茅佳欽，熊俞婧，方 正，陳書強，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心，陜西 西安 710038)

近年來，輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)取得了飛速發(fā)展，但反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)仍是目前亟待解決的難題，其發(fā)生率約占行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療人群的10%[1]。目前較為公認的RIF診斷標準是：40歲以下的婦女，接受3次及以上新鮮或解凍胚胎移植周期，至少移植4枚優(yōu)質胚胎而未能獲得臨床妊娠[2]。其常見原因包括胚胎染色體核型異常、女性解剖結構異常、男性因素、遺傳因素、內分泌異常、感染及高凝傾向等[3]。

外泌體是一種直徑在40～160nm的細胞外囊泡，來源于細胞膜向內出芽形成的胞內小體，其在細胞內經過多種生物學過程，最終以外吐的方式排出細胞[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以通過其攜帶的功能蛋白、mRNA和非編碼RNA發(fā)揮細胞間通訊的功能[5]。蛻膜化是指子宮內膜基質細胞在甾體激素和多種蛻膜化誘導因子的作用下，增殖并分化為分泌型蛻膜細胞的過程，是胚胎植入和妊娠維持的重要環(huán)節(jié)[6]。RIF患者子宮內膜組織中蛻膜化標志基因胰島素樣生長因子結合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein,IGFBP-1)和催乳素(prolactin，PRL)的表達下調，提示子宮內膜基質蛻膜化水平降低[7]。有研究證據(jù)表明外泌體在母胎界面和促進胚胎種植、發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，子宮內膜分泌的外泌體異?？赡軙е伦訉m內膜容受性異常。此外，有研究發(fā)現(xiàn)種植失敗的不孕患者與種植成功的不孕患者相比，多種血漿外泌體miRNA的表達發(fā)生改變[8]。那么RIF患者的外周血外泌體能否通過miRNA影響子宮內膜基質細胞的蛻膜化呢？目前這部分生物學研究仍較少。因此，本研究旨在結合RIF患者外周血外泌體miRNA的改變探究影響子宮內膜基質細胞蛻膜化的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

外周血樣本取自于2021年8月1日至2021年12月31日前來空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院生殖中心就診的不孕患者，其中接受IVF治療的20名RIF患者作為RIF組，20名同期無特殊病史的不孕患者作為對照組。RIF組納入標準：①年齡<40歲；②經歷過3次移植周期，且至少移植過4枚優(yōu)質胚胎但均未獲得臨床妊娠。排除標準：①子宮解剖結構異常；②未治療的輸卵管積水；③子宮腺肌??；④中-重度宮腔粘連；⑤夫妻任一方染色體異常。對照組納入標準：①年齡<40歲；②輸卵管因素不孕的患者；③對患者進行隨訪，后續(xù)通過IVF-ET成功種植。排除標準：①以往經歷過IVF-ET，未成功妊娠；②子宮解剖結構異常、未治療的輸卵管積水、子宮腺肌病、中-重度宮腔粘連、夫妻任一方染色體異常。所有樣本的獲取均經過患者及其家屬的知情同意。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(不含酚紅)購自博士德公司；碳吸附胎牛血清(Charcoal stripped foetal bovine serum,CS-FBS)購自BioInd公司；胰蛋白酶、杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline,DPBS)購自Corning公司；RNAiso Plus、SYBR?Green PCR試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；α-Amanitin購自MCE公司；miRNA 第一鏈 cDNA 合成(莖環(huán)法)試劑盒、熒光定量PCR 8聯(lián)管購自生工生物工程有限公司；bromo-cAMP、MPA購自阿拉丁生化科技有限公司；M-PERTMMammalian Protein試劑、RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Lipofectamine RNAiMAX試劑購自ThermoFisher Scientific公司；蛋白電泳預制膠、快速轉膜試劑盒購自Bio-rad公司；小鼠抗人TSG101、CD9、CD81、Calnexin抗體購自Abcam公司；兔抗人FOXO1抗體、CoraLite488標記鬼筆環(huán)肽購自Proteintech公司；兔抗人β-actin購自CST公司；PKH26試劑盒購自Sigma公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Equitech-Bio公司；ECL化學發(fā)光液購自默克公司；Triton X-100、DAPI購自塞維爾生物公司。

