計小凡 歐陽輝 馮育林 饒毅 羅曉健

摘要：目的 建立多中心切割（MHC）二維高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（2D-HPLC-QTOF）法分離和推斷表柔比星脂質(zhì)體制劑中未知雜質(zhì)的方法。方法 一維液相色譜采用Symmetry-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈和甲醇（6：1）為流動相A，以加入十二烷基硫酸鈉的磷酸緩沖液為流動相B，流動相A與流動相B體積比為57：43進行等度洗脫；二維高效液相色譜采用Agilent Eclipse-C18 （50 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以0.1%的甲酸水和乙腈為流動相，采用梯度洗脫。將一維液相色譜條件下分離的雜質(zhì)峰進行多中心切割儲存在定量環(huán)中，并轉(zhuǎn)移至二維進行分離，以四極桿飛行時間質(zhì)譜（QTOF）進行結(jié)構(gòu)推斷。結(jié)果 該方法可以使表柔比星與雜質(zhì)峰較好地分離，并且可以得到高質(zhì)量雜質(zhì)峰進行結(jié)構(gòu)推斷。在表柔比星脂質(zhì)體制劑中對6個未知雜質(zhì)進行有效的推斷。結(jié)論 建立的多中心切割二維高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法可高效準(zhǔn)確的分離并推斷表柔比星脂質(zhì)體制劑中的未知雜質(zhì)，特別是微量和難以分離的雜質(zhì)，對表柔比星制劑的質(zhì)量控制提供了新方法。

關(guān)鍵詞：2D-HPLC-QTOF；多中心切割；表柔比星脂質(zhì)體；未知雜質(zhì)

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract? ? Objective To establish a method called multiple heart-cutting 2D-HPLC-QTOF to separate and identify the unknown impurities in epirubicin liposome. Methods One-dimension （1D） chromatographic condition was Symmetry-C18 column using acetonitrile and methanol （6：1） as mobile phase A and phosphate buffer solution with sodium lauryl sulfate as mobile phase B. The volume ratio of mobile phase A to mobile phase B was 57：43. Two-dimension （2D） chromatographic condition was Agilent Eclipse-C18 column using 0.1% formic acid solution as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B （gradient elution）. Multiple impurity peaks separated by 1D liquid chromatography were cut by multi hearting-cutting and stored in quantitative loops， and then transferred to 2D for separation. The structures were identified by quadrupole time-of-flight mass spectrometry （QTOF）. Results Using this method， good separation of epirubicin from impurity peaks was achieved， and high-quality impurity peaks were obtained for structural identification. Six unknown impurities were effectively identified in the epirubicin liposome. Conclusion The established method can efficiently and accurately separate and identify unknown impurities in the epirubicin liposome， especially the trace and hard-to-separate impurities， and provides a new method for quality control of the Epirubicin preparation.

Key words? ? 2D-HPLC-QTOF; Multiple heart-cutting; Epirubicin liposome; Unknown impurities

表柔比星（epirubicin，EPI，又稱表阿霉素）是一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤抗生素[1]，臨床常用其鹽酸鹽治療乳腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌等[2-4]。研究表明其療效與阿霉素相同或略高，但心臟毒性低于阿霉素[5]。近年來許多表柔比星及其鹽酸鹽的產(chǎn)品逐步上市，雖然注射劑療效確切但長期使用仍會出現(xiàn)骨髓抑制和心臟毒性等副作用。脂質(zhì)體作為新型藥物載體在提高藥物靶向性、降低毒副作用、延長治療時間方面非常突出[6]。

目前，各國藥典收載的鹽酸表柔比星和注射用鹽酸表柔比星有關(guān)物質(zhì)檢測主要采用HPLC法[7-9]，圖1列出了包括阿霉素在內(nèi)的相關(guān)雜質(zhì)共7種。檢測方法中因流動相含有磷酸和十二烷基硫酸鈉緩沖鹽，會對質(zhì)譜檢測系統(tǒng)產(chǎn)生污染和離子抑制效應(yīng)，無法與質(zhì)譜直接聯(lián)用對表柔比星原料藥及其制劑的已知或未知雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定。邵武軍等[10]采用在線二維液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法對注射用鹽酸表柔比星長期穩(wěn)定性留樣的未知峰進行定性分析，結(jié)果表示該未知雜質(zhì)為鹽酸表柔比星二聚體，檢測方法簡便有效。

