周紅 覃容欣

摘要：抗菌增敏藥是一類本身并不具有抗菌作用的藥物，但是其與抗菌藥物聯(lián)合應用后可增加抗菌藥物的抗菌活性?？咕雒羲幨强咕幬镅芯款I域的新的研究方向，它的非臨床研究的藥效學內容同樣包括體內和體外兩個方面。在體外研究中，評價指標除包括與其他單一抗菌藥物評價相同的指標如MIC、MBC、KCs、PAE和ED50，還需要做聯(lián)合用藥后聯(lián)合抑菌指數(shù)（FICI）和聯(lián)合時間-殺菌曲線的研究。在體內研究中，評價指標同單一抗菌藥物評價指標，但是需要特別注意聯(lián)合用藥藥物的配伍劑量的選擇。本技術指南對抗菌增敏藥非臨床研究藥效學的內容及方法進行論述，旨在為抗菌增敏藥的臨床前藥效學研究提供參考。

關鍵詞：抗菌藥物增敏藥；藥效學；技術指南；抗菌活性；聯(lián)合抑菌指數(shù)

中圖分類號：R9文獻標志碼：A

Abstract? ? Antimicrobial sensitizers refer to the drugs that do not have antibacterial effect by themselves， but can increase the antibacterial activity of the antibacterial drugs after combined application. The investigation of antimicrobial sensitizers is a new research direction in the field of antibacterial drugs， and its pharmacodynamics of non-clinical research content also includes in vivo and in vitro experiments. In addition to the evaluation indexes including MIC， MBC， KCs， PAE， and ED50， which are the same as those of other single antibacterial drugs， in vitro studies on fractional inhibitory concentration index （FICI） and combined time-killing curve after combination therapy are also required. As for in vivo studies， the evaluation criteria are the same as those for single antimicrobial drugs， but special attention needs to be paid to the selection of compatible doses for drugs combinations. The technical guidelines discuss the contents and methods of pharmacodynamics of non-clinical research study of antimicrobial sensitizers， aiming to provide a reference for preclinical pharmacodynamics study of antimicrobial sensitizers.

Key words Antibacterial sensitizer; Pharmacodynamics; Technical guidelines; Antibacterial activity; Fractional inhibitory concentration index

1 概述

1.1 抗菌藥物增敏藥的定義

目前，抗菌策略包括直接抗菌和間接抗菌策略兩種。直接抗菌策略指的是可以直接抑制細菌生長甚至殺滅細菌的藥物，如臨床上常用的抗菌藥物。間接抗菌策略指的是并非直接抑制細菌生長或者殺滅細菌的藥物，該類藥物需要和其他藥物聯(lián)合使用。

基于間接抗菌策略的藥物組合主要有兩類，包括：①不具有抗菌作用的藥物與抗菌藥物的聯(lián)合應用；②均不具有抗菌作用的兩個藥物的聯(lián)合應用。在前者中，不具有抗菌作用的藥物被稱為抗菌增敏藥（antibacterial sensitizer）[1-3]。其作用機制包括以下兩種：①該類藥物本身沒有或具有較低的抗菌活性，但是與抗菌藥物聯(lián)合使用后，可以通過改變細菌表型或抑制細菌的耐藥機制從而提高或恢復聯(lián)合使用的抗菌藥物的抗菌活性。該類藥物針對的靶標分子是細菌耐藥機制或者細菌生長過程中所必需的重要分子。目前在臨床上廣泛使用的β-內酰胺酶抑制劑（如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿維巴坦）屬于抗菌增敏藥之列，該類藥物可以以共價鍵與β-內酰胺酶結合，使得該酶破壞β-內酰胺類抗生素的作用消失，從而使聯(lián)合使用的抗生素能夠繼續(xù)發(fā)揮抗菌作用；②本身也不具有抗菌作用，但是可以提高宿主清除細菌的能力；與抗菌藥物聯(lián)合使用后可以提高抗菌藥物的抗菌作用，因此也稱為抗菌佐劑（antibacterial adjuvant） [1-3]，與目前使用的免疫調節(jié)藥的內涵相似。

