陳熔 呂曉菊

摘要：目的 應(yīng)用全基因組分析方法對(duì)艱難梭菌感染可能的暴發(fā)流行進(jìn)行識(shí)別和調(diào)查，為艱難梭菌感染防控提供可靠的分子流行病學(xué)基礎(chǔ)。方法 對(duì)8株ST37型艱難梭菌進(jìn)行第二代高通量測(cè)序，并完成序列的拼接和注釋。通過對(duì)其核心基因組進(jìn)行SNP分析，根據(jù)SNP數(shù)量以及相關(guān)臨床資料分析有無院內(nèi)暴發(fā)流行。同時(shí)將Genbank中公布了全基因組序列的艱難梭菌，進(jìn)行MLST分析，對(duì)其分析結(jié)果為ST37的菌株與本研究中的8株菌株進(jìn)行SNP分析比較，了解這8株菌的可能來源。結(jié)果 以最早收集的菌株WCHCD770作為參照，其他7株菌株的SNP值，最大為59，最小為38，提示它們并不是近期發(fā)生的傳播事件。而這8株菌兩兩相互進(jìn)行SNP計(jì)算，其中WCHCD1577、WCHCD1641僅為10，提示它們可能來源于一個(gè)克隆，可能存在院內(nèi)傳播。通過分析比較這8株菌與Genbank中的其他ST37型艱難梭菌發(fā)現(xiàn)，它們的致病決定區(qū)（PaLoc）序列完全相同，證實(shí)了ST37型艱難梭菌的PaLoc在世界范圍克隆傳播，同時(shí)對(duì)它們的SNP比較分析，發(fā)現(xiàn)WCHCD1577、WCHCD1641、WCHCD1216、WCHCD109、WCHCD159與2006年在愛爾蘭分離的菌株M68的SNP最小，WCHCD770、WCHCD1262、WCHCD1450與加拿大分離的菌株VL-0005的SNP最小。提示這些菌株的可能來源。結(jié)論 8株ST37型艱難梭菌可能存在克隆傳播，值得感染防控重視。

關(guān)鍵詞：艱難梭菌；抗生素相關(guān)性腹瀉；多位點(diǎn)序列分型；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號(hào)：R978文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract Objective To identify and investigate the outbreak of Clostridium difficile infection using whole genome sequence， and provide basic molecular epidemiology for preventing and controlling Clostridium difficile ST37. Methods High-throughput genome sequencing and annotation of eight clinical isolates of Clostridium difficile ST37 were completed. Single nucleotide polymorphism was analyzed by the core genome. Whether there is nosocomial infection outbreak was analyzed according to the number of SNPs. The whole genome sequence of Clostridium difficile was deposited in Genbank， and multiple locus sequence typing （MLST） was conducted and analyzed. SNP analysis of ST37 strains and our eight clinical isolates were performed in order to understand the possible source of our eight clinical isolates. Results Using the earliest strain WCHCD770 as the reference， we found the biggest SNPs was 59， the smallest one was 38. It suggested that they were not recent spread events. But the smallest SNP of the eight clinical Clostridium difficile strains was 10， which was between WCHCD1577 and WCHCD1641， indicating possible nosocomial transmission. Comparing to other ST37 strains in Genbank， we found Pathogenicity Locus （PaLoc） sequences of all Clostridium difficile ST37 were identical. It was confirmed that PaLoc of Clostridium difficile ST37 was spread around the world. We found the Clostridium difficile strain M68 which was collected from Ireland in 2006 had smaller SNP than WCHCD1216， WCHCD1577， WCHCD1641， WCHCD109， and WCHCD159. At the same time， the strain VL-0005 which was collected from Canada had smaller SNP than WCHCD770， WCHCD1262， and WCHCD1450. This suggested possible strains source. Conclusion This experiment confirmed the possible spread event and source in Clostridium difficile ST37， which was helpful to guide prevention and control of Clostridium difficile.

