田振，吳文濤，陳錦鴻，婁朝暉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科，河南 鄭州 450000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)患者可出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，喪失獨立性，出現(xiàn)呼吸衰竭甚至死亡。全球每年新增SCI患者約50萬例[1-2]。以往認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)是難以再生的，只有康復(fù)治療能在一定程度上緩解SCI癥狀。近年來，干細(xì)胞因其具有多能性、更新能力及富含營養(yǎng)因子等優(yōu)勢[3]受到人們的關(guān)注。不同類型的干細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于SCI的各項臨床試驗中[4-8]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)作為SCI治療的移植種子細(xì)胞，其分離培養(yǎng)及規(guī)模化擴(kuò)增一直是組織工程面臨的重要課題。在實驗方面，NSC的純度和活性對實驗結(jié)果的影響很大。在臨床治療方面，只有獲得純度較高的NSC，才能對NSC的功能開展更加廣泛的試驗研究。但不論是直接由動物臍血、人骨髓等途徑所誘導(dǎo)獲得的NSC，還是直接由胚胎及成熟動物腦組織中分離的NSC，其純度都較低[9-11]。免疫磁珠法通過磁珠與細(xì)胞表面的物質(zhì)結(jié)合，使靶細(xì)胞或雜質(zhì)細(xì)胞具有磁性，繼而在磁場的作用下對細(xì)胞進(jìn)行篩選，實現(xiàn)純化富集的目的。這一技術(shù)如今已在細(xì)菌與分子生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用，其純化和富集的作用也獲得了免疫熒光、PCR、FISH和FACS等分析方法的證明[12]。本研究通過微小免疫磁珠分離純化得到NSC，并將其移植到SCI的大鼠模型中，對純化效果和實驗結(jié)果進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供10只孕齡為12～18 d的Wistar大鼠胎鼠，用于NSC的獲得；提供30只10周齡的Wister大鼠，體質(zhì)量280～300 g，用于SCI模型的構(gòu)建。每只大鼠被置于溫度和濕度控制的12 h光-暗循環(huán)環(huán)境中清潔級飼養(yǎng)。本研究中的外科手術(shù)和動物試驗操作，均遵守醫(yī)學(xué)院動物試驗倫理委員會的規(guī)定。本研究使用了DMEM/F12、B-27、胎牛血清(ThermoFisher)、堿性成纖維生長因子、表皮生長因子(Peprotech)、小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體、包被羊抗小鼠IgG的賽默飛微小免疫磁珠(直徑≤50 nm)、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、Anti-GFAP、Anti-βⅢ-tubulin、NSC培養(yǎng)基(ThermoFisher)、微量注射器(Smiths Medical)、流式檢測儀(Thermofisher AttuneNxT)、倒置相差顯微鏡(DMIRE2型)和恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermofisher Midi40)。

1.2 獲取、培養(yǎng)原代NSC對10只Wister孕鼠實施吸入異氟烷麻醉后，將其固定在鋪有冰袋的解剖平臺上，從腹部正中切口取出胚胎，在立體顯微鏡下去除結(jié)締組織和微細(xì)血管，使用碎塊機(jī)將取出的腦組織碎成體積約為1 mm3的碎塊，并迅速收集于離心管中，在0 ℃以下的冰袋上使用D-Hanks液清洗 3次，然后將100 μL 0.25%的trypsin-EDTA和DNAase加入離心管中，于常溫下靜置20 min，加入胎牛血清終止消化，使組織穩(wěn)定，用玻璃吸管重復(fù)輕柔敲打20次后，得到單細(xì)胞懸浮液。

1.3 NSC的體外純化將獲取的細(xì)胞懸液在體外進(jìn)一步純化：將獲取的原代細(xì)胞培養(yǎng)液從400目篩網(wǎng)濾過，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106mL-1后，在室溫下靜置30 min，待細(xì)胞濃度穩(wěn)定后進(jìn)行細(xì)胞活力測定。

