方 翌，郭旭鴻，魏麗慧，朱 潔，沈阿靈，林久茂

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院&中西醫(yī)結(jié)合研究院臨床研究所，福建 福州 350122；3. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；4. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；5. 福建中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)技術(shù)處，福建 福州 350122；6. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；7. 福建省高校中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)重點實驗室，福建 福州 350122）

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性疾病，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和致死率分別排第三和第二［1］。結(jié)腸癌患者常伴隨著臟腑、組織、機體等方面的嚴重損傷，若在患病早期進行科學(xué)、有效地治療，能在一定程度上提高患者的生存率［2］。近年來，隨著惡性腫瘤的治療理念發(fā)生變化，中藥對癌癥的防治效果日益明顯，尤其是對癌癥的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有較大的抑制作用，87%的腫瘤患者采用了中西醫(yī)結(jié)合的治療方案［3］。八寶丹（BBD）是我國傳統(tǒng)中醫(yī)方劑之一，其主要成分包括麝香、三七、蛇膽、牛黃、珍珠、羚羊角，具有清熱涼血、清肝解毒、消腫止痛的功效。研究顯示，八寶丹具有術(shù)后輔助腫瘤治療的作用［4］，其抗腫瘤機制主要通過抑制腫瘤細胞生長［5］、調(diào)控腫瘤細胞周期［6］、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［7］等方面發(fā)揮作用。然而其在抗結(jié)腸癌的基礎(chǔ)研究還尚少。因此，本課題通過體外實驗，探究八寶丹對結(jié)腸癌細胞生長的影響，以期為結(jié)腸癌的防治進一步提供重要的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞與藥物 人結(jié)腸癌細胞HCT116，購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心，保存于液氮罐中。八寶丹購自廈門中藥廠（批號：180901）。

1.2 實驗試劑 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa 公司）；Trizol、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix、RNase Staining Solution（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴激酶4（CDK4）一抗和兔二抗（美國CST 公司，批號：E3P5S、D9G3E）Super ECL Star 特超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；McCoy” s 5A 不完全培養(yǎng)液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 實驗儀器 CFX96 touch（美國Bio-Rad 公司）；Countstar tigel 53 自動細胞計數(shù)儀（中國睿鈺生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；Multiskan FC 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；流式細胞儀Facscelesta（美國BD 公司）。

2 實驗方法

2.1 八寶丹藥液配制 將BBD 藥粒碾成粉末，溶解于PBS 溶液，配制成濃度為25 mg/mL 的母液，30 min 超聲溶解，高壓滅菌后分裝于1.5 mL 的EP管，存于4 ℃冰箱備用。

2.2 分組及干預(yù) 用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的McCoy” s 5A不完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，實驗設(shè)置4個分組（0 mg/mL組、0.5 mg/mL組、1 mg/mL組、2 mg/mL 組），按1×105個/mL 濃度分別接種于96 孔板和6 孔板中，貼壁過夜后以不同濃度BBD（0、0.5、1、2 mg/mL）干預(yù)24 h。

2.3 MTT 實驗 待測細胞每孔加入100 μL 的1×MTT（9 mL PBS+1 mL MTT 溶液），培養(yǎng)箱中孵育4 h后去原液，加入100 μL DMSO，振蕩2 min 后于450 nm 波長 處測定OD 值。

2.4 集落形成實驗 將BBD 干預(yù)后的細胞用胰酶消化，按500 個/孔濃度轉(zhuǎn)接于12 孔板中，各組均設(shè)3 個重復(fù)。每隔2 d 換液，培養(yǎng)1 周后，PBS 清洗2 次后晾干，多聚甲醛固定15 min 后清洗晾干，結(jié)晶紫染色15 min 后清洗、拍照并計數(shù)。

2.5 周期實驗 將BBD 干預(yù)后細胞消化，輕柔吹打細胞，使細胞成單個懸浮狀態(tài)而不成團。細胞離心去上清，PBS 清洗2 次后以預(yù)冷的70%乙醇溶液重懸細胞，4 ℃固定過夜。再以PBS 清洗2 次后，RNase Staining Solution 染色30 min 后流式細胞儀上機檢測。

2.6 Q-PCR 法 將BBD 干預(yù)后細胞以Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，八聯(lián)管中制備Q-PCR反應(yīng)體系，CFX touch 檢測CT 值，并采用2-ΔΔCt法計算其表達水平的變化倍數(shù)。

2.7 Western Blot 法 收集細胞，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度，計算上樣量。蛋白在100 ℃的金屬浴中變性10 min，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉1 h后一抗（4 ℃過夜）、二抗孵育、顯影并進行灰度值分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組細胞形態(tài)及存活率比較 不同濃度BBD（0、0.5、1、2 mg/mL）干預(yù)HCT116 細胞24 h 后，顯微下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞密度隨著BBD 濃度的增加而逐漸下降。臺盼藍染色計數(shù)法結(jié)果顯示，經(jīng)BBD 干預(yù)后，細胞存活率顯著下降（P＜0.01）。見圖1。

