胡可舒，劉文鳳，張 鋒，權 冰，殷 欣

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032

中國是當今世界上肝癌發(fā)病人數(shù)最多的國家，其中絕大多數(shù)的病理學類型為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1］。本課題組前期的回顧性臨床研究［2］發(fā)現(xiàn)，近半數(shù)中晚期HCC患者在接受反復的肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）治療后，表現(xiàn)為化療耐藥和介入治療抵抗，嚴重影響此類患者的預后，但其中的具體機制仍不清楚。奧沙利鉑是目前HCC患者使用較廣泛的化療藥物之一［3］，本研究旨在探索HCC發(fā)生奧沙利鉑耐藥的分子機制，為HCC的臨床治療決策提供新的理論依據(jù)和治療靶點。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度不少于200個核苷酸且不具有編碼蛋白質功能的一類基因轉錄RNA產(chǎn)物［4］。近年來，lncRNA在包括HCC在內的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用被逐漸揭示。本課題組于2017年在奧沙利鉑耐藥HCC細胞系中鑒定到了表達顯著上調的LINC00601基因［5］。后期多項研究發(fā)現(xiàn)，LINC00601在食管癌［6］和高惡性程度的膠質瘤［7］中表達上調，且與腫瘤患者預后不良相關。2020年，Wang等［8］研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織，LINC00601在HCC組織中表達顯著上調，并且LINC00601通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉導通路促進HCC的發(fā)展。盡管LINC00601在HCC奧沙利鉑耐藥細胞中高表達，但其誘導奧沙利鉑耐藥的機制仍不明確。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人HCC細胞株MHCC-97H（97H）細胞由復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所建立和儲存，人HCC細胞株Hep-3B（3B）細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。97H細胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)基和3B細胞培養(yǎng)所需的MEM培養(yǎng)基均購自浙江吉諾賽百爾生物科技有限公司，胎牛血清購自上海博升生物科技有限公司，奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）試劑盒購自蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司，PCR相關引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，LINC00601過表達慢病毒、靶向LINC00601的小干擾RNA及Cy3熒光標記的探針購自吉滿生物科技（上海）有限公司，轉染試劑LipofectamineTM3000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（prodium iodide，PI）凋亡染色試劑盒購自美國BD Bioscience公司，兔抗人Cleaved-caspase-3抗體（Cat.ab32042）、兔抗人GADD45A抗體（Cat.ab180768）、羊抗兔二抗（Cat.ab205718）、羊抗兔AF555熒光二抗（Cat.ab150078）均購自英國Abcam公司，鼠抗人β-actin抗體（Cat.AA128）、鼠抗人Histone3抗體（Cat.AF0009）、細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司，羊抗鼠二抗（Cat.ARG65350）購自中國臺灣省Arigo公司。RNA pull-down實驗及RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）實驗試劑盒均購自廣西艾西龍生物科技有限責任公司。

PCR儀及反轉錄儀、酶標儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國BD Bioscience公司，化學發(fā)光成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

97H細胞系使用添加10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基，3B細胞系使用添加10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的MEM培養(yǎng)基，均在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，細胞密度達到90%以上后1∶2至1∶3傳代。

1.3 奧沙利鉑耐藥細胞株的建立

向HCC細胞的培養(yǎng)體系中添加終濃度為1 μmol/L的奧沙利鉑進行同上所述的細胞培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)、傳代2個月后檢測細胞對奧沙利鉑的半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）較普通培養(yǎng)的HCC細胞明顯升高，提示成功誘導建立奧沙利鉑繼發(fā)耐藥細胞株97H-OXR和3B-OXR。

1.4 CCK-8實驗

將細胞以5 000個/孔的密度接種到96孔板中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中放置過夜待其貼壁，第2天向每孔中加入奧沙利鉑溶液使孔中奧沙利鉑終濃度分別為0、1、2、3、5、10、15、20、30和40 μmol/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將上清液替換為1∶10配置的CCK-8試劑∶完全培養(yǎng)基混合溶液110 μL，在培養(yǎng)箱中放置2 h后用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度（D），繪制IC50曲線。實驗重復3次。

1.5 RTFQ-PCR實驗

按照RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及PCR試劑盒中的說明提取細胞總RNA、反轉錄cDNA并進行RTFQ-PCR檢測。PCR條件為：熱啟動酶活化95℃ 5 min；PCR擴增95℃ 10 s，60℃ 30 s共40個循環(huán)；溶解曲線檢測95℃ 15 s，60℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60℃ 15 s。β-actin上游引物序列為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；LINC00601上游引物序列為5’-AAACCTTAATTGCCAATGTGA-3’，下游引物序列為5’-GCACCTCTTTTGTAAGGAC-3’。實驗重復3次。

