李 華，曾智華，陳秋玲，彭冬梅，鄧燕霞

(長(zhǎng)沙市婦幼保健院產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是最常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥之一，與孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[1]。然而，目前尚無(wú)可用于GDM的有效預(yù)測(cè)系統(tǒng)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。微生物被認(rèn)為是宿主新陳代謝和健康的重要貢獻(xiàn)者之一，妊娠期間孕婦腸道微生物群發(fā)生顯著變化，可能導(dǎo)致妊娠期代謝功能發(fā)生障礙，比如GDM。最近研究報(bào)告了GDM患者和血糖正常孕婦腸道微生物群的差異[2]，尚無(wú)法判斷因果關(guān)系。根據(jù)2021年《糖尿病的分類和診斷》指南[3]，所有患者在診斷GDM后都應(yīng)該接受教育性飲食干預(yù)，進(jìn)行精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)指導(dǎo)，但孕婦的遵守情況存在很大差異。因此，本研究的目的是評(píng)估GDM患者體內(nèi)的腸道微生物群組成是否在妊娠中期至妊娠晚期發(fā)生了變化，對(duì)飲食建議依從性較高的患者與依從性較差的患者比較，是否呈現(xiàn)出不同的微生物模式。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于2021年6月至12月從長(zhǎng)沙市婦幼保健院連續(xù)招募了31名GDM患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：孕24～28周、漢族、經(jīng)75g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)診斷的GDM。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙胎妊娠，懷孕期間使用過(guò)益生元/益生菌、抗生素或任何藥物，懷孕前或懷孕期間的任何病理狀況(已知的糖尿病、高血壓、心血管疾病、肺部疾病、自身免疫病、肝臟或腎臟疾病、甲狀腺功能障礙、癌癥、其他疾病/病癥)，不遵守研究方案。所有研究對(duì)象都服用葉酸補(bǔ)充劑。每位研究對(duì)象都簽署了書面知情同意書。

所有GDM患者都按照指南常規(guī)接受營(yíng)養(yǎng)咨詢和飲食指導(dǎo)(碳水化合物占總能量的45%，快速吸收的糖占<10%的總能量，蛋白質(zhì)占總能量的18%～20%，脂肪占總能量的35%，每天至少攝入20～25g纖維，不飲酒)[4]。此外，建議每天進(jìn)行30min的適度運(yùn)動(dòng)(即快走)。根據(jù)指南[3]，在存在高血糖的情況下，醫(yī)生會(huì)開(kāi)具胰島素治療處方。

1.2 樣本采集、人體測(cè)量和飲食信息

在診斷GDM(入組時(shí)，孕24～28周)時(shí)及在研究結(jié)束時(shí)(孕38周)或分娩前(如果是早產(chǎn))，從所有孕婦中收集問(wèn)卷、人體測(cè)量值、空腹血液樣本和糞便樣本。研究人員通過(guò)建立微信群與患者保持持續(xù)聯(lián)系，定期到醫(yī)院產(chǎn)檢，以了解孕期進(jìn)展。研究對(duì)象在入組時(shí)和研究結(jié)束時(shí)完成了3天的飲食記錄(2個(gè)工作日和1個(gè)休息日)。向所有研究對(duì)象提供有關(guān)如何使用常見(jiàn)家庭措施記錄食物和飲料消耗的詳細(xì)信息。

1.3 血樣分析

通過(guò)葡萄糖氧化酶法測(cè)量孕婦血清葡萄糖，采用高效液相色譜法測(cè)定糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)水平。通過(guò)脂肪酶/甘油激酶終點(diǎn)法測(cè)定甘油三酯，膽固醇過(guò)氧化物酶法測(cè)定膽固醇，直接免疫抑制法測(cè)定高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)-膽固醇。通過(guò)電化學(xué)發(fā)光法(羅氏公司)測(cè)定胰島素。使用特種蛋白分析儀(深圳普門)免疫比濁法測(cè)定血清C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)值。

1.4 糞便DNA提取

從收集的孕婦糞便中提取核酸。使用RNeasy Power Microbiome KIT(美國(guó)Qiagen公司)從樣品中提取總DNA。加入1μL RNase(美國(guó)Illumina公司)以消化DNA樣品中的RNA，在37℃下孵育1h。使用QUBIT dsDNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司)對(duì)DNA進(jìn)行定量，并以5ng/μL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 16S rRNA擴(kuò)增子靶測(cè)序

使用從糞便樣本中直接提取的DNA，通過(guò)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域來(lái)評(píng)估微生物群。使用Agencourt AMPure試劑盒(美國(guó)Beckman Coulter公司)清潔PCR擴(kuò)增子，并使用Nextera XT Index Kit(美國(guó)Illumina公司)標(biāo)記所得產(chǎn)物。在第二個(gè)純化步驟之后，使用QUBIT dsDNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司)對(duì)擴(kuò)增子產(chǎn)物進(jìn)行量化。隨后，匯集來(lái)自不同樣品的等量擴(kuò)增子。使用具有V3化學(xué)成分的MiSeq Illumina儀器(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行測(cè)序，并生成250bp的雙末端讀數(shù)。