1.1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱、生物安全柜購自Thermo、NanoDrop 2000超微量分光光度計公司；超速離心機購自Enppendorf公司；臺式高速冷凍離心機購自HERMLE公司；電泳儀、半干式電轉儀、實時熒光定量PCR儀、化學發(fā)光儀購自Bio-rad公司；全波長酶標儀購自美谷分子儀器有限公司；干式恒溫器購自奧盛儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡購自ZEISS公司。

1.2 主要方法

1.2.1子宮內膜基質細胞系細胞培養(yǎng)、蛻膜化誘導和轉染

人永生化子宮內膜基質細胞系(HESC)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。HESC細胞在含有10%碳吸附胎牛血清、1%胰島素-轉鐵蛋白、1mmol/L丙酮酸鈉、500ng/mL嘌呤霉素、1.5g/L碳酸氫鈉、1%青霉素和鏈霉素的無酚紅DMEM/F12完全培養(yǎng)基中以37℃、5%CO2培養(yǎng)。在誘導蛻膜化時，使用含有2%碳吸附胎牛血清、1μM的甲羥孕酮、0.5mmol/L的8-bromo-cAMP的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72h。用0.25%的胰蛋白酶消化HESC細胞3min后終止消化，800r/min離心5min，重懸細胞后進行細胞計數(shù)，按每孔5×105個細胞加入六孔板中，待細胞約占60%后進行轉染。將9μL脂質體RNAiMAX轉染試劑稀釋于150μL Opti-MEM培養(yǎng)基，將3μL濃度為10μmol/L的miRNA溶液稀釋于150μL Opti-MEM培養(yǎng)基，將稀釋后的脂質體RNAiMAX轉染試劑與稀釋后的miRNA溶液按1∶1的比例混合，室溫孵育5min后，每孔加入250μL混合液體，6h后換液。

1.2.2 外泌體提取、鑒定、共培養(yǎng)、示蹤

取5mL新鮮血漿，4℃條件下以500×g離心10min，轉移上清液至新的離心管中，20 000×g離心20min，取上清液，用DPBS稀釋10倍后在4℃條件下以120 000×g離心70min后棄去上清液，用DPBS重懸沉淀后再次以120 000×g離心70min，所得沉淀即為外泌體[9]。用100μL DPBS重懸外泌體后可進行下游實驗或置于低蛋白吸附管中于-80℃保存。將溶于DPBS中的外泌體用磷鎢酸復染，室溫干燥后利用透射電鏡觀察其形態(tài)，通過納米流式技術檢測其粒徑。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒提供的說明書測出外泌體溶液的蛋白濃度，按100μg/mL的濃度添加至培養(yǎng)液中用于共培養(yǎng)。將外泌體按照PKH26熒光標記染料說明書將外泌體染色，隨后120 000×g離心70min，重懸后加入培養(yǎng)基中過濾除菌，與HESC共培養(yǎng)24h后進行熒光染色，鏡下觀察。

1.2.3 實時定量PCR

當檢測細胞mRNA表達水平時用Thermo RNA提取試劑盒提取HESC細胞總RNA；當檢測細胞miRNA表達水平時使用RNAiso Plus提取HESC細胞總RNA。隨后用NanoDrop 2000測量RNA質量，再分別按照Thermo RNA提取試劑盒(反轉錄mRNA)和miRNA 第一鏈 cDNA 合成(莖環(huán)法)試劑盒(反轉錄miRNA)說明書進行逆轉錄，合成對應的cDNA。使用Takara試劑盒進行定量PCR檢測。在檢測外泌體miR-183-5p的表達時，在逆轉錄體系中加入0.5μL 20μM的cel-miR-39作為外源性參照物，細胞內miR-183-5p的表達以U6作為內參，IGFBP-1、PRL和FOXO1的表達以18sRNA作為內參。相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法。引物序列為：miR-183-5p，5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACAGTGAA-3′(逆轉錄)5′-AACAGTGTATGGCACTGGTAGA-3′(上游)，5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′(下游)。U6，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游)。IGFBP-1，5′-TTTTACCTGCCAAACTGCAACA-3′(上游)，5′-CCCATTCCAAGGGTAGACGC-3′ (下游)。PRL，5′-GGAGCAAGCCCAACAGATGAA-3′(上游)，5′-GGCTCATTCCAGGATCGCAAT-3′(下游)。FOXO1，5′-AAACACCAGTTTGAATTCACCC-3′(上游)，5′-TCGACTTATTGTCCTGAAGTGT-3′(下游)。