Key words Clostridium difficile; Antibiotic-associated diarrhea; MLST; SNP

艱難梭菌是引起抗生素相關(guān)性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea， AAD）和偽膜性腸炎（pseudomembranous colitis， PMC）的重要致病菌[1-3]。自2001年以來，艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection， CDI）在全球呈上升趨勢(shì)，其高毒力菌株P(guān)CR-核糖體分型（RT027）感染在北美和歐洲爆發(fā)流行[4-5]。亞洲國(guó)家對(duì)艱難梭菌的研究相對(duì)較少，RT027引起的CDI只有零星的報(bào)道。相關(guān)報(bào)道中，RT017（MLST分型屬于ST37）為亞洲主要流行型別[6-7]。而中國(guó)大陸目前只有部分大城市醫(yī)院有檢測(cè)和研究報(bào)道[8]。本研究從臨床患者分離獲得8株ST37型艱難梭菌，由于菌株短時(shí)間內(nèi)來源于同一病房，它們之間是否存在院內(nèi)傳播積極探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集四川大學(xué)華西醫(yī)院ICU病房2014年8月—12月臨床腹瀉患者大便標(biāo)本。腹瀉的定義為24 h內(nèi)出現(xiàn)3次或以上的腹瀉。

1.1.2 儀器與試劑

臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），基因擴(kuò)增儀、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），腦心浸出液（BHI）肉湯（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），艱難梭菌選擇培養(yǎng)基CCFA、厭氧產(chǎn)氣袋（英國(guó)Oxoid公司），細(xì)菌DNA提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），SPAdes（序列拼接軟件），Prokka（基因注釋程序），Jmodeltest、PhyML tools（SNP分析軟件）。

1.2 方法

1.2.1 糞便厭氧培養(yǎng)及鑒定

糞便標(biāo)本先用75%酒精處理，再接種于CCFA瓊脂平板，放置于塑料密封袋中，再加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，厭氧指示劑，夾上密封夾，置于培養(yǎng)箱37℃孵育48 h。挑取可疑單個(gè)菌落傳代接種于CCFA培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)48 h后取單個(gè)菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色，置顯微鏡下觀察，經(jīng)生化鑒定為艱難梭菌后，進(jìn)一步采用PCR技術(shù)檢測(cè)毒素基因（tcdA和tcdB）。選取7個(gè)管家基因（adk， atpA， dxr， glyA， recA， sodA和tpi）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將序列與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，分析菌株的ST型別。

1.2.2 基因DNA的提取

ST37型菌株根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書操作，提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.3 全基因組測(cè)序

將提取的艱難梭菌染色體DNA送諾和基因公司進(jìn)行二代測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)使用SPAdes和Prokka軟件進(jìn)行拼接和注釋。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

使用Jmodeltest和PhyML Tools軟件對(duì)收集的ST37型菌株進(jìn)行SNP分析，了解它們是否來源于同一克隆。同時(shí)將我們的菌株與公布了全基因組序列的ST37型菌株共同進(jìn)行SNP分析，了解它們的來源。同時(shí)應(yīng)用軟件（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）分析菌株基因組中的耐藥基因。

1.2.5 菌株的MIC值測(cè)定

按CLSI標(biāo)準(zhǔn)采用瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)ST37型菌株的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

研究期間，124例腹瀉患者糞便中共檢測(cè)艱難梭菌31例，均為產(chǎn)毒性菌株， 其中tcdA+B+菌株23例（74.2%，23/31），經(jīng)MLST分型可分為13個(gè)STs（ST2/3/8/35/54/208/209/210/211/212/213/214/218）。tcdA-B+菌株8例（25.8%，8/31），經(jīng)MLST分型均為ST37型。這8株ST37菌株分別命名為（WCHCD109、WCHCD159、WCHCD770、WCHCD1216、WCHCD1262、WCHCD1450、WCHCD1577和WCHCD1641）。所有ST37菌株在分離前均使用過廣譜抗生素，主要來源于老年患者，男女比例為1：1，臨床腹瀉癥狀較輕，伴有腹脹或腹痛。胃腸道疾病（包括乙肝肝硬化失代償、重癥胰腺炎、腸梗阻術(shù)后、肝移植術(shù)后）為主要的基礎(chǔ)疾?。ū?）。

2.2 全基因組測(cè)序結(jié)果

從表2結(jié)果中可以看出，這8株菌平均基因全長(zhǎng)為5 Mb，平均GC含量為29%，最小的contig數(shù)目為120，平均基因預(yù)測(cè)4000個(gè)基因，且大部分在GenBank中能找到序列相同基因。

