張鴻娟 孟雪斐 宋貴波 單斌

摘要：目的 系統(tǒng)性評價膠體金免疫層析法在耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（CRE）碳青霉烯酶型檢測中的價值及性能情況，為實驗室進行CRE碳青霉烯酶快速檢測提供可靠依據(jù)。方法 對收集的70株無菌部位分離的CRE菌株同時使用PCR擴增、基因測序和膠體金免疫層析法進行碳青霉烯酶型檢測，以測序結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評價膠體金免疫層析法的實驗室檢測性能。結(jié)果 檢出碳青霉烯酶基因69株，其中KPC型49株，OXA-48型12株，IMP型1株，NDM型3株，同時檢出KPC和OXA-48型2株，同時檢出OXA-48和NDM型1株，同時檢出KPC和NDM型1株，未檢出以上5種基因型1株。膠體金免疫層析法結(jié)果與測序結(jié)果相比靈敏度100%，特異度97.1%。不符合2株，其中1株為測序結(jié)果同時存在KPC和OXA-48兩種型，膠體金檢測結(jié)果為KPC型；1株為測序結(jié)果同時存在KPC和NDM兩種型，膠體金檢測結(jié)果為KPC型。結(jié)論 膠體金免疫層析法作為一種新的CRE碳青霉烯酶型檢測方法，操作簡單，結(jié)果容易判讀，能夠短時間內(nèi)檢測出CRE中的產(chǎn)KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶的情況，靈敏度和特異度能夠滿足臨床需求，可作為實驗室進行碳青霉烯酶型快速檢測的方法，指導(dǎo)臨床診治CRE。

關(guān)鍵詞：耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌；膠體金免疫層析法；碳青霉烯酶

中圖分類號：R978.1文獻標(biāo)志碼：A

Abstract Objective To systematically evaluate the value and performance of colloidal gold immunochromatography in the carbapenem enzyme type detection of carbapenem resistant Enterobacteriaceae （CRE）， so as to provide a reliable basis for the rapid detection of CRE carbapenem enzyme in the laboratory. Methods 70 CRE strains isolated from sterile sites were collected， and the carbapenem enzyme type was detected by PCR amplification， gene sequencing， and colloidal gold immunochromatography. Taking the sequencing results as the reference standard， the laboratory detection performance of colloidal gold immunochromatography was evaluated. Results Carbapenemase gene was detected in 69 strains， including 49 strains of KPC type， 12 strains of OXA-48 type， 1 strain of IMP type and 3 strains of NDM type， 2 strains of KPC and OXA-48 type， 1 strain of OXA-48 and NDM type， 1 strain of KPC and NDM type， and strains of the above five genotypes were not detected. Compared with the sequencing results， the sensitivity of colloidal gold immunochromatography was 100%， and the specificity was 97.1%， which was inconsistent between the two strains. There were two types of KPC and OXA-48 at the same time in one strain， and the colloidal gold detection result was a KPC type. The other was sequenced and there were two types of KPC and NDM at the same time， and the colloidal gold detection result was a KPC type. Conclusion Colloidal gold immunochromatography can be used as a new method for the detection of carbapenem type of CRE， with simple operation and easy interpretation of the results. It can detect the production of KPC， OXA-48， VIM， IMP， and NDM carbapenem in CRE in a short time. Its sensitivity and specificity can meet the clinical needs， and thus it can be used as a method for rapid detection of the carbapenem type in the laboratory to guide clinical diagnosis and treatments of CRE.