本試驗采用多中心切割（MHC）模式的2D-HPLC-QTOF聯(lián)用技術(shù)分離和推斷表柔比星脂質(zhì)體制劑中的未知雜質(zhì)。該方法可以實現(xiàn)對一維液相條件下分離的多個雜質(zhì)峰進行中心切割，然后將這些中心切割儲存在定量環(huán)中，并將儲存的中心切割依次轉(zhuǎn)移到具有不同選擇性的二維進行分離，在實現(xiàn)共流出物得到有效分離的同時可以實現(xiàn)每個一維雜質(zhì)峰都進行中心切割，避免雜質(zhì)峰數(shù)據(jù)丟失。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1290 型二維高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 6530 型飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；MILLI-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試劑

表柔比星（批號8514AOC00320）購自廣州安信醫(yī)藥有限公司；表柔比星脂質(zhì)體（批號20170918）由江西本草天工科技有限公司提供；優(yōu)級純十二烷基硫酸鈉購自美國Sigma公司；分析純磷酸購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜級甲醇和乙腈購自美國Thermo Fisher Scientific公司；色譜級甲酸購自美國Sigma公司；超純水由MILLI-Q純水儀制備。

2 實驗方法

2.1 一維液相色譜條件

色譜柱：Symmetry-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；檢測波長：254 nm；流動相：A為乙腈：甲醇（6：1），B為緩沖液（稱取2.88 g十二烷基硫酸鈉，加磷酸1.36 mL，用水溶解并稀釋至1000 mL）；等度洗脫A： B= 57： 43。

2.2 二維液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse-C18 （50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；Loop環(huán)積：40 μL；檢測波長：254 nm；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈；洗脫程序為B相在8 min內(nèi)由10%上升為90%。

2.3 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧正離子化（ESI+）；干燥氣溫度：325℃；霧化氣壓力：35 pai；干燥氣流速：8 L/min；毛細(xì)管電壓：3500 V；采集速率：2 Spectrum/Sec；質(zhì)量范圍：50～1500 m/z。

2.4 樣品溶液的制備

取表柔比星原料藥適量，用甲醇溶解，搖勻，過濾，取濾液，制成濃度為20.52 μg/mL的表柔比星原料藥溶液，并用一維液相色譜條件進行分析。取表柔比星脂質(zhì)體溶液用甲醇稀釋125倍，過濾，取濾液?？瞻字|(zhì)體用同樣的方法稀釋。取表柔比星脂質(zhì)體樣品溶液在一維液相色譜條件下進行分析，通過一維液相色譜圖中目標(biāo)雜質(zhì)峰的保留時間設(shè)置多中心切割程序的切割時間，將目標(biāo)雜質(zhì)轉(zhuǎn)移至二維液相色譜條件下分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 一維液相色譜分析結(jié)果

3.1.1 原料藥與空白脂質(zhì)體

在加入緩沖鹽的液相色譜條件下，表柔比星原料藥的一維液相色譜圖如圖2A，主峰保留時間在27.548 min，并且能與其他雜質(zhì)峰很好的分離，表明一維液相色譜條件的合理性。在相同的一維液相色譜條件下，分析空白脂質(zhì)體的一維液相色譜行為。如圖2B所示，空白脂質(zhì)體在7～8 min有干擾峰出現(xiàn)，可能會對此時間段出峰的雜質(zhì)的鑒定有所干擾。同時圖中顯示空白脂質(zhì)體在其他保留時間的區(qū)域無明顯干擾。