1.6 細胞轉染

將細胞以4×105個/孔的密度接種于6孔板中，當細胞生長至30%～ 40%密度時開始轉染。吸去孔中培養(yǎng)基，無菌1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2次，向每孔培養(yǎng)基中加入聚凝胺1 μL以增加病毒轉染效率。加入過表達LINC00601基因的慢病毒懸液使每孔中病毒的感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為10，混勻后將板置入培養(yǎng)箱中轉染48 h。48 h后更換新鮮培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入10 μmol/L終濃度嘌呤霉素，混勻后放入培養(yǎng)箱48 h篩選過表達LINC00601的穩(wěn)定株97H-LNC和3B-LNC。小干擾RNA的轉染準備同上，按6孔板每孔2 mL體系分兩Eppendorf試管配制轉染體系如下：Opti-MEM培養(yǎng)液125 μL+LipofectamineTM3000 7.5 μL，Opti-MEM培養(yǎng)液125 μL+LINC00601 siRNA（20 μmol/L）10 μL，兩管混勻后室溫靜置15～ 30 min后加入孔中，搖勻后放入培養(yǎng)箱中轉染48 h。

于給藥后7 d采用改良Garcia法[19]對大鼠進行神經(jīng)功能學評分，包括自主運動（0～3分）、鼠籠攀援（1～3分）、前肢對稱性（0～3分）、活動對稱性（0～3分）、觸摸觸須反應（1～3分）、觸摸雙側軀干反應（1～3分）等6項，總分為18分，分數(shù)越低表明神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.7 流式細胞術

使用無乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶溶液消化細胞，1 000 r/min離心5 min收集細胞。棄上清液后使用預冷的PBS洗滌細胞，按試劑盒說明使用Annexin Ⅴ-FITC和PI對細胞進行染色，室溫避光溫育15 min，染色結束后上機檢測。實驗重復3次。

1.8 蛋白質印跡法（Western blot）

使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白或按細胞核蛋白和細胞質蛋白抽提試劑盒說明分別抽提細胞核蛋白和細胞質蛋白，使用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度定量。按照說明書配制10%的分離膠和濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），80 V電泳1 h、120 V至電泳結束，濕轉法300 mA轉膜1 h，取出膜后使用快速封閉液室溫封閉15 min。將一抗按照說明書比例稀釋后與膜4 ℃溫育過夜，第2天用含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3次，每次 10 min；二抗按照說明書比例稀釋后室溫溫育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，然后使用電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑盒及化學發(fā)光成像儀成像。實驗重復3次。

1.9 細胞免疫熒光

細胞以5×104個/孔的密度接種于12孔板中，待細胞貼壁后使用4%多聚甲醛溶液固定并用破膜液破膜，使用稀釋后的一抗或Cy3熒光標記的LINC00601探針4 ℃溫育過夜，第2天用含吐溫-20磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline with Tween-20，PBST）洗3次，每次5 min，如使用一抗則使用AF555熒光標記的對應二抗室溫避光溫育1 h后再用PBST洗3次，每次5 min。每孔加入200 μL DAPI染色液室溫避光染色10 min，PBST洗3次后加入200 μL PBS，在熒光顯微鏡下觀察成像。實驗重復3次。

1.10 RNA pull-down實驗

取30 μL生物素標記的RNA探針及空白對照探針置于90 ℃中水浴2 min，后轉移冰浴2 min。加入50 μL預冷的RNA結構緩沖液和20 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，室溫靜置20 min。取40 μL磁珠，1 mL TES洗滌后，在磁珠中加入RNA探針和100 μL 2×TES，25 ℃旋轉溫育30 min，置于磁力架上去除上清液，然后加入500 μL TES洗滌磁珠。制備蛋白樣品后，取100 μL作input，然后在蛋白樣品中加入10 μL DNase，5 μL DNase salt stock，室溫溫育1 h。加入40 μL瓊脂糖微球，4 ℃旋轉溫育30 min；4 000×g離心×1 min，取上清液分至兩個Eppendorf試管中。分別將磁珠探針與蛋白樣品混合，加入0.5 mL RIP緩沖液、5 μL RNase抑制劑、5 μL EDTA、2.5 μL乙二醇雙2-氨基乙醚四乙酸（ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid，EGTA）和5 μL poly (dI-dC)，室溫旋轉2 h。去除上清液后按說明書配制洗滌液，4 ℃洗滌4次，去上清液；加入30 μL Urea CHAPS緩沖液及0.3 μL二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），37 ℃溫育洗脫2 h后在磁力架上收集上清液。產(chǎn)物用于后續(xù)實驗。