Key words Carbapenem-resistant Enterobacterales; Colloidal gold immunochromatography; Carbapenemase

細菌耐藥已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，其中尤以耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（Carbapenem-resistant Enterobacterales， CRE）引起的感染形勢最為嚴峻。產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌目細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的最主要機制[1]。不同國家、不同地區(qū)、不同醫(yī)院、不同人群以及不同細菌所產(chǎn)的碳青霉烯酶種類均有差異[2-4]。不同種類的抗菌藥物對產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的抗菌活性不同[5-7]。因此，準(zhǔn)確、快速地對CRE產(chǎn)生的碳青霉烯酶進行檢測分型，對于臨床抗感染治療的精準(zhǔn)用藥和醫(yī)院感染預(yù)防控制具有重要的價值。本文以臨床無菌部位分離的CRE菌株為研究對象，以碳青霉烯酶基因測序結(jié)果為參考，探討膠體金免疫層析法在CRE碳青霉烯酶型檢測中的性能情況、操作過程中的注意事項，為實驗室進行CRE碳青霉烯酶型快速檢測提供方法依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020年1月—2021年8月住院及門診送檢的無菌部位標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，藥敏結(jié)果為亞胺培南或美羅培南不敏感的腸桿菌目細菌，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株，存放于-80℃冰箱。

1.2 儀器和試劑

生物安全柜（英國Baker公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）、凝膠電泳圖像分析儀（美國GE公司）、基因擴增熱循環(huán)儀（西安天隆科技有限公司）、Powerpac3000型電泳儀（美國伯樂公司）、超低溫冰箱（美國Thermo公司）、高速離心機（德國Eppendorf公司）、渦旋儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）、 BlasTaq 2×PCR Master-MIX（批號：69180008）購自ABM生物科技有限公司、RNase/DNase-free 純水（批號：766070AH）購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司、哥倫比亞血瓊脂平板（批號：20210102B）、MH瓊脂平板（批號：2021031B）購自鄭州安圖生物工程股份有限公司、NG-Test? CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒（膠體金免疫層析法）（批號：W21010311）購自長沙中生眾捷生物技術(shù)有限公司，美羅培南藥敏紙片（批號3324297）購自英國Oxoid公司。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控菌株

參照2021年CLSI M100-S31進行結(jié)果判讀。陰性質(zhì)控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706；陽性質(zhì)控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，每次實驗進行陰性、陽性質(zhì)控。

1.4 方法

1.4.1 菌株復(fù)蘇與鑒定

將菌株保存管從-80℃冰箱取出，平衡至室溫，顛倒混勻菌液，采用三區(qū)劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂平板，放于CO2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。次日觀察菌落形態(tài)，單一類型菌落使用質(zhì)譜儀進行種屬鑒定，鑒定結(jié)果與保種信息一致，進行進一步實驗。

1.4.2 表型驗證試驗

采用改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method， mCIM）進行表型確證試驗。取1 μL接種環(huán)滿環(huán)生長于瓊脂平板上的過夜培養(yǎng)純菌落，于2 mL TSB肉湯中，震蕩混勻10～15 s。每管放入一張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認紙片浸沒于菌懸液中。35℃±2℃大氣環(huán)境孵育4? h±15 min。孵育結(jié)束時，立即用生理鹽水制備1.5×108 CFU/mL的大腸埃希菌ATCC25922菌懸液。菌懸液制備和平板涂布在15 min內(nèi)完成，干燥3～10 min。用10 μL接種環(huán)將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，將紙片貼于試管內(nèi)壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH瓊脂平板上，倒置平板，35℃±2℃大氣環(huán)境孵育18～24 h；量取抑菌圈直徑。

1.4.3 碳青霉烯酶基因檢測

煮沸法裂解提取細菌DNA，擴增的碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：RNase/DNase-free水15.0 μL，BlasTaq 2×PCR MasterMIX 25.0 μL，模板4.0 μL，引物F 3.0 μL，引物R 3.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s（30個循環(huán)）；72℃延伸5 min。引物序列[8]及退火溫度見表1。引物由北京擎科生物有限公司合成，擴增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳時間30 min。電泳結(jié)果顯示為陽性的擴增產(chǎn)物，送北京擎科生物有限公司進行測序分析。測序結(jié)果與GenBank中提供的序列進行比較（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.4.4 膠體金免疫層析法檢測碳青霉烯酶型