1.6 生物信息學(xué)分析

雙端讀取首先使用FLASH軟件組裝，并使用QIIME 1.9.0軟件進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾。以97%的相似性挑選的操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)被稀釋到每個(gè)樣本的序列數(shù)量最少。通過(guò)QIIME獲得的OTU顯示達(dá)到的更高分類分辨率；當(dāng)分類分配無(wú)法到達(dá)屬時(shí)，會(huì)顯示姓氏。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

腸道微生物群α多樣性通過(guò)Chao1指數(shù)評(píng)估，估計(jì)不同菌群的數(shù)量，并通過(guò)R語(yǔ)言中使用Vegan package68的多樣性函數(shù)計(jì)算香農(nóng)多樣性指數(shù)以評(píng)估菌群豐富度。非正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為中位數(shù)(四分位數(shù))。通過(guò)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)或Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn)比較計(jì)量資料的組間差異。通過(guò)卡方檢驗(yàn)比較分類變量之間的差異。Spearman非參數(shù)相關(guān)性分析用于分析微生物類群的相對(duì)豐度與飲食、代謝變量之間的關(guān)系。采用多元回歸分析評(píng)估微生物類群豐度與營(yíng)養(yǎng)攝入量之間的關(guān)聯(lián)。以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般資料

與入組時(shí)(孕24～28周)相比，研究結(jié)束時(shí)(孕38周)孕婦的體重、BMI、收縮壓、空腹胰島素、總膽固醇、CRP、甘油三酯均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 入組時(shí)和研究結(jié)束時(shí)研究對(duì)象的一般資料Table 1 General characteristics of participants at the time of enrollment and at the end of the

2.2 遵守飲食建議情況

營(yíng)養(yǎng)咨詢后，35.5%(11/31)的孕婦表示遵守給定的飲食建議。依從者和非依從者入組時(shí)的特征比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究結(jié)束時(shí)，與非依從者相比，依從者的糖、飽和脂肪酸攝入量減少，纖維攝入量增加(P<0.05)。依從者的空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR、CRP水平的變化均顯著小于非依從者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 依從者與非依從者的特征變化Table 2 Characteristics changes of those with compliance and those without

2.3 入組時(shí)和研究結(jié)束時(shí)孕婦的微生物群組成變化

與孕婦入組時(shí)相比，研究結(jié)束時(shí)孕婦的微生物群α多樣性值存在顯著差異，表現(xiàn)在物種豐富度、菌種數(shù)量和香農(nóng)指數(shù)顯著升高(t值分別為6.752、7.623、6.539，P<0.05)，見(jiàn)圖1A。在屬水平的箱線圖顯示，研究結(jié)束時(shí)Bacteroides、Collinsella和Rikenellaceae的豐度顯著降低，而B(niǎo)lautia、Butyricicoccus、Clostridium、Coprococcus、Dorea、Faecalibacterium、L-Ruminococcus和Lachnospiraceae顯著增加，見(jiàn)圖1B。

2.4 飲食依從性與微生物群變化

入組時(shí)和研究結(jié)束時(shí)的微生物群在依從者和非依從者中的變化相似，見(jiàn)圖1B。在妊娠進(jìn)展期間，Blautia、Coprococcus、Dorea和Lachnospiraceae在兩組中顯著增加，而Rikenellaceae減少。在研究結(jié)束時(shí)檢測(cè)到了特定的微生物群變化：依從者中的Bacteroides豐度顯著減少，非依從者中Faecalibacterium和L-Ruminococcus豐度顯著更高，見(jiàn)圖1B。

2.5 微生物群與營(yíng)養(yǎng)攝入及代謝的關(guān)聯(lián)

Spearman相關(guān)性和多元回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)aecalibacterium與蛋白質(zhì)攝入呈正相關(guān)(ρ=0.34，P<0.05)，與空腹血糖變化呈負(fù)相關(guān)(ρ=-0.56，P<0.05)。Rikenecellaceae與收縮壓呈負(fù)相關(guān)(ρ=-0.53，P<0.05)。Blautia與HbA1c變化、空腹胰島素變化和HOMA-IR變化呈負(fù)相關(guān)(ρ值分別為-0.53、-0.37、-0.37，P<0.05)。Butyricimonas、Collinsella與空腹胰島素變化(ρ值分別為0.43、0.47，P<0.05)和HOMA-IR變化(ρ值分別為0.50、0.46，P<0.05)呈正相關(guān)，見(jiàn)表3。

注：A.箱線圖描述GDM患者在入組時(shí)和研究結(jié)束時(shí)糞便微生物群的α多樣性。B.箱線圖顯示OTU在屬水平上的相對(duì)豐度，基于糞便樣本中Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。

表3 研究結(jié)束時(shí)微生物群組成與飲食、代謝變量之間的關(guān)聯(lián)Table 3 Relationships between microbiome composition and dietary and metabolic variables at the end of the study

