球菌可引起非妊娠成人患者各種類型的感染，其中發(fā)展成膿毒血癥的患者預后通常較差[5]。 雖然無乳鏈球菌對青霉素和頭孢菌素類仍保持很高的敏感性，然而，美國一家醫(yī)療中心的回顧性病例對照研究顯示，采用敏感抗生素治療無乳鏈球菌感染時，仍有28%的失敗率[6]。

鑒于非妊娠成人GBS感染的形勢日趨嚴峻，而目前有關引起非妊娠成人無乳鏈球菌血流感染相關的研究較少，對于此類感染的臨床特點及相關菌株的分子特點認識尚不全面，故本研究擬通過對上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院2012—2020年從非妊娠成人血培養(yǎng)標本分離到的GBS菌株進行的血清分型情況、MLST分型情況及毒力基因檢測情況進行分析，旨在為非妊娠成年患者無乳鏈球菌血流感染的臨床診治及預防控制提供理論科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

2012—2020年上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院非妊娠成人患者血培養(yǎng)標本中分離到的GBS菌株，置于甘油肉湯中-80℃凍存，待用。

1.1.2 試劑

質譜基質液HCCA（Sigma，德國）、VITEK GN67 藥敏板（BioMérieux，法國）、細菌基因組 DNA 提取試劑盒（上海生工生物工程公司），聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）試劑（TAKARA，日本）。PCR引物及PCR產物測序委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.1.3 儀器

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）（Bruker Daltonics，德國）、VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀（Bruker Daltonics，德國）、PCR 基因擴增儀（Eppendorf，德國）、紫外照膠儀器（Bio-Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

將待測菌株接種于血瓊脂平板37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取平板中待測菌落涂抹于靶板，加1 μL甲酸裂解，干燥后加1 μL基質液，晾干，靶板裝載上機，進行質譜鑒定。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC8739。

1.2.2 菌株藥敏試驗

采用Vitek-2 Compact全自動藥敏分析系統(tǒng)聯(lián)合K-B紙片擴散法對菌株進行藥敏試驗，結果根據(jù)2020版美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）M100進行判讀。檢測藥物包括氨芐西林、萬古霉素、左氧氟沙星、克林霉素、利奈唑胺、紅霉素、青霉素、頭孢曲松、替加環(huán)素和四環(huán)素。

1.2.3 菌株毒力基因檢測

采用PCR方法檢測與黏附有關的基因fbsA，fbsB，pavA，scpB，lmb以及GBS菌毛編碼基因，與侵襲有關的基因cylX，cylD，cylG， acpC， cylZ， cylA， cylB， cylE， cylF， cylI， cylJ， cylK， cfb， spb1， hylB， rib和bca以及與免疫逃逸相關的基因bac， cpsM， cpsIaJ， cpsJ， cpsI， cpsG， cpsF， cpsE， cpsD， cpsC， cpsB， cpsA， neuA， neuD， neuC， neuB， cspA和pbp1A。各毒力基因的引物及PCR反應條件見參考文獻[7]。

1.2.4 菌株血清學分型

采用多重PCR方法檢測菌株的血清型。無乳鏈球菌血清型（Ⅰa、Ⅰb和Ⅱ～Ⅷ）擴增引物、PCR擴增條件及判讀標準參見參考文獻[8]。

1.2.5 MLST分型及同源性分析

參考GBS的MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https：//pubmlst.org/sagalactiae/info/primers.sh tml）推薦的方案，合成adhP、atr、glcK、glnA、pheS、sdhA和tkt等7對管家基因擴增引物和7對測序引物序列。擴增條件：94℃預變性3 min；94℃ 1min，56℃ 45 s，72℃?1 min，30個循環(huán)；72℃ 5min，擴增產物經一代序列測定，測序結果在 MLST 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫比對確定菌株分型，采用Bionumeric 8.0軟件分析菌株之間的親緣關系。

2 結果

2.1 臨床信息

自2012—2020年2月共分離到13株符合入組條件的GBS菌株，對應13例患者。男女患者性別比例為 3.3：1，患者人群以中老年為主，占92.4%，GBS血流感染時最主要的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和精神不振，69.23%患者存在基礎疾病，15.4%（2/13）合并金黃色葡萄球菌血流感染，全因死亡率7.7%（1/13）如表1所示。

2.2 藥敏結果

13株無乳鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗結果見表2。所有菌株對氨芐西林、萬古霉素、利奈唑胺、青霉素、頭孢曲松和替加環(huán)素等保持敏感，克林霉素耐藥率最高為84.6%，四環(huán)素耐藥率次之為61.5%，紅霉素耐藥率為53.8%，左氧氟沙星耐藥率為30.8%。13株菌中53.85%（7/13）為多重耐藥菌株。