打開NG-Test? CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒（膠體金免疫層析法），在試劑盒提供的Ep管中滴入5滴提取緩沖液，使用1 μL的接種環(huán)挑起一滿環(huán)細菌加入Ep管，合上Ep管。渦旋儀混合震蕩30 s，室溫放置10 min。取出檢測卡盒，使用一次性移液管，吸取5滴制備好的混合液加入到測卡標(biāo)記的“S”樣本孔。室溫放置15 min，讀取結(jié)果。按照C區(qū)域中出現(xiàn)一條紅線并且在K、O、V、I和N檢測區(qū)域中出現(xiàn)一條或多條紅線，判讀為陽性，僅C線區(qū)域出現(xiàn)一條紅線，判讀為陰性，如C線區(qū)域未出現(xiàn)紅線，則不判讀，重新進行檢測。兩名未知測序結(jié)果的實驗室人員分別進行判讀，結(jié)果一致進行統(tǒng)計，結(jié)果不一致，重新進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源情況及分類

本研究中共70株菌株，均來源于無菌部位，其中血液占57.1%（40/70），胸腔積液占17.2%（12/70），腹腔積液占14.3%（10/70），腦脊液占11.4%（8/70）。質(zhì)譜儀種屬鑒定結(jié)果與保種信息一致，其中肺炎克雷伯菌67株，大腸埃希菌1株，產(chǎn)氣克雷伯菌1株，陰溝腸桿菌1株。

2.2 表型驗證試驗

碳青霉烯酶陽性69株，陰性1株。陰性菌株為腦脊液中分離出的肺炎克雷伯菌。

2.3 碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

陽性PCR擴增產(chǎn)物的序列與GenBank中提供的序列進行比較，69株細菌碳青霉烯酶耐藥基因擴增陽性，其中肺炎克雷伯菌66株，大腸埃希菌1株，產(chǎn)氣克雷伯菌1株，陰溝腸桿菌1株。檢出碳青霉烯酶基因為blaKPC 49株，blaoxa-48 12株，blaIMP 1株，blaNDM 3株，同時檢出blaKPC、blaoxa-48型2株，同時檢出blaoxa-48、blaNDM 1株，同時檢出blaKPC、blaNDM 1株，見表2。

2.4 膠體金免疫層析法檢測碳青霉烯酶型

結(jié)果為KPC型51株，OXA-48型12株，IMP型1株，NDM型3株，同時檢出KPC、OXA-48型1株，同時檢出KPC、NDM型1株，陰性結(jié)果1株，見表3。

2.5 兩種方法結(jié)果比較情況

以測序結(jié)果為參考方法，膠體金免疫層析法檢測的碳青霉烯酶型結(jié)果有2例與測序結(jié)果不一致。2例標(biāo)本均為血液中分離出的肺炎克雷伯菌，不符合結(jié)果為1例測序結(jié)果為KPC與OXA-48型，膠體金免疫層析法檢測結(jié)果為KPC型，未檢出OXA-48；1例測序結(jié)果為KPC與NDM型，膠體金免疫層析法檢測結(jié)果為KPC型，未檢出NDM。膠體金免疫層析法在檢測碳青霉烯酶型中的靈敏度為100%（69/69），特異度為97.1%（67/69）。