2.3 基因組SNP比較分析

將這8株菌染色體基因中的核心基因組（約2Mb序列）除去在連接部位以及用Harvest軟件沒有標(biāo)注“PASS”的，再進(jìn)一步進(jìn)行SNP分析，表3為兩兩菌株之間SNPs比較，根據(jù)臨床資料，WCHCD770為最早收集的菌株，以其作為參照，圖1代表其他菌株與WCHCD770之間的SNPs進(jìn)化樹。據(jù)艱難梭菌每年進(jìn)化突變率，設(shè)定其SNP大于10時(shí)非近期傳播事件。結(jié)果分析顯示了菌株間的親緣關(guān)系，可見WCHCD1577與WCHCD1641在同一分枝上，其SNPs為10，它們相互親緣關(guān)系最近，可能來自同一克隆。而WCHCD770則與WCHCD14-159親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，SNPs為59。 由此可見，全基因組測(cè)序SNP分析能將同一MLST型菌株更準(zhǔn)確地區(qū)分開來，也是克隆傳播分型的最佳方法。

2.4 ST37型艱難梭菌來源分析

對(duì)已公布全基因組的艱難梭菌基因庫659株菌進(jìn)行MLST分析發(fā)現(xiàn)，共有8株為ST37，分別是：

DA00065? （ST37; clinical isolate， recovered in 2010， USA， GenBank accession no. AVIU00000000）

P71? （ST37; clinical isolate， recovered in 2009， USA， GenBank accession no. AVMW00000000）；

P74? （ST37; clinical isolate， recovered in 2009， USA， GenBank accession no. AVMY00000000）；

M68? （ST37; clinical isolate， recovered in 2006， Ireland， GenBank accession no. NC_017175）；

E13? （ST37; clinical isolate， France， GenBank accession no. CAMF00000000）；

002-P50-2011 （ST37; clinical isolate， USA， GenBank accession no. AGAA00000000）；

050-P50-2011 （ST37; clinical isolate， USA GenBank accession no. AGAB00000000）；

VL-0005 （ST37; clinical isolate， Canada， GenBank accession no. CZWV00000000）。

將基因庫中的8株ST37 型菌與本研究收集的8株菌做致病性決定區(qū)（pathogenicity locus， PaLoc）比較，發(fā)現(xiàn)這些菌株的PaLoc完全相同，說明ST37型艱難梭菌的致病性決定基因相對(duì)保守。圖2為這16株菌的SNP進(jìn)化樹分析。從圖中可見WCHCD109、WCHCD159、WCHCD1216、WCHCD1577和WCHCD1641與基因庫中2006年愛爾蘭分離的M68親緣關(guān)系最近，而WCHCD770、WCHCD1262和WCHCD1450與基因庫中加拿大分離VL-0005親緣關(guān)系最近。這也揭示了菌株的可能來源。

2.5 體外藥敏結(jié)果

應(yīng)用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)8株ST37型艱難梭菌的MIC值的分布范圍，萬古霉素（≤0.03～0.25 ?g/mL），克林霉素（8～>512 ?g/mL），利福平（≤0.03～>512 ?g/mL），莫西沙星（≤0.03～16 ?g/mL），甲硝唑（≤0.03 ?g/mL），四環(huán)素（≤0.03～32 ?g/mL） （表4）。

2.6 耐藥基因分析結(jié)果

將本研究8株菌的全基因組序列在（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）中分析其耐藥基因（表5），8株艱難梭菌對(duì)克林霉素均耐藥，有5株存在ermB耐藥基因，但WCHCD109和WCHCD1577沒有ermB耐藥基因。5株艱難梭菌對(duì)四環(huán)素耐藥，均存在tet耐藥基因。4株艱難梭菌對(duì)利福平耐藥，均存在rpoB耐藥基因。4株艱難梭菌對(duì)莫西沙星耐藥，存在gryA或gryB耐藥基因。

3 討論

CDI是目前公認(rèn)的最重要的院內(nèi)感染之一，近年來，其發(fā)病率病死率在全球呈上升趨勢(shì)。艱難梭菌致病主要是由2個(gè)毒素基因tcdA和tcdB。歐美國(guó)家流行的艱難梭菌以tcdA+B+型菌株為主，亞洲以tcdA-B+型菌株為主。而ST37型為亞洲tcdA-B+型菌株主要的流行特征。本研究顯示，tcdA-B+基因型的全部菌株為ST37型，這與既往ST37型在中國(guó)的分子流行病學(xué)報(bào)道一致[9-10]。藥敏試驗(yàn)顯示未發(fā)現(xiàn)萬古霉素和甲硝唑耐藥菌株，這與既往報(bào)道一致，提示CDAD治療的一線用藥仍是萬古霉素和甲硝唑，但需要注意是目前艱難梭菌對(duì)這兩種抗菌藥物的敏感性呈逐年降低的趨勢(shì)[11-12]。所有菌株均對(duì)克林霉素耐藥，克林霉素耐藥機(jī)制主要是由編碼23SrRNA甲基化酶的erm基因所介導(dǎo)。但有2株（25%）未攜帶ermB基因，說明尚存在其他的耐藥機(jī)制，是否存在外排泵、藥物修飾酶、核糖體蛋白L4或L22的突變等，尚需要進(jìn)一步研究。