1.4 NSC的磁化將預(yù)處理過的小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體的濃度調(diào)整為4 μg·mL-1，添加到獲取的單細(xì)胞懸浮液中，使用玻璃吸管攪拌混合均勻，在24 ℃下孵化30 min，用PBS液沖洗懸浮液2次，以去除未結(jié)合的單克隆抗體和單細(xì)胞，羊抗小鼠抗體包被的IgG免疫磁珠經(jīng)PBS沖洗2次得到純化后的磁化磁珠。將純化后磁珠的濃度調(diào)整為20 μg·mL-1，加入小鼠抗大鼠nestin結(jié)合的細(xì)胞懸浮液中，用玻璃吸管輕輕攪拌均勻后，置于24 ℃下遮光靜置1 h使其充分結(jié)合。

1.5 磁化NSC的篩選與富集將磁化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至試管中，將試管固定于電磁場中，靜置30 min后將試管內(nèi)的液體用玻璃吸管緩慢移出，此過程中盡量不觸碰試管管壁，避免吸附在試管壁的細(xì)胞脫落。然后使用PBS溶液沖洗試管壁2遍，將貼附在試管管壁上的細(xì)胞沖洗掉，至此獲得了純化后的NSC懸液。將細(xì)胞懸液置于離心機(jī)中 ，以600 r·min-1的速度離心，將上清液去除后加入NSC培養(yǎng)基，然后在37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)1 h。

1.6 Nestin陽性細(xì)胞分析將磁化和富集過的原代細(xì)胞置于50 mL的燒瓶中，通過細(xì)胞計數(shù)板計算細(xì)胞濃度，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105mL-1，取200 μL細(xì)胞懸液，平均分為10份置入4 ℃的冰箱中靜置10 min，取25 μL已被FITC標(biāo)記成功的IgG(0.1 mg·mL-1)加入每份懸浮液中，繼續(xù)靜置20 min后，使用PBS溶液洗滌2次。再取5 mL 10 g·L-1的多聚甲醛加入20 mL的PBS中，混合均勻后加入細(xì)胞懸液中。選取同類型的無關(guān)抗體取代單一抗(nestin抗體)設(shè)為對照。使用流式細(xì)胞儀分析標(biāo)本。

1.7 誘導(dǎo)NSC分化及其鑒定將傳代培養(yǎng)的NSC解離成單細(xì)胞懸浮液，分為3份，接種于(細(xì)胞濃度為1×106L-1)共聚焦培養(yǎng)皿中，加入10 g·L-1的胎牛血清，在室溫下培育5 d。使用PBS清洗1遍后進(jìn)行MBP、GFAP和βⅢ-微管蛋白免疫熒光染色。將未經(jīng)處理的單克隆抗體稀釋200倍后按同樣的染色方法進(jìn)行培養(yǎng)、染色，在電子焦顯微鏡下觀察對比。

1.8 細(xì)胞活性的鑒定純化前后的所有細(xì)胞均用10 g·L-1的健那綠在30～40 ℃下染色，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)綠色即為陽性，純化前后分別計數(shù)100個細(xì)胞，對其活力進(jìn)行判斷。細(xì)胞活力為健那綠陽性細(xì)胞數(shù)占100個細(xì)胞的百分比。

1.9 實驗分組及方法取30只健康的雌性大鼠隨機(jī)分為實驗組、空白對照組、培養(yǎng)液組。對大鼠實施吸入異氟醚進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，麻醉后沿著背部的腰椎和胸椎表面剃毛，用碘伏清潔皮膚，在以T10為中心的棘突上進(jìn)行中線切口，切口從尾端暴露到腰椎。將椎旁肌肉從脊柱抬高。使用微型器械將T10椎板切除，暴露底層脊髓。SCI操作：使用改良Allen SCI撞擊器，以10 g重的沖擊棒從25 mm的高度自由落體撞擊暴露的脊髓。操作完成后立即縫合上覆肌肉，用創(chuàng)口夾封閉皮膚。在麻醉恢復(fù)期間，大鼠被放置在溫度可控的房間里，直到體溫調(diào)節(jié)重新建立。待麻醉蘇醒后大鼠表現(xiàn)為雙下肢癱瘓則證明SCI模型構(gòu)建成功，術(shù)后人為輔助大鼠排便、排尿。干細(xì)胞移植的時機(jī)對于受損脊髓功能的成功恢復(fù)非常重要。在SCI慢性期，損傷部位會逐步形成膠質(zhì)瘢痕，不利于神經(jīng)元軸突的再生。Okano等[13]報道NSC移植的最佳時機(jī)為SCI后1～2周。所以在大鼠SCI后14 d，對實驗組大鼠腰椎尾側(cè)椎板切開處注射含有5×105個NSC的4 μL培養(yǎng)液至SCI水平；對培養(yǎng)液組通過腰椎尾側(cè)椎板切開處注射4 μL培養(yǎng)液至SCI水平；對空白對照組通過腰椎尾側(cè)椎板切開處注射4 μL生理鹽水至SCI水平。注射裝置為微型操作器配套微量注射泵，在5 min內(nèi)將液體緩慢注入。注射完成后，用2-0絲線縫合手術(shù)切口。

