王小鳳，韓程成，康 瑛，賀同強(qiáng)，曹引麗

(西北婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061)

子癇前期(pre-eclampsia，PE)是一種妊娠特異性綜合征，全球發(fā)病率為4%～8%，主要發(fā)生在妊娠中后期，其特點(diǎn)是血壓升高并伴有蛋白尿、多器官并發(fā)癥，嚴(yán)重影響母嬰結(jié)局，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒死亡的重要原因，具體發(fā)病原因尚不明確[1-2]。有研究認(rèn)為PE的發(fā)生與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力不足導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙有關(guān)[3]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移與侵襲等多種細(xì)胞功能，研究顯示，circRNA可調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及血管生成，參與PE的發(fā)生發(fā)展[4]。環(huán)狀RNA妊娠相關(guān)蛋白A(circular RNA pregnancy-associated plasma protein-A，CircPAPPA)屬于circRNA之一，CircPAPPA在PE患者胎盤與血漿中表達(dá)水平降低，下調(diào)CircPAPPA通過抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖促進(jìn)PE的發(fā)生發(fā)展[5]。miR-3127-5p可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤耐藥，如在肝癌中，敲減miR-3127-5p可通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期素依賴性激酶10(cyclin-dependent kinase 10，Cdk10)的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞侵襲及遷移[6]。通過starbase在線分析顯示，CircPAPPA、miR-3127-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，推測CircPAPPA、miR-3127-5p共同參與PE的發(fā)生發(fā)展。目前CircPAPPA、miR-3127-5p在PE的臨床研究報(bào)道不多，本研究探討CircPAPPA、miR-3127-5p在PE患者血清中的表達(dá)情況，探討二者與PE的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年6月至2022年3月在西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)前檢查的93例PE孕婦為研究對(duì)象，作為PE組，年齡(27.35±5.76)歲；選擇同期健康孕婦90例作為對(duì)照組，年齡(26.87±5.81)歲。根據(jù)病情嚴(yán)重程度，將PE患者分為輕度組(53例)和重度組(40例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②自然妊娠且為單胎的孕婦；③年齡20～40歲；④有完整的產(chǎn)檢記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性高血壓、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等患者；②有精神疾病的患者；③心、肝、腎等主要臟器病變及感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病等；④胎兒畸形、胎盤早剝等其他產(chǎn)科并發(fā)癥。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

記錄患者年齡、孕前身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、分娩孕周、孕次、產(chǎn)次等資料，測量收縮壓、舒張壓，收集24h尿液，采用雙縮脲法檢測24h尿蛋白。

1.2.2 血清CircPAPPA、miR-3127-5p的檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平。所有孕婦孕20～34周采集空腹靜脈血5mL，15 000rpm離心10min收集血清,-80℃保存。在血清中加入TRIzol試劑(百奧萊博，貨號(hào)：GL1311)提取總RNA，分光光度儀(賽默飛，型號(hào)NanoDrop 2000C)檢測RNA純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RT Master Mix for qPCR II(MCE，貨號(hào)：HY-K0510A)說明書合成cDNA，在CFX96熒光定量PCR儀(伯樂)上，使用SYBR Green qPCR Master Mix(MCE，貨號(hào)：HY-K0501A)試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中CircPAPPA上游引物序列(5′-3′)：TGTGGCCTCCATCCTACATCTCAA；下游引物序列(5′-3′)：CAGGTGCGGACACTGGACTTAC。GAPDH上游引物序列(5′-3′)：TGACTTCAACAGCGACACCCA；下游引物序列(5′-3′)：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。miR-3127-5p上游引物序列(5′-3′)：ATCAGGGCTTGTGGAATGGG；下游引物序列(5′-3′)：GAACATGTCTGCGTATCTC。U6上游引物序列(5′-3′)：TGGCTCAACTACGATCGGCA；下游引物序列(5′-3′)：GGACTCACCGATGGTACAGA。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算CircPAPPA、miR-3127-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 妊娠結(jié)局判斷

對(duì)所有PE孕婦進(jìn)行隨訪，記錄不良妊娠結(jié)局，包括胎兒生長受限、新生兒死亡、早產(chǎn)、胎兒窘迫、新生兒窒息等。根據(jù)妊娠結(jié)局分為良好組(31例)和不良組(19例)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PE組與對(duì)照組一般資料比較

PE組與對(duì)照組的年齡、孕前BMI、孕次、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PE組剖宮產(chǎn)比例、舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白顯著高于對(duì)照組，分娩孕周顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 PE組與對(duì)照組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between the PE group and the control

2.2 PE組與對(duì)照組血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，PE組患者血清CircPAPPA表達(dá)水平顯著降低，miR-3127-5p表達(dá)水平顯著升高(t值分別為10.862、15.749，P<0.05)，見表2。

表2 PE組與對(duì)照組血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels between the PE group

2.3 不同嚴(yán)重程度PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平及24h尿蛋白比較

與輕度組比較，重度組PE患者血清CircPAPPA表達(dá)水平顯著降低，miR-3127-5p表達(dá)水平、24h尿蛋白顯著升高(t值分別為7.774、9.652、18.493，P<0.05)，見表3。

表3 不同嚴(yán)重程度PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels of PE patients with different

2.4 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，PE患者的血清CircPAPPA、miR-3127-5p與年齡、BMI、孕周、生產(chǎn)方式、孕次、產(chǎn)次無關(guān)，CircPAPPA與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，miR-3127-5p與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlations between serum CircPAPPA, miR-3127-5p levels and clinical indicators in PE patients