1.2 藥效學非臨床研究

本文中介紹的是抗菌增敏藥，有關抗菌增敏藥的藥效學非臨床研究內容包括體外活性評價和體內活性評價兩方面。

1.3 目的和應用范圍

鑒于目前國內外尚無有關抗菌增敏藥的藥效學非臨床研究相關技術指南，因此特撰寫此文，旨在為抗菌增敏藥的新藥研究與評價提供參考。本技術指南適用于和抗菌藥物聯(lián)合使用的、針對細菌感染的抗菌增敏藥的研究，針對的是細菌而非宿主，也不包括針對結核桿菌、真菌的研究，關于β-內酰胺酶抑制劑合劑的藥效學非臨床研究技術指南在本技術指南系列文章中有專門的文章介紹，因此本文中不再介紹。

2 主要研究內容

2.1 體外藥效學研究

在體外研究中，不同化學結構或不同作用機制的抗菌增敏藥都采用規(guī)范而統(tǒng)一的指標進行評價。評價指標除包括MIC、MBC、KCs、PAE、ED50和細菌生長曲線，與單一抗菌藥物的評價指標相同；此外，還需要進行專門用于聯(lián)合用藥的評價指標如聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）和聯(lián)合時間-殺菌曲線的研究。有關MIC、MBC、KCs、PAE和ED50的測定在本技術指南系列文章中單一藥物的抗菌藥物藥效學非臨床研究技術指南中已經具體敘述[4]，因此本文重點闡述FICI和聯(lián)合時間-殺菌曲線的研究。

2.1.1 FICI的測定

在測定單獨的抗菌藥物、抗菌增敏藥的MIC的基礎上，進行兩者聯(lián)合之后FICI的測定[5]。受試菌的選擇與要求同單獨的抗菌藥物一樣[4]。

聯(lián)合抑菌指數(shù)反映的是兩種藥物聯(lián)合使用后的藥效學情況。其計算公式為：

評價方案為：當FICI≤0.5時，表明兩種藥物具有協(xié)同效應（synergy）；當0.5

體外協(xié)同作用的測定方法及評判標準化合物之間協(xié)同作用的評價方法較多，但是棋盤法、時間-殺菌曲線是其中使用最廣泛的兩種方法，其中棋盤法的操作更為簡便、準確。結果描述中需包括抗菌增敏藥和抗菌藥物對各種受試細菌的MIC和FICI，可參照表1格式。

與其他抗菌藥物一樣，抗菌增敏藥也要進行MIC測定。需要注意的是，對于難以溶于水的藥物其初始最高濃度可選擇其在最大溶解條件下的濃度，然后再依次對比稀釋。

（1）棋盤法

棋盤法可測定藥物聯(lián)用對細菌生長的MIC。操作如下：先在96孔板中加入待測細菌，起始濃度為1.0×105 CFU/mL[6]，然后加入抗菌藥物和抗菌增敏藥。以各藥物單用時的MIC為基礎，將抗菌藥物沿96孔平板的X軸倍比稀釋，與之聯(lián)合的抗菌增敏藥在平板的Y軸也進行倍比稀釋（反之亦可）。這一方法是將兩藥MIC的倍比稀釋濃度在同一平板上進行交叉配合，包含了兩藥的多種濃度組合。如果是3個及3個藥物以上聯(lián)合，則是將抗菌藥物沿96孔板一個方向倍比稀釋，另外兩個藥物（抗菌增敏藥）沿孔板另一個方向倍比稀釋。

在實驗過程中，需要同時設立抗菌藥物和抗菌增敏藥單獨組、陽性對照組（只加細菌不加藥物的生長對照組）、陰性對照組（只加培養(yǎng)基對照組）。經過18～24 h的培養(yǎng)后進行結果判讀，陰性孔顯示清亮，用（-）表示；陽性孔顯示混濁，用（+）表示。MIC為抑制細菌肉眼可見生長的最低藥物濃度。

（2）Epsilometer測定法（E-test）

E-test是體外測定抗菌藥物抗菌活性的另外一種方法。該方法是利用一條經核準的塑料長條，將其浸入不同濃度的抗菌藥物溶液中，再置于接種有待測菌的瓊脂盤培養(yǎng)基中，由抑菌圈與刻度的交點處來判斷MIC。這一方法被應用于許多抗菌藥物的敏感性測定試驗中，如果實驗條件穩(wěn)定，E-test法與其他藥敏實驗方法（如微孔二倍稀釋法）在單藥藥敏試驗中相關性良好。E-test法易于操作，其不足之處在于：①在不同培養(yǎng)基上，細菌的生長情況可能不一致；②拖尾現(xiàn)象使MIC測定結果不明。