1.2.4 Western Blot檢測TSG101、CD9、CD81、Calnexin、FOXO1表達水平

用M-PERTMMammalian Protein試劑提取HESC細胞和外泌體蛋白，采用BCA法測定上清蛋白濃度。在上清中加入上樣緩沖液，95℃加熱7min，將制備好的蛋白樣品根據(jù)蛋白定量結果確定上樣量后進行凝膠電泳分離蛋白，使用Turbo轉印系統(tǒng)將分離好的蛋白轉移到PVDF膜上，5%BSA封閉1h，加入一抗TSG101(1∶3 000)、CD9(1∶1 000)、CD81(1∶1 000)、Calnexin(1∶1 000)、FOXO1(1∶3 000)，4℃過夜。用TBST洗膜3次后加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1h，TBST洗膜3次后浸入ECL發(fā)光液，轉移至Bio-rad發(fā)光系統(tǒng)中進行曝光。內參為β-actin，利用Image J軟件分析條帶的灰度值，將目的條帶與內參條帶灰度值的比值作為蛋白表達量。

1.2.5 免疫熒光染色

將細胞爬片取出，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次。使用2%的Triton X-100進行破膜，5min后PBS洗滌3次。將熒光標記的鬼筆環(huán)肽儲存液用PBS按1∶200的比例進行稀釋，室溫避光孵育20min后PBS洗滌3次。DAPI室溫避光孵育5min，PBS洗滌3次，用防熒光淬滅封片劑封片。用蔡司倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝。所有實驗均重復3次及以上。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組基本資料比較

RIF組與對照組的年齡、BMI、不孕診斷、不孕因素、活產史及流產史方面差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的基線資料Table 1 Baseline characteristics of

2.2 血漿外泌體鑒定

收集RIF組與對照組婦女的黃體期外周血血漿，通過超速離心法提取外泌體。通過透射電子顯微鏡進行觀察，鏡下可見外泌體呈茶杯托狀且具有雙層膜結構，見圖1A。利用納米粒徑跟蹤分析技術檢測，顯示外泌體囊泡直徑在40～150nm，見圖1B。Western Blot實驗顯示外泌體特征性膜蛋白TSG101、CD9和CD81均呈陽性，陰性對照Calnexin呈陰性，見圖1C。以上實驗提示外泌體分離成功[10]。

2.3 RIF患者血漿外泌體抑制HESC細胞的蛻膜化

誘導后IGFBP-1、PRL的表達水平顯著升高(t值分別為-4.438、-16.520,P<0.05)，見圖2A。同時在光鏡下，可見HESC細胞增大，外形變得不規(guī)則，細胞核亦增大，見圖2B，證明HESC細胞體外蛻膜化誘導成功。將血漿外泌體用PKH26染色后與HESC細胞共培養(yǎng)24h后，進行免疫熒光染色。鏡下可見，在胞質中存在大量標記的外泌體，證實外泌體已被HESC細胞攝取，見圖2C。將兩組外泌體與細胞共培養(yǎng)48h后，誘導體外蛻膜化，72h后通過qRT-PCR檢測IGFBP-1、PRL的表達情況，與對照組相比，RIF組患者血漿外泌體抑制了IGFBP-1、PRL的表達(t值分別為5.324、9.056，P<0.05)，見圖2D。表明RIF組患者血漿外泌體能夠抑制HESC細胞蛻膜化過程。

2.4 miR-183-5p在RIF患者血漿外泌體、內膜組織中高表達

經qRT-PCR驗證，與對照組比較，RIF患者血漿外泌體miR-183-5p表達升高(t=-2.486，P<0.05)，見圖3A。為了排除細胞內源性miRNA對miR-183-5p表達水平的影響，將HESC細胞用RNA聚合酶Ⅱ的抑制劑α-Amanitin預處理后與外泌體共培養(yǎng)24h，通過qRT-PCR檢測細胞內miR-183-5p的表達水平。與對照組比較，HESC細胞與RIF患者血漿外泌體共培養(yǎng)后miR-183-5p表達水平升高(t=-2.378，P<0.05)，見圖3B。與對照組比較，RIF組患者子宮內膜組織miR-183-5p表達水平升高(t=-4.821，P<0.05)，見圖3C。