2.3 毒力基因分析

13株無乳鏈球菌，有25個毒力基因檢出率為100%，包括fbsB、pavA、cylX、cylD、cylG、acpC、cylZ、cylA、cylB、cylE、cylF、cylI、cylJ、cfb、hylB、bca、cpsF、cpsE、cpsD、cpsB、neuA、neuD、neuC、neuB和pbp1A。檢測出5個毒力基因檢出率為92.31%，包括scpB、lmb、cpsC、cpsA和cspA。5個毒力基因檢出率為76.9%，包括fbsA、gbsPC2、gbsPC3、gbsPC4和gbsPC5。有3個基因檢出率為15.38%，包括bac、cpsJ和cpsI。有2個基因的檢出率為30.77%，包括spb1和cpsIaJ。其他毒力基因檢出率為cpsM（84.62%）、cpsG（23.08%）、gbsPC1（46.15%）和cylK（7.6%）。但在任何分離菌株中均未發(fā)現(xiàn)rib基因。各毒力基因的檢出情況如表3所示。

2.4 血清學分析

13株無乳鏈球菌分為 6個血清型，Ⅰb占 38.46%（5/13），Ⅰa、Ⅲ和Ⅴ均占 15.38%（2/13），Ⅵ、Ⅶ型各檢出1株，未檢出Ⅱ、Ⅳ及Ⅷ型。如表3所示。

2.5 MLST及同源性分析

13株菌種共分為10種ST分型，分別為ST1、ST8、ST10、ST12、ST19、ST103、ST234、ST529、ST1037、ST1318，其中ST1037、ST1318為本研究發(fā)現(xiàn)的新類型，見表3。ST10、ST1372、ST12僅存在單個等位基因差異，屬于同一個克隆復合群（colonal complex， CC），且上述類型菌株的血清分型均為Ⅰb型。本地區(qū)Ⅰb/CC12型菌株較其他類型流行更為廣泛，但并未出現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢。其他類型菌株之間的親緣關系較遠，以散發(fā)流行為主（圖1）。

3 討論

無乳鏈球菌為常見的革蘭陽性鏈球菌，在非妊娠成年人群中，可以廣泛定植在下消化道、泌尿道和生殖道。當機體免疫力下降的時候，可引起嚴重侵襲性感染，如膿毒血癥、心內膜炎、腦膜炎等[5]。無乳鏈球菌引起非妊娠成人侵襲性感染性疾病中最常見的類型為血流感染，患者通常同時合并其他細菌感染，以金黃色葡萄球菌最為多見 [1，9-10]。近年來，GBS引起非妊娠成年人的感染率呈逐年上升趨勢，估計每年發(fā)病率為每10萬名患者中出現(xiàn)4至11名，主要是免疫力低下或免疫缺陷的群體，在極少數(shù)情況下，GBS也會導致免疫功能正常成年人發(fā)生嚴重感染[1-4]。在本研究中，13例無乳鏈球菌血流感染的非妊娠成年患者中位年齡為67歲，主要以中老年患者為主，且大部分患者存在糖尿病、肝硬化等基礎疾病，且15.4%（2/13）患者合并金黃色葡萄球菌感染。

目前治療GBS感染仍推薦首選青霉素類藥物；而對該類藥物過敏的患者主要是選用大環(huán)內酯類藥物或者林可霉素類藥物替代[11]。近年來，無乳鏈球菌對于紅霉素和克林霉素的耐藥率逐步升高，美國CDC已將耐克林霉素無乳鏈球菌列為值得關注的耐藥菌之一。在上海地區(qū)開展的一項研究顯示，GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為69.0%和50.6%[7]。阿根廷一項對非妊娠患者無乳鏈球菌的研究中，也發(fā)現(xiàn)紅霉素和克林霉素耐藥的菌株[12]。本研究中，GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為53.84%和84.61%，耐大環(huán)內酯類GBS的出現(xiàn)和流行將給青霉素過敏患者GBS感染的治療帶來挑戰(zhàn)。因此，臨床中應注意抗生素合理使用，避免耐藥菌株的傳播和流行。