2.1.2 時間-殺菌曲線的測定

時間-殺菌曲線（time-killing curve）是指固定抗菌藥物的一系列濃度觀察其在不同的時相點對受試菌的殺菌速率和殺菌活性[7-8]，在抗菌增敏藥的藥效學非臨床研究中同樣適用。受試菌一般應覆蓋目標適應證的主要病原菌種。每種細菌最好包含質控菌株、敏感株、耐藥株。

時間-殺菌曲線的測定方法同單一藥物的測定[4]。將受試菌接種于培養(yǎng)基中，接種量為1.0×106 CFU/mL。需要注意的是，除設置適當?shù)乃幬餄舛冉M別（1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC）外，還應增加相應的藥物濃度和抗菌增敏藥配伍組，具體藥物濃度需要參考FICI的結果設置。在培養(yǎng)過程中定時取樣，通常在2、4、6、8、12和24 h取樣，恰當比例稀釋后均勻涂布于瓊脂糖平板上進行活菌落數(shù)或通過測定菌液的光密度（optical density，OD）值繪制時間-殺菌曲線，以評價藥物的活性。

2.2 抗菌增敏作用機制

應盡可能明確藥物的作用機制，以支持其聯(lián)合應用的可行性。有關其作用機制的研究思路一般首先考慮細菌對聯(lián)合應用的抗菌藥物的耐藥機制[9]，即從抗菌增敏藥對細菌耐藥機制的影響著手；同時，也要考慮細菌耐藥機制外的機制，其研究思路同本技術指南系列文章中單一藥物的抗菌藥物藥效學非臨床研究[4]。

2.3 耐藥性及其機制

應在體外模型中評估臨床分離菌株對聯(lián)合用藥配伍可能產生耐藥性的可能性及其機制，為將來臨床應用奠定基礎，其研究思路同本技術指南系列文章中單一藥物的抗菌藥物藥效學非臨床研究[4]。

2.4 體內藥效學研究

抗菌增敏藥的體內藥效學研究與評價單一抗菌藥物的實驗方法一樣，根據(jù)其適應癥選擇全身或局部感染模型[10]。本技術指南主要介紹藥物在全身細菌性感染模型中的研究方法。

目前誘發(fā)全身感染動物模型一般采用注射途徑感染，如腹腔注射細菌、靜脈注射細菌誘導的感染模型。但也有不經注射途徑，通過制造組織或器官的損傷誘導內源性細菌感染導致的全身感染動物模型如盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture， CLP）膿毒癥模型。CLP模型被認為是目前最接近臨床的膿毒癥“金標準”動物模型[11]。

2.4.1 動物

選擇有合格證號動物房提供的外觀健康的BALB/c或昆明種小鼠，體重18～22 g，每個劑量組動物至少10只，雌雄各半。小鼠一般在動物試驗房適應性飼養(yǎng)2～3 d后再使用。必要時可選用大鼠、豚鼠等其它動物。

2.4.2 細菌

感染細菌原則上應選用臨床上的耐藥菌株，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐藥大腸埃希菌等。

2.4.3 藥物

（1）藥物及其配制：抗菌增敏藥的配制與抗菌藥物相同，稱取適量。可溶性藥物用滅菌水或培養(yǎng)基配制成相應濃度的溶液，不建議與抗菌藥物混合配制。水溶性較差的藥物需根據(jù)藥物理化性質，先溶于溶劑（如DMSO等）中，再加水至所需濃度，但有機溶劑濃度一般不超過1%～5%，同時設溶劑對照組，注意有些藥物在DMSO里溶解度很好，但加水或培養(yǎng)基后藥物析出。有些難溶性藥物需將其顆粒磨細，加入少量吐溫80、3%～5%阿拉伯膠、2%～4%淀粉或0.5%～1%羧甲基纖維素（CMC）研磨成均勻混懸液，但只能用于口服給藥，不能用于注射給藥。注射給藥的藥液配制過程中要注意無菌操作，配制好的藥液可以分裝放-80℃存放，避免反復凍融。