1.10 大鼠行為學(xué)觀察(1)運動能力。通過運動能力評定量表(Basso，Beattie，Bresnahan，BBB)[14-15]評估。術(shù)后10周連續(xù)觀察各組大鼠后肢運動功能，每周1次。大鼠被放在1個長100 cm、寬50 cm、高20 cm的紙盒中活動4 min，盡量減少外界因素對大鼠產(chǎn)生的影響。BBS總分0～9分，0分表示后肢運動功能完全喪失，9分表示后肢運動功能完全恢復(fù)正常。2名對實驗設(shè)計毫不知情觀察者分別獨立記錄功能評分。如果評分存在差異，經(jīng)過分析討論后統(tǒng)一分?jǐn)?shù)。(2)斜板實驗：術(shù)后每周將大鼠置于斜板上測試1次以評估大鼠的運動功能，連續(xù)10周，記錄大鼠在斜板上停留超過5 s的最大斜板傾斜角度，測試過程中要保證周圍環(huán)境完全安靜，避免大鼠受到外界刺激，影響實驗結(jié)果。

1.11 組織學(xué)觀察術(shù)后10周后，所有的運動分析已經(jīng)完成，注射過量戊巴比妥鈉處死大鼠。沿著原切口切開，切取損傷部位脊髓組織，測量脊髓組織的直徑并記錄。將脊髓組織置入配好的組織固定液中，使細(xì)胞保持原有的組織結(jié)構(gòu)。使用乙醇做脫水處理，脫水成功后加入二甲苯，取代脊髓組織中的乙醇，然后進(jìn)行浸蠟、包埋、切片(8 μm厚)。使用蘇木精水溶液加酒精伊紅染色后，在倒置相差顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 NSC的分離培養(yǎng)觀察Wister胎鼠大腦皮層組織細(xì)胞的體外生長情況，倒置相差顯微鏡下新接種細(xì)胞的細(xì)胞懸液折光性較強(qiáng)呈橢圓形；原代培養(yǎng)24 h后，大部分細(xì)胞在內(nèi)鏡下貼壁，少量細(xì)胞懸浮為單細(xì)胞，折光性降低。48 h后細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡，剩余細(xì)胞大多數(shù)聚集成大小不同的細(xì)胞簇并開始分裂(圖1A)；5 d后細(xì)胞分裂趨于穩(wěn)定，隨著細(xì)胞的生長形成了大小不一的球狀細(xì)胞叢(5～10個細(xì)胞)，鏡下觀察其胞體比例較大，胞漿顏色較暗，胞質(zhì)占比較小，形態(tài)規(guī)則，界限清晰，折光性較強(qiáng)，在光鏡下符合NSC的特征。原代克隆傳代后，細(xì)胞分裂生長能力較強(qiáng)，4～5 d后生長出體積大、數(shù)量多的二代克隆球(圖1B)。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞具備很強(qiáng)的分裂增殖能力，即使在連續(xù)分裂傳代20代以上，仍然保持著分裂增殖和克隆的能力，符合NSC的特征。不過在傳代次數(shù)達(dá)到30次以上后，細(xì)胞分裂增殖的速度下降，其原因有待研究。

A為經(jīng)過體外培養(yǎng)48 h胎鼠大腦皮層細(xì)胞(×100)；B為經(jīng)過體外培養(yǎng)7 d的胎鼠大腦皮層細(xì)胞(×100)；C為未進(jìn)行磁珠分選的胎鼠大腦皮層細(xì)胞(×400)；D為進(jìn)行磁珠分選后的胎鼠大腦皮層細(xì)胞(×400)。