1.11 RIP實驗

消化收集細胞后按說明書配制裂解液1和2，裂解后在4 ℃下以16 000×g離心10 min，轉移上清液至無酶Eppendorf試管中。按每樣品準備 28 μL蛋白A/G磁珠，洗滌磁珠2次。加入初始體積的裂解液3，將按上述方法制得的裂解液分為IP組、IgG組和Input組，加入實驗抗體或IgG陰性對照抗體和磁珠，4 ℃垂直混勻4 h后收集磁珠。

配制洗滌液1和2，4 ℃洗滌5 min，收集磁珠。加入洗脫液重懸，55 ℃溫育30 min洗脫RNA，收集上清液。提取RNA并按1.5中的方法行RNA的反轉錄及PCR。制取瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產(chǎn)物，加入2 μL 6×上樣染料和5 μL DL500 DNA標記物，80 V電泳40 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.12 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計、繪圖。樣本間的假設檢驗采用t檢驗，多樣本間的兩兩比較采用Bonferroni校正，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 奧沙利鉑耐藥細胞株對奧沙利鉑的敏感性顯著降低

對所建立的奧沙利鉑繼發(fā)耐藥HCC細胞株97H-OXR和3B-OXR進行了CCK-8實驗的驗證，結果顯示，經(jīng)不同濃度的奧沙利鉑體外處理48 h后，奧沙利鉑耐藥細胞較對照細胞的增殖活性顯著提高，其IC50顯著高于對照細胞（圖1），提示此法誘導建立的奧沙利鉑繼發(fā)耐藥細胞株成功。進一步通過RTFQ-PCR實驗也再次證實了97H-OXR和3B-OXR細胞中LINC00601 mRNA的表達水平較97H和3B細胞顯著提高（圖1）。

圖1 奧沙利鉑耐藥細胞株97H-OXR和3B-OXR LINC00601的表達變化Fig.1 Oxaliplatin resistant cell line 97H-OXR and 3B-OXR,and the change of the LINC00601 expression

2.2 LINC00601表達對HCC細胞奧沙利鉑耐藥性的影響

為進一步驗證LINC00601在HCC細胞中對奧沙利鉑敏感性的影響，我們使用慢病毒轉染97H細胞，構建過表達LINC00601的97H細胞（97H-LNC），同時利用靶向LINC00601 mRNA的小干擾RNA對97H-OXR中LINC00601的表達水平進行敲低（97H-OXR-siLNC），其RTFQPCR驗證的結果見圖2A。與此同時，我們分別將兩組細胞進行了不同濃度奧沙利鉑處理后的CCK-8實驗，結果發(fā)現(xiàn)，過表達LINC00601能夠顯著地提高97H細胞對于奧沙利鉑的耐受性（圖2B）；然而，當97H-OXR細胞中LINC00601的表達被下調后，其細胞的奧沙利鉑敏感性顯著恢復（圖2C）。同時，我們在3B-OXR細胞中敲減了LINC00601的表達，也得到了一致結果（圖2D、2E）。上述結果提示LINC00601可能對奧沙利鉑耐藥性的調控具有重要意義。

圖2 LINC00601表達改變對HCC細胞奧沙利鉑耐藥性的影響Fig.2 The effect of LINC00601 expression on the sensitivity to oxaliplatin of HCC cells

2.3 LINC00601表達改變對HCC細胞奧沙利鉑處理后凋亡水平的影響

進一步使用流式細胞術觀察奧沙利鉑處理后HCC細胞發(fā)生凋亡的改變。結果顯示，當使用100 μmol/L高濃度的奧沙利鉑分別處理對照組、耐藥組和敲減LINC00601后的耐藥組細胞24 h后，97H、3B、97H-OXR-siLNC和3B-OXR-siLNC細胞發(fā)生凋亡的比例顯著上升，而97H-OXR和3B-OXR這兩株耐藥細胞中的凋亡水平卻并無明顯變化（圖3），這與以上發(fā)現(xiàn)這幾株細胞對奧沙利鉑的敏感性相一致，提示LINC00601的表達水平與細胞凋亡水平呈負相關。

