方 翌,郭旭鴻,魏麗慧,朱 潔,沈阿靈,林久茂
(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心,福建 福州 350122;2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院&中西醫(yī)結(jié)合研究院臨床研究所,福建 福州 350122;3. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室,福建 福州 350122;4. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州350122;5. 福建中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)技術(shù)處,福建 福州 350122;6. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州 350122;7. 福建省高校中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)重點實驗室,福建 福州 350122)
結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性疾病,在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和致死率分別排第三和第二[1]。結(jié)腸癌患者常伴隨著臟腑、組織、機體等方面的嚴重損傷,若在患病早期進行科學(xué)、有效地治療,能在一定程度上提高患者的生存率[2]。近年來,隨著惡性腫瘤的治療理念發(fā)生變化,中藥對癌癥的防治效果日益明顯,尤其是對癌癥的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有較大的抑制作用,87%的腫瘤患者采用了中西醫(yī)結(jié)合的治療方案[3]。八寶丹(BBD)是我國傳統(tǒng)中醫(yī)方劑之一,其主要成分包括麝香、三七、蛇膽、牛黃、珍珠、羚羊角,具有清熱涼血、清肝解毒、消腫止痛的功效。研究顯示,八寶丹具有術(shù)后輔助腫瘤治療的作用[4],其抗腫瘤機制主要通過抑制腫瘤細胞生長[5]、調(diào)控腫瘤細胞周期[6]、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[7]等方面發(fā)揮作用。然而其在抗結(jié)腸癌的基礎(chǔ)研究還尚少。因此,本課題通過體外實驗,探究八寶丹對結(jié)腸癌細胞生長的影響,以期為結(jié)腸癌的防治進一步提供重要的實驗依據(jù)。
1.1 實驗細胞與藥物 人結(jié)腸癌細胞HCT116,購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心,保存于液氮罐中。八寶丹購自廈門中藥廠(批號:180901)。
1.2 實驗試劑 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa 公司);Trizol、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix、RNase Staining Solution(美國Thermo Fisher Scientific 公司);細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)一抗和兔二抗(美國CST 公司,批號:E3P5S、D9G3E)Super ECL Star 特超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);McCoy” s 5A 不完全培養(yǎng)液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。
1.3 實驗儀器 CFX96 touch(美國Bio-Rad 公司);Countstar tigel 53 自動細胞計數(shù)儀(中國睿鈺生物科技有限公司);倒置顯微鏡(德國Leica 公司);Multiskan FC 多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);流式細胞儀Facscelesta(美國BD 公司)。
2.1 八寶丹藥液配制 將BBD 藥粒碾成粉末,溶解于PBS 溶液,配制成濃度為25 mg/mL 的母液,30 min 超聲溶解,高壓滅菌后分裝于1.5 mL 的EP管,存于4 ℃冰箱備用。
2.2 分組及干預(yù) 用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的McCoy” s 5A不完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,實驗設(shè)置4個分組(0 mg/mL組、0.5 mg/mL組、1 mg/mL組、2 mg/mL 組),按1×105個/mL 濃度分別接種于96 孔板和6 孔板中,貼壁過夜后以不同濃度BBD(0、0.5、1、2 mg/mL)干預(yù)24 h。
2.3 MTT 實驗 待測細胞每孔加入100 μL 的1×MTT(9 mL PBS+1 mL MTT 溶液),培養(yǎng)箱中孵育4 h后去原液,加入100 μL DMSO,振蕩2 min 后于450 nm 波長 處測定OD 值。
2.4 集落形成實驗 將BBD 干預(yù)后的細胞用胰酶消化,按500 個/孔濃度轉(zhuǎn)接于12 孔板中,各組均設(shè)3 個重復(fù)。每隔2 d 換液,培養(yǎng)1 周后,PBS 清洗2 次后晾干,多聚甲醛固定15 min 后清洗晾干,結(jié)晶紫染色15 min 后清洗、拍照并計數(shù)。
2.5 周期實驗 將BBD 干預(yù)后細胞消化,輕柔吹打細胞,使細胞成單個懸浮狀態(tài)而不成團。細胞離心去上清,PBS 清洗2 次后以預(yù)冷的70%乙醇溶液重懸細胞,4 ℃固定過夜。再以PBS 清洗2 次后,RNase Staining Solution 染色30 min 后流式細胞儀上機檢測。
2.6 Q-PCR 法 將BBD 干預(yù)后細胞以Trizol 法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,八聯(lián)管中制備Q-PCR反應(yīng)體系,CFX touch 檢測CT 值,并采用2-ΔΔCt法計算其表達水平的變化倍數(shù)。