2.2 nestin陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果分析將純化后得到的細(xì)胞懸浮液經(jīng)流式細(xì)胞儀測定，小鼠抗大鼠nestin表達(dá)陽性的細(xì)胞占所有樣本細(xì)胞的(90.5±2.5)%(圖2)。細(xì)胞活性測定出細(xì)胞活力為(96.3±1.8)%。上述分析的結(jié)果顯示微小免疫磁珠純化的NSC活性并未受到影響且純度較高，符合該實驗的基本要求。

2.3 NSC的誘導(dǎo)分化與鑒定免疫熒光檢測結(jié)果顯示GFAP反應(yīng)陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的75%左右。電鏡下細(xì)胞質(zhì)大而淡綠色，細(xì)胞壁有較多的突起，對比星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特點(圖3A)可知大部分NSC細(xì)胞具備分化為星型膠質(zhì)細(xì)胞的能力；MBP反應(yīng)陽性細(xì)胞僅占所有細(xì)胞的20%左右，其在電鏡下呈綠色，由此可知少數(shù) NSC細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖3B)；電鏡下僅有3%的細(xì)胞呈紅色，這類細(xì)胞突起較少但較長，表明βtubulinⅢ 反應(yīng)陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的3%左右，可以認(rèn)為少量NSC已分化為神經(jīng)元(圖3C、3D)。該分化和鑒定結(jié)果進(jìn)一步證明了通過微小免疫磁珠法分離培養(yǎng)獲取的細(xì)胞是NSC，其具有一般NSC增殖和多向分化的能力。

圖3 免疫熒光鏡下觀察NSC的分化能力

2.4 組織學(xué)觀察術(shù)后10周取材，肉眼可見對照組損傷節(jié)段脊髓及其周圍組織破壞程度高于實驗組，空白對照組和培養(yǎng)液組肉眼下觀察無明顯區(qū)別。HE染色后于鏡下觀察：干細(xì)胞移植的實驗組鏡下可見有大量梭形細(xì)胞生長(見圖4B)、脊髓直徑大于對照組(見圖4A)；對照組(圖4C、4D)可見大量脊髓組織壞死，鏡下可見單核細(xì)胞浸潤，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，組織壞死程度大于實驗組。

2.5 動物實驗觀察大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果如下。(1)SCI模型構(gòu)建14 d后3組大鼠的BBB評分符合SCI。實驗組28～70 d的BBB評分高于空白對照組、培養(yǎng)液組(P<0.05)?？瞻讓φ战M和培養(yǎng)液組BBB評分全程組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖5)。(2)實驗組大鼠28～70 d在斜板上停留5 s的平均最大角度均大于空白對照組和培養(yǎng)液組(P<0.05)。空白對照組和培養(yǎng)液組大鼠 28～70 d在斜板上停留5 s的平均最大角度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

A、B為實驗組HE染色(光鏡，×400)；C、D為對照組HE染色(光鏡，×400)。

表1 斜板實驗數(shù)據(jù)