2.5 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平相關(guān)性

PE患者血清CircPAPPA與miR-3127-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.610，P<0.05)，見圖1。

圖1 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平相關(guān)性Fig.1 Correlation between expression levels of CircPAPPA and miR-3127-5p in serum of PE patients

2.6 不同妊娠結(jié)局孕婦血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平比較

93例PE患者，有44例發(fā)生不良妊娠結(jié)局，其中生長受限20例，宮內(nèi)窘迫12例，早產(chǎn)8例，死亡4例。與良好組比較，孕中、晚期不良妊娠結(jié)局孕婦血清CircPAPPA表達(dá)水平顯著降低，miR-3127-5p表達(dá)水平顯著升高(孕中期：t值分別為2.582、4.407；孕晚期：t值分別為6.095、6.501，P<0.05)，見表5、表6。

表5 孕中期不同妊娠結(jié)局孕婦血清CircPAPPA、 miR-3127-5p表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels of pregnant women with different pregnancy outcomes in the second

表6 孕晚期不同妊娠結(jié)局孕婦血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels of pregnant women with different pregnancy outcomes in the third

3 討論

3.1 PE發(fā)病的可能影響因素

PE特發(fā)于妊娠期婦女，可導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)高血壓、水腫和蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重者可引發(fā)子癇、心臟衰竭等各種并發(fā)癥，并引起胎兒生長受限，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及胎兒死亡的主要原因，早期診斷及加強(qiáng)早期治療具有重要意義[8]。非編碼RNA(miRNA、circRNA、lncRNA)在血清、血漿中表達(dá)穩(wěn)定，多項(xiàng)研究報(bào)道顯示，PE患者外周血miRNA、circRNA表達(dá)譜與健康人群有差異，通過檢測血液中非編碼RNA可判斷疾病的發(fā)生、病情與預(yù)后[9]。

3.2 CircPAPPA與PE的相關(guān)性

CircRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲及血管生成，參與多種疾病病理過程，如妊娠期高血壓、糖尿病、PE等多種妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，已有報(bào)道顯示，CircRNA在PE患者外周血異常表達(dá)，成為PE診斷及病情評(píng)估的標(biāo)志物[10]。CircPAPPA是妊娠相關(guān)蛋白A的環(huán)狀RNA，PAPP-A是孕早期唐氏篩查的參考指標(biāo)，主要由胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)的活性影響胎盤的發(fā)育，PAPP-A在PE中表達(dá)水平降低，預(yù)測PE發(fā)生的敏感度較低[11]。本研究結(jié)果顯示，PE患者血清中CircPAPPA表達(dá)水平顯著降低，且重度組PE患者的血清CircPAPPA表達(dá)水平顯著低于輕度患者，提示CircPAPPA可能參與PE的發(fā)生，與PE患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

3.3 miR-3127-5與PE的相關(guān)性

circRNA可充當(dāng)miRNA的海綿分子調(diào)控基因表達(dá)而參與疾病進(jìn)展，miR-3127-5p屬于miRNA，在腫瘤領(lǐng)域研究的較多，miR-3127-5p在結(jié)直腸癌、宮頸癌中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)miR-3127-5p可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[12]。另有研究顯示，miR-3127-5p可參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能而參與腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-3127-5p在PE患者血清中表達(dá)水平顯著升高，且輕度PE患者、重度PE患者血清miR-3127-5p表達(dá)水平依次升高，提示其可能與PE病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

3.4 CircPAPPA、miR-3127-5與PE妊娠結(jié)局的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，PE患者CircPAPPA與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈負(fù)相關(guān)，miR-3127-5p與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示CircPAPPA、miR-3127-5p與PE患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)。PE的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，多數(shù)研究認(rèn)為PE的發(fā)生與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤子宮螺旋動(dòng)脈過淺有關(guān)[14]。Li等[15]研究顯示，circPAPPA通過調(diào)控miR-3127-5p表達(dá)抑制同源框A7(homeobox A7，HOXA7)表達(dá)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，介導(dǎo)PE的進(jìn)展。本研究顯示，PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且通過starbase在線分析顯示，CircPAPPA、miR-3127-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)CircPAPPA可靶向負(fù)調(diào)控miR-3127-5p表達(dá)，因此推測CircPAPPA通過靶向調(diào)控miR-3127-5p表達(dá)，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵襲，導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙，血管重塑障礙，促進(jìn)PE的發(fā)生發(fā)展。PE是造成不良母嬰結(jié)局的重要疾病之一，本研究顯示，孕中期、孕晚期不良妊娠結(jié)局孕婦血清CircPAPPA表達(dá)水平顯著低于良好組，miR-3127-5p表達(dá)水平顯著高于良好組，提示CircPAPPA、miR-3127-5p與PE妊娠結(jié)局相關(guān)。CircPAPPA水平降低，miR-3127-5p水平升高，可能通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤加重PE病情，進(jìn)而影響妊娠結(jié)局。

綜上所述，PE患者血清CircPAPPA表達(dá)水平降低，miR-3127-5p表達(dá)水平升高，且與PE病情嚴(yán)重程度及妊娠結(jié)局相關(guān)，有一定臨床應(yīng)用價(jià)值，但其具體作用機(jī)制仍需做進(jìn)一步研究。