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物的抗菌譜廣、抗菌活性強，對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細菌具很強抗菌活性，被認為是治療腸桿菌目細菌感染的最后一道防線[9]。隨著臨床廣泛應(yīng)用，CRE在全球范圍內(nèi)流行播散，成為公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。CRE導(dǎo)致的感染耐藥性高、傳播性高、病死率高、增長快。腸桿菌目細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制包括：產(chǎn)碳青霉烯酶，產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白表達下調(diào)或缺失[10]。其中碳青霉烯酶的產(chǎn)生是腸桿菌目細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的最主要機制。2020年由喻華等國內(nèi)知名專家共同撰寫了《腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規(guī)范專家共識》，共識認為免疫層析技術(shù)是目前以細菌菌落為基礎(chǔ)的碳青霉烯酶檢測方法中最快速的檢測技術(shù)[11]。NG-Test? CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒（膠體金免疫層析法）于2020年11月通過國家食品藥品監(jiān)督管理總局上市許可。本研究中檢測結(jié)果有2例與測序結(jié)果不一致，不一致的結(jié)果均為測序結(jié)果檢出兩種碳青霉烯酶基因，膠體金只檢測出其中一種酶型，可能原因是膠體金顯色需要較高濃度的標(biāo)記物，當(dāng)存在多種碳青霉烯酶時，濃度含量較低的酶出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，造成假陰性，需要進一步研究。膠體金免疫層析法結(jié)果判讀由人工完成，不同的人對出現(xiàn)“紅線”的理解不一致。實驗中，一名工作人員認為質(zhì)控線已出，可以進行結(jié)果判讀，另一名工作人員認為雖然在C區(qū)域有一條線，但不是“紅線”，不能進行結(jié)果判讀，需要重新檢測，第二次檢測兩名工作人員都判讀為KPC。實驗中出現(xiàn)第一次檢測時C線區(qū)域出現(xiàn)一條線但不是紅線，K、O、V、I和N檢測區(qū)域中出現(xiàn)疑似紅線。重新進行菌液制備，再次檢測，C線區(qū)域出現(xiàn)紅線再讀取K、O、V、I和N檢測區(qū)域的檢測結(jié)果，檢測結(jié)果與上一次不一致。因此，使用NG-Test? CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒進行碳青霉烯酶檢測時，必須C線區(qū)域出現(xiàn)紅線，才可以判讀結(jié)果，同時由至少兩名工作人員獨立判讀。

國家、地區(qū)、醫(yī)院、人群以及細菌的不同，檢出的碳青霉烯酶種類均有差異[12]。本研究中OXA-48型檢出率較高，占21.7%（15/69），高于文獻報告[2，13-14]。這一方面由于本研究樣本數(shù)量較少而且選擇的菌株全部來源于無菌部位，另一方面由于地區(qū)差異。研究醫(yī)院為省級三級甲等醫(yī)院，接收大量下級醫(yī)院的危重癥患者，15例產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶的菌株中，13例來自轉(zhuǎn)院患者，入院前有當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療史、抗菌藥物使用史，至我院后均入住ICU。研究表明[15]，入住ICU是感染CRE的獨立危險因素。ICU被認為是產(chǎn)生、傳播和擴散CRE耐藥基因的場所。對于ICU患者，CRE定植是其感染的獨立危險因素，與患者死亡高風(fēng)險相關(guān)[16]。CRE定植導(dǎo)致CRE感染率高達16.5%，而且定植發(fā)展為感染的患者病死率更高[17-18]。

對CRE進行主動篩查及干預(yù)，能夠有效降低CRE感染率及患者病死率。有研究顯示，通過開展對入住ICU對患者進行CRE的主動篩查，病房的碳青霉烯酶產(chǎn)生菌的定植率從28.6%下降至5.6%，感染率從35.7%下降至2.8%[19]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)CRE定植、了解CRE感染部位，有助于制定有效的感控措施，預(yù)防和控制CRE在ICU的產(chǎn)生和傳播。研究中，OXA-48型碳青霉烯酶主要存在于肺炎克雷伯菌（14/15），與文獻報告一致[20]。OXA-48型碳青霉烯酶對碳青霉烯類抗菌藥物水解活性低，通常需要產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和/或孔蛋白突變來提供高水平對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性[20]。因此，通過藥敏結(jié)果及表型確認方法對OXA-48型碳青霉烯酶進行診斷可能會漏檢。使用分子方法鑒定碳青霉烯酶的監(jiān)測研究表明，OXA-48型內(nèi)酰胺酶是全球腸桿菌中第二或第三常見的碳青霉烯酶[21]。SMART和INFORM全球監(jiān)測項目的數(shù)據(jù)顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細菌（CPE）中OXA-48的檢出率為27%[22]。在中東、北非和比利時和西班牙等歐洲國家，OXA-48型是腸桿菌中最常見的碳青霉烯酶[21]。在我國，產(chǎn)OXA-48型腸桿菌表現(xiàn)為散發(fā)流行，已波及主要的腸桿菌種類，在常見菌種間克隆流行，而且攜帶OXA-48編碼基因的質(zhì)粒與產(chǎn)KPC的高?？寺T11有融合進化的趨勢，檢出同時攜帶blaKPC-2和blaoxa-48的ST11型肺炎克雷伯菌。耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的ST分型中我國最流行的是ST11型，ST11型克隆株具有在不同內(nèi)源或外源性質(zhì)粒序列間融合和整合的能力，有可能出現(xiàn)OXA-48型耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的克隆傳播，因此需要對其流行趨勢更加系統(tǒng)、深入地監(jiān)測[23]。