本研究檢測的45個毒力基因按照功能主要分為3大類：黏附作用相關、侵襲力相關以及免疫逃避相關。本研究納入的菌株大部分攜帶fbsB、pavA、scpB及l(fā)mb等黏附作用相關基因。fbsA和fbsB編碼的纖維蛋白原結合蛋白（fibrinogen-binding protein）、lmb編碼的層粘連蛋白結合蛋白（laminin-binding protein），主要通過黏附上皮細胞，使GBS免受調理吞噬作用[13-15]。而由pavA編碼的纖維結合蛋白可以介導纖連蛋白黏附于上皮細胞[16]。C5a肽酶是一種由scpB基因編碼絲氨酸蛋白，通過與纖連蛋白黏附于上皮細胞；同時可以使人類的補體趨化因子C5a裂解，阻止中性粒細胞聚集到感染部位[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，非妊娠成人GBS菌株在侵襲相關毒力基因攜帶率很高，14個侵襲相關毒力基因陽性率為100%。所有GBS攜帶兩種穿孔毒素，即β-H/C和CAMP因子的編碼基因。β-H/C是由cyl操縱子編碼，是一種表面相關的多能性毒素，參與溶血素和色素生成，可以侵入宿主細胞的各種屏障，例如肺上皮細胞或內皮細胞以及血腦屏障[18]。cfb基因編碼的CAMP 因子可在細胞膜上的富集誘導細胞膜結構變化而形成膜孔，導致細胞破裂[19]。國外研究發(fā)現(xiàn)，由spb1編碼的另一種溶血素蛋白在血清型Ⅲ型的 GBS 菌株中更為多見，并且毒力更強[20]，但本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶spb1基因的菌株均為CC12型，與文獻報道存在一定差異。GBS主要通過莢膜多糖、莢膜唾液酸、絲氨酸蛋白酶A等介導免疫逃逸。本研究的菌株neu編碼基因、cspA基因、PBP1a基因陽性率為100%，但莢膜多糖編碼基因的攜帶情況存在較大差異。GBS的莢膜多糖由cps基因簇編碼，主要通過兩種機制阻止免疫系統(tǒng)清除病原體；防止補體沉積和吞噬作用[21]。莢膜唾液酸（Sia），其合成由neu編碼基因，可以產生一種分子模擬形式，使GBS表面形成與宿主細胞表面的相似區(qū)域，進而逃避宿主的免疫激活[22]。cspA毒力基因表達的絲氨酸蛋白酶A除了能裂解纖維蛋白原外，還可介導趨化因子裂解中性粒細胞，減弱中性粒細胞調理吞噬作用的能力[23]。青霉素結合蛋白（PBP1a）在GBS對吞噬細胞清除的抗性中發(fā)揮重要作用，能夠強化GBS對于抗菌肽的抗性[24]。

在大多數(shù)國家或地區(qū)的報道中，分離自非妊娠成人患者的GBS血清型主要為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型[1，25-26]，總體上，V型最為常見，但無乳鏈球菌的血清型分布具有區(qū)域性差異[27-28]。法國一項多中心研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅴ型血清型的無乳鏈球菌株所引起的感染占總病例數(shù)的91.0%[9]。在美國，非妊娠成人感染患者中分離到的GBS血清型主要為Ⅰa型和Ⅴ型，但是Ⅰb、Ⅱ、Ⅳ型菌株的檢出率逐年上升[2]。 根據(jù)一項匈牙利研究，在性病患者中，無乳鏈球菌最常見的類型為V型，此外高致病性Ⅲ/ST17型GBS的檢出率為27.1%[27]。在國內，臺灣地區(qū)感染成年患者的GBS以Ⅵ，Ⅰb 和Ⅴ為主[29]，上海地區(qū)以Ⅲ、Ⅰa、Ⅴ、Ⅰb 和Ⅱ最為多見[7]，而北京則以Ⅲ最多，其次為Ⅰa、Ⅰb 和Ⅴ[30]。本研究發(fā)現(xiàn)引起非妊娠成人患者血流感染的GBS菌株，血清型以Ⅰb為主，其次為Ⅰa，Ⅲ型，與國內地區(qū)報道較為一致。

既往研究表明ST和莢膜血清型之間存在一定相關性。根據(jù)美國和加拿大的研究，非妊娠成人患者感染的GBS主要為V型，其中，92%V型分離株的ST型為ST-1型[31]。此外，也有研究顯示，Ⅰb型與ST10和ST12，Ⅲ型與ST19和ST17有顯著相關性[7]，在本次實驗中，也發(fā)現(xiàn)血清型和ST型具有一致性的現(xiàn)象，如ST-19型菌株的血清型為Ⅲ型，而CC12克隆復合群的菌株均為Ⅰb型。Hall等[32]的一項meta分析顯示，引起妊娠婦女感染的GBS以Ⅰa型最為常見，占31%，其次為Ⅲ型，占27%。感染妊娠婦女的GBS分子流行病學還存在一定的地域差異，在塞爾維亞，Ⅲ/ST17 和 V/ST1是最常見的類型[33]，而我國分離自妊娠患者的GBS菌株中，最常見的分子型則為Ⅲ/ ST19型[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)引起非妊娠成人患者血流感染的GBS菌株以Ⅰb/CC12菌株最為常見，占38.46%，這提示該類型菌株可能更容易引起非妊娠患者侵襲性感染?？傮w而言本研究分離的菌株親緣關系較遠，未發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢ST型及暴發(fā)流行趨勢。

本研究存在一些不足，比如本研究為單中心研究，且分離株數(shù)量較少，故研究結果存在一定局限性，后續(xù)還需多中心、多區(qū)域的研究，納入更多數(shù)量的菌株進行分析以進一步明確。

參 考 文 獻

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作者簡介：陳星月，女，生于1998年，主要從事無乳鏈球菌分子流行病學研究。E-mail： chenxy9746@163.com