注：A.TEM觀察外泌體的形態(tài)；B.NTA分析外泌體直徑；C.Western Blot實驗檢測外泌體特征性膜蛋白TSG101、CD9、CD81與陰性對照Calnexin。

注：A.qRT-PCR檢測HESC細胞蛻膜化誘導后IGFBP-1、PRL表達水平(n=3)；B.光鏡下觀察HESC細胞蛻膜化誘導前后變化；C.免疫熒光觀察HESC細胞對血漿外泌體的攝取，DAPI(藍色熒光)為細胞核，F(xiàn)-actin(綠色熒光)為細胞骨架蛋白，PKH26(紅色熒光)為血漿外泌體；D.外泌體與HESC細胞共培養(yǎng)24h后進行蛻膜化誘導72h，qRT-PCR檢測IGFBP-1和PRL mRNA表達水平(n=5)。*P<0.05，***P<0.001。

注：A.qRT-PCR檢測RIF患者與對照組血漿外泌體miR-183-5p表達水平(n=20)；B.qRT-PCR檢測血漿外泌體與HESC細胞共培養(yǎng)24h后miR-183-5p表達水平(n=5)；C.qRT-PCR檢測RIF患者與對照組內膜組織中miR-183-5p表達水平(n=5)。*P<0.05，***P<0.001。

2.5 過表達miR-183-5p的HESC細胞蛻膜化受到抑制

將miR-183-5p的激動劑、拮抗劑及作為對照的無義序列轉染HESC細胞，在48h后通過qRT-PCR檢測細胞內miR-183-5p的表達情況。與轉染了無義序列的對照組比較，轉染了agomir后miR-183-5p表達水平顯著升高(t=-12.310，P<0.05)，轉染了antagomir后miR-183-5p表達水平下降(t=6.169，P<0.05)，見圖4A，表明轉染成功。在HESC過表達miR-183-5p后，對其誘導體外蛻膜化，通過qRT-PCR檢測IGFBP-1、PRL，結果顯示與對照組比較，IGFBP-1、PRL的表達水平下降(t值分別為7.510、8.115，P<0.05)，見圖4B。

注：A.qRT-PCR檢測轉染miR-183-5p的agomir、antagomir 和無義序列48h后miR-183-5p表達水平(n=3)；B.qRT-PCR檢測轉染miR-183-5p的agomir、antagomir和無義序列48h后并誘導蛻膜化后IGFBP-1、PRL mRNA表達水平(n=3)。**P<0.01，***P<0.001。

2.6 miR-183-5p通過靶向FOXO1抑制HESC細胞的蛻膜化

在Targetscan、Starbase和miRDB數(shù)據(jù)庫中檢索hsa-miR-183-5p的靶基因，通過Venn圖取交集，交集內共有244個靶基因,見圖5A。通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對交集靶基因進行KEGG富集分析，從而分析miR-183-5p影響HESC細胞哪些信號通路,見圖5B。根據(jù)富集倍數(shù)、基因數(shù)及顯著性，選取了多巴胺能突觸、心肌腎上腺素能信號通路、長壽調控通路及AMPK信號通路進行下一步研究。將miR-183-5p的agomir轉染進HESC細胞48h后進行蛻膜化誘導，72h后檢測FOXO1的mRNA和蛋白質表達水平，結果顯示均發(fā)生了下降(t值分別為3.120、2.793,P<0.05)，見圖5C、圖5D。

注：A.Venn圖顯示Targetscan、Starbase和miRDB網(wǎng)站的預測靶基因交集；B.KEGG富集分析；C.qRT-PCR檢測轉染miR-183-5p的agomir、antagomir 和無義序列并誘導蛻膜化后FOXO1 mRNA表達水平(n=3)；D.Western Blot實驗檢測miR-183-5p的agomir、antagomir 和無義序列并誘導蛻膜化后FOXO1的蛋白表達水平(n=3)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 討論