CRE引起的侵入感染，病死率高。有研究顯示，我國CRE血流感染30 d病死率為46.2%[24]。研究中無菌部位中CRE感染病死率為31.4%（22/70），低于CRE血流感染30 d病死率，這與本研究的對象中包括胸腔積液、腹腔積液相關(guān)。CRE感染不僅病死率，而且引發(fā)住院時間延長、醫(yī)療成本高、社會及家庭經(jīng)濟負擔(dān)增加等一系列社會問題。有效而規(guī)范的治療方案是提高CRE感染救治率的關(guān)鍵。不同種類的抗菌藥物對產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的抗菌活性不同。如頭孢他啶/阿維巴坦（ceftazidime-avibactam， CAZ/AVI）對產(chǎn)KPC和OXA-48型碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但產(chǎn)B類碳青霉烯酶菌株無抗菌活性[25-26]。治療CRE感染重癥患者的主要方案是聯(lián)合用藥。聯(lián)合用藥能夠發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用、增加抗菌活性以及降低細菌耐藥性的發(fā)生率，治療效果優(yōu)于單藥治療[27]。CRE菌血患者，早期接受充分的抗菌藥物治療患者30 d的生存率顯著高于接受不充分治療的患者[28]。不同類型的碳青霉烯酶具有不一樣的特征。如金屬β-內(nèi)酰胺酶不能水解氨曲南，KPC型碳青霉烯酶的活性可被阿維巴坦、韋博巴坦或雷利巴坦抑制，被克拉維酸弱抑制[11]。實驗室需根據(jù)碳青霉烯酶型進行聯(lián)合藥敏試驗從而指導(dǎo)臨床制定聯(lián)合用藥方案。膠體金免疫層析法可以在30 min進行碳青霉烯酶型檢測，與Carba_NP試驗、改良碳青霉烯滅活試驗、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗等相比不僅速度快，而且可以檢測出具體的酶型，能夠早期指導(dǎo)臨床制定精準(zhǔn)的抗感染治療方案，改善患者結(jié)局。

膠體金免疫層析法操作簡單，對實驗室條件要求低，無需特殊設(shè)備，結(jié)果容易判讀，能夠快速進行KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶的定性檢測，靈敏度和特異度能夠滿足臨床需求，但是該類試劑盒在國內(nèi)上市時間晚，目前價格較高，可以選擇的試劑種類少，大部分省份沒有收費標(biāo)準(zhǔn)，而且只能檢測常見的5種碳青霉烯酶，對于少見酶型或者其他耐藥機制導(dǎo)致的CRE會漏檢。近年來，分子檢測技術(shù)在碳青霉烯酶基因的檢測方法發(fā)展迅速。分子檢測技術(shù)可直接檢測臨床標(biāo)本中CRE菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶基因，但是需要專用的檢測儀器，而且價格更加昂貴，不適用于基層醫(yī)院[29-30]?？傊?，雖然目前膠體金免疫層析法在碳青霉烯酶檢測中有一定的不足，但優(yōu)勢明顯，各級實驗室可結(jié)合臨床需求作為一種檢測碳青霉烯酶的方法進行應(yīng)用。

參 考 文 獻

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基金項目：中國感染病原菌規(guī)范化分層監(jiān)測體系建立與藥物敏感性和耐藥性現(xiàn)狀調(diào)查（No. 2019FY101200和No. 2019FY101209）

作者簡介：張鴻娟，女，生于1988年，主管技師，主要從事臨床微生物與細菌耐藥研究，E-mail： z121159143@qq.com