（2）藥物劑量選擇：抗菌增敏藥的劑量可參照藥物的體外MIC結果并經預試驗確定。預試驗中，在確定了抗菌藥物劑量后（值得注意的是單獨抗菌藥物的治療效果不能太好，以免觀察不出抗菌增敏藥的效應。一般來說，單獨使用抗菌藥物的治療率在30%左右即可），將抗菌增敏藥設為高、中和低3個劑量組，每組3～5只小鼠，組間劑量差距可先相差10倍，觀察藥物組合對小鼠的保護率。當確定了有效范圍之后，可以縮小組間劑量差距的倍數(shù)，直至找到有效的藥物劑量，要求高劑量組保護80%～100%感染動物，低劑量組80%～100%感染動物死亡。

（3）給藥途徑：原則上藥物給藥途徑應與擬推薦的臨床給藥途徑一致，根據(jù)推薦的藥物臨床給藥途徑不同，可分為灌胃給藥（po）、靜脈注射（iv）和皮下注射（sc）。灌胃給藥、靜脈注射和皮下注射最大給藥體積分別為0.1～0.3 mL/10 g、0.1 mL～0.2 mL/10 g和0.1～0.3 mL/10 g。腹腔感染動物模型不宜再進行腹腔注射給藥治療。靜脈注射給藥一般可用皮下注射給藥代替。給藥次數(shù)和間隔應與抗菌藥物一致。

（4）體內保護試驗

將18～22 g小鼠按體重隨機分組，給藥組[抗菌藥物（固定劑量）聯(lián)用抗菌增敏藥（3個劑量組）]，另設感染對照組（空白對照藥組）、單獨抗菌藥物組、單獨抗菌增敏藥組（最高劑量），每組至少10只。在給予菌液感染成功后4 h，按照由低至高的劑量順序，分別口服、靜脈或皮下給藥，抗菌增敏藥與抗菌藥物同時給藥[12]。

給藥后觀察動物的活動和反應情況，必要時檢查體溫、血藥、心率和體重，觀察局部反應及其他相關指標如血小板計數(shù)等，記錄動物死亡時間和數(shù)量。觀察時間根據(jù)接種細菌的毒力和接種量而定，一般觀察7～14 d。發(fā)現(xiàn)動物在觀察期內死亡，應立即進行解剖；如在預定觀察時間內動物沒有死亡，存活動物也應處死并進行解剖觀察。

體內藥效學結果的判斷指標較多，其中生存時間、生存率或死亡率最為重要；同時可進行血培養(yǎng)和臟器細菌計數(shù)、病理組織檢查評等。通常觀察感染7 d內動物死亡數(shù)，用Bliss法計算半數(shù)有效劑量（ED50）及其95%可信限，進行統(tǒng)計學處理，并與對照藥進行比較。資料整理可參照表2～3。

3 小結與展望

抗菌增敏藥是目前抗菌藥物研究的新領域，對提高現(xiàn)有抗菌藥物的抗菌活性、延遲其使用周期具有重要意義。

有關抗菌增敏藥藥效學非臨床研究技術指南考察的指標與單獨的抗菌藥物藥效學非臨床研究技術指南相似，但是其特點是在研究過程中一定要選擇合適的配伍抗菌藥物。在體外研究中一定要進行聯(lián)合抑菌指數(shù)和聯(lián)合時間-殺菌曲線的研究，在體內實驗中抗菌增敏藥和抗菌藥物要選擇合適的配伍劑量以體現(xiàn)抗菌增敏藥的抗菌增敏作用。此外，隨著具有新作用機制的抗菌增敏藥的發(fā)現(xiàn)，為了更全面評價其作用及其分子機制，則需要依據(jù)其作用特點和機制建立新的評價方法以滿足新藥研究的需要。

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基金項目：國家自然科學基金委員會-貴州省人民政府聯(lián)合基金項目（No. U1812403-4-1）

作者簡介：周紅，女，生于1964年，教授，主要研究方向為抗炎與抗感染藥物藥理學，E-mail： zhouh64@163.com