3.1 子宮內膜容受性與RIF的關系

RIF病因往往高度異質，目前已知病因包括胚胎核型異常、子宮內膜容受性異常、母胎界面免疫紊亂等。子宮內膜容受性是指子宮內膜對胚胎的接受能力，即允許胚胎在子宮內進行定位、黏附、侵入等過程的能力[11]。子宮內膜只有在特定的時間點才具有良好的容受性，目前普遍認為在排卵后第6～10天。子宮內膜容受性的提高與基質細胞蛻膜化、上皮細胞黏附、內膜基質血管重塑等一系列復雜的生理過程密切相關[12]。約2/3的胚胎種植失敗是由于子宮內膜容受性受損造成的，是導致輔助生殖治療失敗的最大因素[13]。研究發(fā)現(xiàn)RIF患者的子宮內膜容受性下降，其中子宮內膜基質細胞蛻膜化異常是影響子宮內膜容受性正常建立的關鍵因素[14]。RIF患者的子宮內膜組織中蛻膜化標志物IGFBP-1和PRL的mRNA和蛋白水平均發(fā)生下降，內膜基質細胞的增殖能力和蛻膜化水平發(fā)生下降[15]。有研究將RIF患者的內膜基質細胞進行體外分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其分泌PRL的能力下降。此外，RIF患者的內膜基質細胞不僅蛻膜化能力受損，其分泌的外泌體能夠抑制滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲能力[16]。因此，內膜基質細胞的蛻膜化受損可能是RIF發(fā)生的潛在因素。

3.2 外泌體miRNA與子宮內膜容受性

多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與子宮內膜容受性的建立和胚胎植入過程[17-19]，對miRNA參與RIF發(fā)病機制有了新的見解。研究發(fā)現(xiàn)RIF患者與成功妊娠婦女相比，多種外周血miRNA表達水平發(fā)生改變[8]。miRNA家族中l(wèi)et-7、miR-30、miR-200、miR-17-92等多種miRNA被認為能夠參與子宮內膜容受性的調節(jié)[20]。研究證實，子宮內膜細胞和胚胎能夠分泌細胞外囊泡參與圍著床期子宮內膜-胚胎之間的相互作用[21]。這些細胞外囊泡能夠通過其運載的miRNA參與細胞間的生物學調控，影響胚胎種植窗的開放[22]。

3.3 外泌體源miR-183-5p通過靶向FOXO1抑制子宮內膜基質細胞蛻膜化

本研究選取了8-bromo-cAMP結合MPA對HESCs進行體外誘導作為蛻膜化模型，通過檢測蛻膜化標志物IGFBP-1、PRL基因的表達情況及F-actin的表達分布反映HESC細胞的蛻膜化程度。本研究發(fā)現(xiàn)RIF患者血漿外泌體能夠抑制HESC細胞的蛻膜化過程，結合前期的測序結果發(fā)現(xiàn)RIF患者血漿外泌體中高表達miR-183-5p。為了進一步探究血漿外泌體中的miR-183-5p能否進入細胞發(fā)揮作用，通過免疫熒光實驗確認了外泌體被細胞攝取。此外，為了確認HESC細胞與RIF患者血漿外泌體共培養(yǎng)后miR-183-5p水平的升高是否與外泌體有關，我們用RNA聚合Ⅱ的抑制劑α-Amanitin預處理HESC細胞，抑制其內源性miRNA的產生以排除干擾。miRNA能夠通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)結合抑制靶基因的翻譯，能夠發(fā)揮轉錄后調控的作用[23]。為了探究miR-183-5p是通過何種途徑影響HESC細胞的蛻膜化過程，結合數(shù)據(jù)庫對其靶基因進行了預測。通過對交集靶基因的KEGG分析，探究miR-183-5p對HESC細胞生物學過程的影響。有研究報道，AMPK信號通路在子宮內膜蛻膜化過程中發(fā)揮重要作用[24]。富集到AMPK信號通路的基因有PPP2CA、PPP2CB、IRS1、TSC1、PPP2R2A、PPP2R5C、EEF2和FOXO1。既往文獻報道FOXO1、HOXA10、STAT3等基因在子宮內膜蛻膜化和胚胎種植過程中發(fā)揮了重要作用[25]，因此我們篩選出FOXO1進行進一步的探究。將經過特殊化學修飾的miR-183-5p激動劑agomir和拮抗劑antagomir轉染HESC細胞，通過qRT-PCR和Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)miR-183-5p激動劑能夠使HESC細胞的FOXO1表達下降。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了血漿外泌體miR-183-5p能夠影響子宮內膜基質細胞的蛻膜化，證實了miR-183-5p通過靶向FOXO1使子宮內膜基質細胞蛻膜化受損，為RIF的診療提供了新的實驗和理論依據(jù)。