分子分型是監(jiān)測(cè)CDI感染暴發(fā)及病原溯源的一種非常重要的方法。目前艱難梭菌常用的分型方法包括脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis， PFGE）、PCR-核糖體分型、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing， MLST）和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)可重復(fù)序列分析（multiple-locus variable-number tandem- repeat analysis， MLVA）等[13]。但這些傳統(tǒng)方法均存在一定局限性，如分辨力、重復(fù)性、可操作性和實(shí)驗(yàn)室間可比性等[13]。近年來，逐漸興起的全基因組測(cè)序（whole genome sequenching， WGS）可準(zhǔn)確研究細(xì)菌進(jìn)化、流行途徑和菌群分布情況，后續(xù)的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）分析可區(qū)別菌株間單個(gè)核苷酸差異，因此具有更高的分辨力，有助于判別流行菌株是否來源于同一克隆[13]。就艱難梭菌而言，大量的研究表明，平均每個(gè)位點(diǎn)每年的突變率是1.47×10?7～5.33×10?7，相當(dāng)于每個(gè)基因組每年的SNP大約為1～2[14-17]。因此，界定SNP值為0～2為近期克隆傳播事件，SNP值大于10具有遺傳差異的[14，18-19]。

本研究對(duì)8株同屬ST37型tcdA-B+艱難梭菌進(jìn)一步研究，探討其是否存在院內(nèi)傳播，為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)和預(yù)防醫(yī)院感染爆發(fā)非常重要。研究通過WGS和SNP發(fā)現(xiàn)以最早分離的菌株WCHCD770作為參照，其他7株與之比較的SNP最小為38，可以認(rèn)為它們與WCHCD770這株菌并非直接近期傳播。結(jié)果表明相同ST型艱難梭菌感染，可能相互之間并沒有進(jìn)化關(guān)系，排除傳播可能。而將這8株菌兩兩之間做SNP分析，發(fā)現(xiàn)WCHCD1577與WCHCD1641之間的SNP為10，雖然處于界定標(biāo)準(zhǔn)的邊緣，結(jié)合相應(yīng)臨床資料，WCHCD1577分離菌患者出ICU的時(shí)間與WCHCD1641分離菌患者入ICU的時(shí)間僅相隔4 d，他們的住院床號(hào)相鄰。而在院內(nèi)感染的環(huán)節(jié)中，患者雖是傳染源，但醫(yī)務(wù)工作者處于這個(gè)醫(yī)療環(huán)境中，他們?cè)诮佑|患者時(shí)可通過手或醫(yī)療器械將芽孢定植而進(jìn)行傳播，易于成為潛在的傳播者。通過采集醫(yī)務(wù)人員的手部標(biāo)本進(jìn)行增菌培養(yǎng)，可推斷該菌株在院內(nèi)的傳播是否是醫(yī)務(wù)人員的手為媒介。推測(cè)這兩株菌可能來源于同一克隆，患者所處的環(huán)境可能為其傳播途徑。因此，嚴(yán)格正確的手衛(wèi)生、消毒和及時(shí)更換病房用品或醫(yī)療器械，有助于減少艱難梭菌的院內(nèi)傳播。將這8株菌的基因序列與基因庫（Genbank）中已知的ST37型艱難梭菌基因組數(shù)據(jù)的SNP分析發(fā)現(xiàn)，WCHCD109、WCHCD159、WCHCD1216、WCHCD1577、WCHCD1641與愛爾蘭克隆流行菌株M68非常接近，WCHCD770、WCHCD1262和WCHCD1450與加拿大菌株VL-0005也非常接近，推測(cè)它們之間可能存在遠(yuǎn)期傳播事件。需要進(jìn)一步了解這些患者的活動(dòng)軌跡，以獲取菌株來源更為準(zhǔn)確的依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生健康科研課題（No. 19PJ223）

作者簡(jiǎn)介：陳熔，女，生于1981年，博士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉呐R床診療，E-mail： 38824605@qq.com