項(xiàng)目ρβ95%CIPHbA1c變化(%) Blautia-0.53-0.08-0.11～-0.040.001空腹胰島素變化(μIU/mL) Blautia-0.37-0.45-0.69～-0.180.001 Butyricimonas0.4336.3314.64～57.440.002 Collinsella0.478.705.97～11.32<0.001 Coprobacillus0.416.543.31～9.66<0.001HOMA-IR變化(mmol/L×μIU/mL) Blautia-0.37-0.12-0.18～-0.090.002 Butyricimonas0.5011.286.46～15.88<0.001 Collinsella0.462.411.79～2.96<0.001

3 討論

3.1 胰島素敏感與微生物群豐度的關(guān)系

妊娠晚期胰島素敏感性降低被認(rèn)為有利于支持胎兒生長(zhǎng)和增加營(yíng)養(yǎng)吸收。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HbA1c水平與微生物群豐度相關(guān)[5]。動(dòng)物研究中，移植了肥胖和瘦人糞便的小鼠顯示出OTU豐度與空腹胰島素和HOMA-IR水平呈正相關(guān)[6]。已發(fā)現(xiàn)較高的Bacteroides豐度與血漿葡萄糖水平升高相關(guān)[7]。在本研究中，Bacteroides與空腹胰島素變化和HOMA-IR變化呈正相關(guān)，表明Bacteroides參與血糖的調(diào)節(jié)。

3.2 妊娠期飲食變化對(duì)微生物群組成的影響

本研究的大部分患者食用了低纖維和高脂肪的飲食，這是一種與GDM相關(guān)的不健康飲食模式。她們中的大多數(shù)(約2/3)在接受營(yíng)養(yǎng)建議后并沒(méi)有明顯改變其飲食習(xí)慣，并且表現(xiàn)出比依從孕婦更差的代謝和炎癥模式。孕婦增加了糖的攝入量，可能與胰島素抵抗增加有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)攝入與微生物豐度之間幾乎沒(méi)有關(guān)聯(lián)。關(guān)于妊娠期腸道微生物群組成和飲食攝入的研究結(jié)果尚有爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群和膳食攝入量之間沒(méi)有關(guān)系[8]，也有研究認(rèn)為膳食脂肪、維生素D與變形菌增加有關(guān)[9]。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了二者關(guān)系的巨大異質(zhì)性，并說(shuō)明研究結(jié)果比較的困難，這可能是由于不同的飲食習(xí)慣、荷爾蒙變化導(dǎo)致的微生物群重塑以及由GDM引起的胰島素抵抗。飲食模式的短期變化已被證明可以快速調(diào)節(jié)微生物群的組成。盡管人類腸道微生物群需要更長(zhǎng)時(shí)間和持續(xù)的修改來(lái)塑造，但飲食改變后會(huì)發(fā)生快速但短暫的變化[10]。在本研究中，雖然微生物群在依從者和非依從者中的變化相似，但依從者的空腹血糖、胰島素抵抗和CRP值波動(dòng)更小。

3.3 微生物群對(duì)孕婦炎癥、血糖、血壓的影響

在正常懷孕期間，會(huì)出現(xiàn)低度炎癥，并且GDM是一種促炎狀態(tài)[11]。本研究觀察到妊娠晚期CRP值較高。促炎和抗炎細(xì)菌種類的不平衡會(huì)引發(fā)人類的低度炎癥和胰島素抵抗[11]。Faecalibacterium作為一種抗炎共生細(xì)菌，隨著妊娠的進(jìn)展顯著增加[12]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Faecalibacterium豐度與空腹血糖值之間存在很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，支持了炎癥與代謝異常之間的關(guān)聯(lián)。因此，在宏基因組分析中，F(xiàn)aecalibacterium對(duì)2型糖尿病的診斷具有高度鑒別力[13]。此外，在人類糞便微生物群研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌與糖尿病呈負(fù)相關(guān)[14]。在本研究中，分析發(fā)現(xiàn)舒張壓與Rikenellaceae之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Rikenellaceae是一種丁酸鹽生產(chǎn)者，Rikenellaceae對(duì)超重孕婦的血壓具有保護(hù)作用，其產(chǎn)生丁酸鹽的能力主要與維持正常血壓有關(guān)[15]。

本研究也發(fā)現(xiàn)Collinsella和胰島素/HOMA-IR值之間存在直接關(guān)聯(lián)，這與其他研究報(bào)道一致[16]，GDM患者乳酸的產(chǎn)生促使Collinsella豐度增加，Collinsella可以通過(guò)降低肝糖原生成和發(fā)揮促炎作用來(lái)影響新陳代謝。此外，我們觀察到Blautia與HbA1c、IR呈負(fù)相關(guān)。研究表明，Blautia與高血糖癥之間存在直接關(guān)聯(lián)[17]，其他研究也發(fā)現(xiàn)Blautia的豐度增加表明腸道炎癥及血壓值降低、1型糖尿病和肥胖癥的風(fēng)險(xiǎn)降低，存活率增加[18]。

綜上所述，GDM患者在妊娠期間檢測(cè)到具有更高α多樣性的微生物群組成的變化，以及代謝/炎癥模式與特定細(xì)菌豐度之間的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果可能有助于制訂調(diào)節(jié)腸道微生物群的策略。