圖1 4 組細胞形態(tài)及存活率比較（×100）

3.2 4 組細胞活力比較 與0 mg/mL 組比較，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干預(yù)HCT116細胞24 h后，HCT116細胞的細胞活力顯著下降（P＜0.01），見圖2。

圖2 4 組細胞活力比較

3.3 4組細胞集落形成情況比較 與0 mg/mL 組比較，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干預(yù)后的HCT116 細胞集落形成數(shù)量顯著減少（P＜0.05），以2 mg/mL 的BBD對集落形成數(shù)量的抑制作用最強（P＜0.01），見圖3。

3.4 4 組細胞周期情況比較 與0 mg/mL 組比較，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干預(yù)HCT116 細胞24 h 后，HCT116 細胞G0/G1 期比例顯著增加（P＜0.05），1 mg/mL 組周期抑制作用增強（P＜0.01），S 期比例顯著下降（P＜0.05），見圖4，表明BBD 阻遏細胞周期于G0/G1 期。

3.5 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 基因水平比較 與0 mg/mL 組比較，2 mg/mL 組CDK4、Cyclin D1 的基因水平明顯被抑制（P＜0.05，P＜0.01），見圖5，提示高濃度的BBD 顯著抑制CDK4 及Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄表達水平。

3.6 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 蛋白表達比較 與0 mg/mL 組比較，2 mg/mL 組CDK4、Cyclin D1 的蛋白相對表達量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），見圖6，提示高濃度的BBD 顯著抑制CDK4 及Cyclin D1 的蛋白表達。

圖3 4 組細胞集落形成情況比較

圖4 BBD 對結(jié)腸癌細胞周期分布的影響

圖5 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 基因水平比較

4 討 論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，常用治療手段為手術(shù)切除病理部位并輔以放療、化療，其臨床表現(xiàn)多為腹部不適，出現(xiàn)腹部腫塊，且伴隨消瘦、無力等全身癥狀［8］。中醫(yī)學(xué)認為結(jié)腸癌與“癌毒”入侵、“正氣”衰弱密切相關(guān)，多數(shù)結(jié)腸癌患者伴隨氣滯、痰濕、血瘀、熱毒［9］，而中藥則可以通過直接提升“正氣”來祛除病邪，或通過補脾、補腎、補益氣血、清熱解毒等方式間接抵抗毒邪侵襲，用于癌癥治療具有良好的增效減毒功能［10］。BBD 主藥麝香、三七、牛黃均具有一定的抗腫瘤作用［11-13］，諸藥合用具有顯著的活血止痛、清熱解毒的功效，具有抗炎、抗腫瘤的作用，在臨床上常用于免疫性疾病、血液病、中醫(yī)濕熱毒瘀證等方面的治療［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)BBD 能通過調(diào)控細胞周期抑制腫瘤細胞生長［14］，提示BBD 可能通過阻礙細胞周期進程來抑制結(jié)腸癌細胞生長。

細胞周期調(diào)控細胞生長的全過程，其正常運行是保證細胞正常生長繁殖的必要條件。若其調(diào)控機制紊亂，細胞異常增殖，最終會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究采用流式細胞技術(shù)檢測BBD 對結(jié)腸癌細胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBD 能阻滯結(jié)腸癌細胞于G0/G1 階段，提示其能通過抑制細胞周期來抑制結(jié)腸癌細胞的過度增殖。

圖6 4 組細胞CDK4 和Cyclin D1 蛋白表達比較

在細胞周期進程中，細胞周期蛋白（Cyclin）常與細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）結(jié)合成復(fù)合物，從而調(diào)控細胞周期。CDK4 是CDK 家族的一員，已被確認是一種與良惡性腫瘤疾病相關(guān)的癌基因，在多種腫瘤細胞中異常表達，能為早期診斷腫瘤提供可能［15］。Cyclin 家族中Cyclin D 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為緊密，Cyclin D1 在其中具有重要的地位，其表達下調(diào)可縮短G1 期，阻礙細胞生長進程，相反其高表達具有推進癌細胞進展的作用［16］。Cyclin D1在細胞G1 階段的早期表達增強，它能與CDK4 結(jié)合，并通過Cyclin/CDK4 途徑跨越G1 調(diào)節(jié)點，是G1至S 期的主要調(diào)節(jié)因子［17］。在細胞周期中，G1/S期為細胞內(nèi)外信號在細胞核中聚集的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點，具有調(diào)控細胞增殖的作用，故其調(diào)控機制紊亂可誘發(fā)癌癥［18］。據(jù)報道，CDK4 和Cyclin D1 的過表達是結(jié)腸癌的特征之一［18］，本研究結(jié)果顯示，BBD 抑制Cyclin D1 和CDK4 的基因水平和蛋白表達，阻遏細胞于GO/G1 期，提示了BBD 可能通過調(diào)控Cyclin D1/CDK4 抑制結(jié)腸癌細胞生長。