圖5 SCI后干細(xì)胞移植后的運動功能分析

3 討論

盡管對神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了幾十年的基礎(chǔ)和臨床研究，但目前SCI的預(yù)后仍然較差[15]。SCI的機(jī)制復(fù)雜，有研究表明組織炎癥和細(xì)胞凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的主要過程[16]。即使在原發(fā)創(chuàng)傷性損傷中存活下來的神經(jīng)元也可能在隨后的繼發(fā)性損傷中死亡。這種二次損傷往往是導(dǎo)致不可逆損傷和功能喪失的主要原因?？茖W(xué)研究已經(jīng)證實，使用干細(xì)胞用作種子細(xì)胞治療SCI時，可以通過抑制局部炎癥反應(yīng)、促進(jìn)分泌生長因子、改善局部微環(huán)境等途徑促進(jìn)受損神經(jīng)再生[17]。而大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)病變均與NSC數(shù)量及功能失調(diào)直接相關(guān)[18]。運用NSC移植治療SCI時，為了促進(jìn)功能恢復(fù)，必須抑制炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡和壞死，改善受損組織的微環(huán)境，以增強(qiáng)神經(jīng)元的再生，促進(jìn)軸突再生和重建[19]。為了闡明干細(xì)胞移植在治療SCI中的作用模式，研究者做出了大量的努力，并發(fā)表了多篇文獻(xiàn)[20-21]。移植細(xì)胞在SCI的不同階段發(fā)揮多種神經(jīng)和血管保護(hù)作用已經(jīng)得到證實。這些細(xì)胞不僅能重組神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，還能減少局部和全身炎癥，支持軸突再生和突觸發(fā)芽，減少膠質(zhì)瘢痕。其機(jī)制可細(xì)分為3種不同的機(jī)制：細(xì)胞替代、功能多能性和干細(xì)胞再生。細(xì)胞替代可通過將移植細(xì)胞分化為神經(jīng)元或血管細(xì)胞，以促進(jìn)組織和功能恢復(fù)[22]。功能多能性描述了移植細(xì)胞分泌各種營養(yǎng)因子，這些因子有助于改善神經(jīng)損傷和促進(jìn)神經(jīng)回路的再生[23]。干細(xì)胞再生發(fā)生在脊髓中，移植細(xì)胞可激活宿主NSC的再生[24]。目前在SCI治療領(lǐng)域，干細(xì)胞移植治療可用于實現(xiàn)2個主要目標(biāo)。(1)再生：尋求替代丟失或受損的神經(jīng)元，并誘導(dǎo)軸突再生或可塑性。(2)修復(fù)：替代支持細(xì)胞，如少突膠質(zhì)細(xì)胞，以誘導(dǎo)髓鞘形成和防止進(jìn)行性髓鞘丟失，使內(nèi)源性細(xì)胞免受進(jìn)一步繼發(fā)性損傷[25]。近年來種種研究也表明，使用干細(xì)胞治療可以改善急性SCI[26-28]。Schira等[29]將不受限制的干細(xì)胞移植到胸水平的背側(cè)半切損傷附近，結(jié)果病變減輕，組織保留、軸突再生增強(qiáng)，運動功能改善。Shinozaki等[30]解釋了干細(xì)胞治療SCI的策略，一些動物研究和臨床研究證明了干細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞再生和功能恢復(fù)[31]。這讓人們有理由認(rèn)為干細(xì)胞移植在SCI治療領(lǐng)域存在廣泛前景。而進(jìn)行干細(xì)胞移植治療的前提是獲得高度均一的NSC，這一直以來是細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點和難點。

本研究采用間接陽性法純化NSC，利用抗原抗體特異性結(jié)合的生物原理和磁珠在磁場中受電磁力影響的物理原理，在不影響NSC活力與功能的前提下提高了NSC的提純率。與傳統(tǒng)免疫磁珠法制備NSC的方法不同，本實驗所使用的磁珠為微小磁珠(一般直徑≤30 nm)，其最為重要的特點是體積為普通磁珠的千分之一，對NSC功能的影響可以忽略不計，可直接用于實驗研究或臨床治療[32]，提高效率的同時降低了出現(xiàn)NSC污染的概率，解決了NSC移植治療SCI種子細(xì)胞獲取的問題。

本實驗充分利用微小免疫磁珠法制備的NSC的優(yōu)點，將NSC直接移植到SCI的大鼠模型中，實驗組功能改善優(yōu)于對照組，這為NSC移植治療SCI提供了實驗依據(jù)，也為移植治療SCI提供種子細(xì)胞獲取的方法。從組織學(xué)的角度分析，實驗組與對照組相比具有較多的梭形細(xì)胞，損傷恢復(fù)傾向較為明顯，組織結(jié)構(gòu)也較為穩(wěn)定，進(jìn)一步證實了NSC移植用于治療SCI的可行性。然而，將干細(xì)胞成功移植到靶組織并發(fā)揮作用仍然具有很多挑戰(zhàn)。例如，細(xì)胞去分化、免疫排斥和腫瘤形成等尚未解決的問題，進(jìn)一步限制了干細(xì)胞移植治療SCI的臨床應(yīng)用[33-34]，這需要進(jìn)一步深度研究。本實驗為運用微小免疫磁珠法制備的NSC用于實驗研究或移植治療提供了實驗依據(jù)，為后續(xù)SCI治療打下了基礎(chǔ)。