2.7 Western Blot 法 收集細胞,加入適量RIPA裂解液提取總蛋白,蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度,計算上樣量。蛋白在100 ℃的金屬浴中變性10 min,經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉1 h后一抗(4 ℃過夜)、二抗孵育、顯影并進行灰度值分析。
2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 4 組細胞形態(tài)及存活率比較 不同濃度BBD(0、0.5、1、2 mg/mL)干預(yù)HCT116 細胞24 h 后,顯微下觀察發(fā)現(xiàn),細胞密度隨著BBD 濃度的增加而逐漸下降。臺盼藍染色計數(shù)法結(jié)果顯示,經(jīng)BBD 干預(yù)后,細胞存活率顯著下降(P<0.01)。見圖1。
圖1 4 組細胞形態(tài)及存活率比較(×100)
3.2 4 組細胞活力比較 與0 mg/mL 組比較,BBD(0.5、1、2 mg/mL)干預(yù)HCT116細胞24 h后,HCT116細胞的細胞活力顯著下降(P<0.01),見圖2。
圖2 4 組細胞活力比較
3.3 4組細胞集落形成情況比較 與0 mg/mL 組比較,BBD(0.5、1、2 mg/mL)干預(yù)后的HCT116 細胞集落形成數(shù)量顯著減少(P<0.05),以2 mg/mL 的BBD對集落形成數(shù)量的抑制作用最強(P<0.01),見圖3。
3.4 4 組細胞周期情況比較 與0 mg/mL 組比較,BBD(0.5、1、2 mg/mL)干預(yù)HCT116 細胞24 h 后,HCT116 細胞G0/G1 期比例顯著增加(P<0.05),1 mg/mL 組周期抑制作用增強(P<0.01),S 期比例顯著下降(P<0.05),見圖4,表明BBD 阻遏細胞周期于G0/G1 期。
3.5 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 基因水平比較 與0 mg/mL 組比較,2 mg/mL 組CDK4、Cyclin D1 的基因水平明顯被抑制(P<0.05,P<0.01),見圖5,提示高濃度的BBD 顯著抑制CDK4 及Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄表達水平。
3.6 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 蛋白表達比較 與0 mg/mL 組比較,2 mg/mL 組CDK4、Cyclin D1 的蛋白相對表達量明顯下降(P<0.05,P<0.01),見圖6,提示高濃度的BBD 顯著抑制CDK4 及Cyclin D1 的蛋白表達。
圖3 4 組細胞集落形成情況比較
圖4 BBD 對結(jié)腸癌細胞周期分布的影響
圖5 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 基因水平比較
結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,常用治療手段為手術(shù)切除病理部位并輔以放療、化療,其臨床表現(xiàn)多為腹部不適,出現(xiàn)腹部腫塊,且伴隨消瘦、無力等全身癥狀[8]。中醫(yī)學(xué)認為結(jié)腸癌與“癌毒”入侵、“正氣”衰弱密切相關(guān),多數(shù)結(jié)腸癌患者伴隨氣滯、痰濕、血瘀、熱毒[9],而中藥則可以通過直接提升“正氣”來祛除病邪,或通過補脾、補腎、補益氣血、清熱解毒等方式間接抵抗毒邪侵襲,用于癌癥治療具有良好的增效減毒功能[10]。BBD 主藥麝香、三七、牛黃均具有一定的抗腫瘤作用[11-13],諸藥合用具有顯著的活血止痛、清熱解毒的功效,具有抗炎、抗腫瘤的作用,在臨床上常用于免疫性疾病、血液病、中醫(yī)濕熱毒瘀證等方面的治療[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)BBD 能通過調(diào)控細胞周期抑制腫瘤細胞生長[14],提示BBD 可能通過阻礙細胞周期進程來抑制結(jié)腸癌細胞生長。
細胞周期調(diào)控細胞生長的全過程,其正常運行是保證細胞正常生長繁殖的必要條件。若其調(diào)控機制紊亂,細胞異常增殖,最終會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究采用流式細胞技術(shù)檢測BBD 對結(jié)腸癌細胞周期的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBD 能阻滯結(jié)腸癌細胞于G0/G1 階段,提示其能通過抑制細胞周期來抑制結(jié)腸癌細胞的過度增殖。
圖6 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 蛋白表達比較
在細胞周期進程中,細胞周期蛋白(Cyclin)常與細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)結(jié)合成復(fù)合物,從而調(diào)控細胞周期。CDK4 是CDK 家族的一員,已被確認是一種與良惡性腫瘤疾病相關(guān)的癌基因,在多種腫瘤細胞中異常表達,能為早期診斷腫瘤提供可能[15]。Cyclin 家族中Cyclin D 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為緊密,Cyclin D1 在其中具有重要的地位,其表達下調(diào)可縮短G1 期,阻礙細胞生長進程,相反其高表達具有推進癌細胞進展的作用[16]。Cyclin D1在細胞G1 階段的早期表達增強,它能與CDK4 結(jié)合,并通過Cyclin/CDK4 途徑跨越G1 調(diào)節(jié)點,是G1至S 期的主要調(diào)節(jié)因子[17]。在細胞周期中,G1/S期為細胞內(nèi)外信號在細胞核中聚集的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點,具有調(diào)控細胞增殖的作用,故其調(diào)控機制紊亂可誘發(fā)癌癥[18]。據(jù)報道,CDK4 和Cyclin D1 的過表達是結(jié)腸癌的特征之一[18],本研究結(jié)果顯示,BBD 抑制Cyclin D1 和CDK4 的基因水平和蛋白表達,阻遏細胞于GO/G1 期,提示了BBD 可能通過調(diào)控Cyclin D1/CDK4 抑制結(jié)腸癌細胞生長。