3.1.2 表柔比星脂質(zhì)體

一維液相色譜分析結(jié)果可以確定目標(biāo)雜質(zhì)峰的保留時間，用于多中心切割模式的切割時間設(shè)置。表柔比星脂質(zhì)體一維色譜圖如圖3，表柔比星主峰保留時間為33.3 min，編號為9。雜質(zhì)峰分布及保留時間與原料藥中的基本一致，推測表柔比星脂質(zhì)體制劑中的主要雜質(zhì)來源于其原料藥，將各目標(biāo)雜質(zhì)峰標(biāo)號為1～8和10～16。將主峰與各雜質(zhì)峰引入二維體系進行分析的中心切割時間表如表1所示，共采集16個峰切入二維，每個峰采樣時間為0.04 min。

3.2 二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

在一維液相色譜條件下，表柔比星的主峰與雜質(zhì)可以實現(xiàn)基本的分離，將主峰和各目標(biāo)雜質(zhì)峰切換到液相色譜條件可以直接與MS連接進行鑒定的二維中進一步分離，可以實現(xiàn)共流出物高效分離的同時進行質(zhì)譜鑒定分析。

3.2.1 表柔比星主峰9的定性分析

將主峰9采集至二維液相色譜中進行分析（圖4A），保留時間為4.9 min，分子離子峰m/z為544.1808，通過MFG分子式計算功能綜合考慮精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、價態(tài)、加鹽峰、碎片信息，在限定元素組成和得分的條件下，得出分子式為C27H29NO11，質(zhì)量偏差-1.3 ppm（0.6 mDa），得分95.67，同時對比同位素峰測量與理論豐度，可以確定編號為9的峰是表柔比星主峰（圖4B）。

3.2.2 雜質(zhì)7的定性分析

雜質(zhì)7在一維液相色譜中的保留時間為31 min，切割到二維的保留時間為4.31 min（圖5）。通過EIC確認(rèn)質(zhì)譜對應(yīng)離子為m/z 544.1829和m/z 397.0923（推 測為源內(nèi)裂解），且與空白脂質(zhì)體相比為表柔比星脂質(zhì)體樣品特有（圖6）。計算雜質(zhì)7的分子式為C27H29NO11，質(zhì)量偏差-2.86 ppm（-1.6 mDa），推測雜質(zhì)7為圖1中的雜質(zhì)C阿霉素（圖7）。

3.2.3 雜質(zhì)8的定性分析

雜質(zhì)8在一維液相的保留時間為32.34 min，切閥后在4.34 min有254 nm的紫外吸收峰（圖8），EIC確認(rèn)質(zhì)譜對應(yīng)離子為m/z 530.1663和m/z 383.0772（推測為源內(nèi)裂解）（圖9）。與空白脂質(zhì)體樣品比較，為表柔比星脂質(zhì)體樣品特有峰。通過精確質(zhì)量計算分子式為C26H27NO11，比主成分少-CH2，質(zhì)量偏差1.48 ppm （-0.6 mDa），得分97.59。通過源內(nèi)裂解脫去一分子氨基糖來推測雜質(zhì)8可能是在主成分的基礎(chǔ)上丟失-CH2形成的，可能的結(jié)構(gòu)如圖所示（圖10）。

3.2.4 雜質(zhì)10的定性分析

雜質(zhì)10在一維液相的保留時間為38.26 min，在切閥后5.88 min有254 nm的紫外吸收峰（圖11），EIC對應(yīng)離子為m/z 337.0700，與空白脂質(zhì)體相比確認(rèn)為表柔比星脂質(zhì)體樣品特有峰（圖12）。精確質(zhì)量計算雜質(zhì)分子式為C19H12O6，質(zhì)量偏差2 ppm（0.7 mDa），可能的結(jié)構(gòu)如圖所示（圖13）。

3.2.5 雜質(zhì)13的定性分析

雜質(zhì)13在一維液相的保留時間為45.42 min，切閥后在二維色譜圖上對應(yīng)4.40 min的吸收峰（圖14），EIC確認(rèn)質(zhì)譜對應(yīng)離子為m/z 542.1650。與空白脂質(zhì)體樣品比較，為表柔比星脂質(zhì)體樣品特有峰。通過精確質(zhì)量計算分子式為C27H27NO11，比主成分少2個H，質(zhì)量偏差-1.39 ppm，可能的結(jié)構(gòu)如圖所示（圖15）。

3.2.6 雜質(zhì)14的鑒定

雜質(zhì)14在一維液相色譜中的保留時間為55.65 min，切閥后4.78 min有紫外吸收峰（圖16），質(zhì)譜對應(yīng)離子為m/z 1083.3228（圖17），與空白脂質(zhì)體相比，確認(rèn)為表柔比星脂質(zhì)體樣品特有峰。通過精確質(zhì)量計算雜質(zhì)分子式為C54H54N2O22，質(zhì)量偏差0.17 ppm，與雜質(zhì)G相比少4H，可能的結(jié)構(gòu)如圖所示（圖18）。

3.2.7 雜質(zhì)15的鑒定

雜質(zhì)15在一維液相色譜中的保留時間為61.01 min，在切閥后6.06 min有254 nm的紫外吸收峰（圖19），質(zhì)譜對應(yīng)離子m/z 1047.3030及二價信號m/z 524.1539，EIC確認(rèn)化合物為樣品特有峰（圖20）。精確質(zhì)量計算雜質(zhì)分子式為C54H50N2O20，質(zhì)量偏差0.83 ppm，與雜質(zhì)G相比少H8O2，可能的結(jié)構(gòu)如圖（圖21）。

3.2.8 其他雜質(zhì)的分析

樣品中雜質(zhì)1～3在一維液相中的保留時間分別為7.35、7.61和8.29 min。在二維液相色譜圖中均可提取到C21H18O9（雜質(zhì)A）的[M+H]+，但因為含量太低，質(zhì)譜干擾嚴(yán)重，無法進一步確認(rèn)。推測可能由于空白脂質(zhì)體的液相色譜行為在這段時間的干擾較強，導(dǎo)致無法分析。

雜質(zhì)4和雜質(zhì)12的一維液相保留時間分別為13.19 和41.83 min，由于一維液相色譜峰太低無法進行進一步分析。雜質(zhì)5、11和16，一維液相保留時間分別為24.69、39.51和75.67 min，在切割到二維液相色譜中后因背景太高無法確認(rèn)。

雜質(zhì)6通過精確質(zhì)量計算的分子式為C27H29NO11，質(zhì)量偏差-2.89 ppm，推測是雜質(zhì)7的異構(gòu)體，但因為含量很低難以進一步確認(rèn)。

4 結(jié)論

本文采用多中心切割模式的2D-HPLC-QTOF法分離表柔比星脂質(zhì)體中的雜質(zhì)，使用MFG分子式計算功能對未知雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)推測。本文分離出的雜質(zhì)7和雜質(zhì)10為常見同分異構(gòu)體雜質(zhì)和碎片雜質(zhì)，雜質(zhì)8和雜質(zhì)13與主成分相比分別丟失-CH2和2H，雜質(zhì)14和15是在表柔比星二聚體的基礎(chǔ)上丟失4H和H8O2，推斷部分雜質(zhì)可能來源于原料藥。由于各雜質(zhì)峰的二級質(zhì)譜信號較低未能準(zhǔn)確獲得因此無法確定各雜質(zhì)峰手性中心的絕對構(gòu)型，未來可針對各雜質(zhì)進行立體結(jié)構(gòu)的分析。本文所采用的多中心切割模式與普通中心切割模式相比，可以對每個一維目標(biāo)峰進行中心切割，并且較高頻率的采樣可以對高度復(fù)雜的共流出物峰進行詳細(xì)分析。將二維液相色譜分離技術(shù)與QTOF質(zhì)譜聯(lián)用，是分離鑒定未知雜質(zhì)的有力手段。通過此方法共檢測出表柔比星脂質(zhì)體溶液中6個雜質(zhì)成分并推測出其平面結(jié)構(gòu)，為表柔比星脂質(zhì)體中雜質(zhì)的分離鑒定提供了重要參考。

參 考 文 獻(xiàn)

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作者簡介：計小凡，女，生于1998年，在讀碩士研究生，主要從事藥物分析和中藥藥效物質(zhì)及其代謝研究，E-mail： 2804799585@qq.com