圖3 LINC00601對奧沙利鉑處理后HCC細胞凋亡水平的影響Fig.3 The impact of LINC00601 on the apoptotic level of HCC cells after oxaliplatin treatment

2.4 LINC00601表達改變對HCC細胞奧沙利鉑處理后caspase 3蛋白活化水平的影響

Caspase 3蛋白活化是發(fā)動細胞凋亡的關鍵步驟之一，因此我們進一步地通過Western blot對caspase 3的活化水平進行探究。結果顯示，活化的caspase 3切割體蛋白表達量表現(xiàn)出奧沙利鉑劑量依賴的相關性（圖4），且各株細胞中caspase 3的活化程度與上述流式細胞術測得的凋亡程度相一致。綜上，LINC00601可能通過調控caspase 3蛋白的活化，從而抑制HCC細胞的凋亡，進而影響其對奧沙利鉑的敏感性。

圖4 LINC00601對奧沙利鉑處理后caspase 3蛋白激活的影響Fig.4 The impact of LINC00601 on the activation of caspase 3 protein

2.5 LINC00601在細胞中的定位及對GADD45A表達的調控

為能夠進一步探索LINC00601在細胞中發(fā)揮的生物學功能，我們首先通過Cy3紅色熒光標記的LINC00601探針對其在細胞中的定位進行觀察。熒光顯微鏡觀察結果顯示，LINC00601絕大部分定位于HCC細胞的細胞質中（圖5A）。通過RTFQ-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，GADD45A基因的mRNA水平在高表達LINC00601的97H-LNC和3B-LNC細胞中均顯著下降（圖5B、5D）；然而Western blot實驗結果卻顯示，GADD45A的表達量卻與mRNA水平并不一致（圖5C、5E），提示可能還有其他因素參與調控GADD45A相關信號轉導通路。

圖5 LINC00601在HCC細胞中的定位及對GADD45A基因表達的影響Fig.5 The location of LINC00601 in the HCC cells and its impacts on the expression of GADD45A gene

2.6 LINC00601對GADD45A核轉位的影響

考慮到GADD45A是一種主要定位于細胞核中的蛋白，而我們發(fā)現(xiàn)LINC00601主要位于細胞質中，我們推測LINC00601可能通過調控GADD45A的核轉位過程，從而起到調控GADD45A功能的作用。我們首先使用細胞免疫熒光染色觀察了不同細胞中GADD45A的分布情況。結果顯示，在97H-OXR、97H-LNC、3B-OXR和3B-LNC這幾株高表達LINC00601細胞的細胞質中觀察到了顯著的GADD45A富集，而在LINC00601相對低表達的對照組和OXR-siLNC細胞的細胞質中GADD45A分布較少（圖6A，紅色熒光）。為進一步驗證這一結論，我們分別抽提了不同細胞的細胞核/細胞質質白，并進行了Western blot實驗。結果顯示，97H-OXR和97H-LNC細胞質中GADD45A的表達量顯著增加，而在97H和97H-OXR-siLNC細胞核中觀察到了更為顯著的GADD45A富集（圖6B）。我們也在3B細胞系的對應細胞株中觀察到了相同結果（圖6B）。上述結果提示LINC00601的高表達對GADD45A的核轉位起到了負調控的作用。

圖6 LINC00601影響GADD45A的核轉位Fig.6 The nuclear translocation process of GADD45A was interfered with LINC00601 expression

2.7 LINC00601對GADD45A調控機制的探索

為進一步探索LINC00601對GADD45A核轉位的調控機制，我們進一步通過RNA pull-down和RIP實驗觀察LINC00601是否與GADD45A存在結合。通過LINC00601的RNA pull-down結果顯示，結合的蛋白中存在GADD45A（圖7A）。另一方面，我們使用GADD45A抗體進行免疫共沉淀，通過RTFQ-PCR和瓊脂糖凝膠電泳，在產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了LINC00601 mRNA的富集（圖7B）。上述結果提示LINC00601能夠與GADD45A結合，從而發(fā)揮對后者的調控作用。

圖7 LINC00601與GADD45A的結合Fig.7 LINC00601 might bind to GADD45A

3 討論

對于中晚期HCC患者，以奧沙利鉑為基礎的HCC局部治療如TACE［12］或肝動脈灌注化療［13］是目前臨床主要的治療策略，但治療帶來的生存獲益尚未達到令人滿意的程度。HCC細胞對于以奧沙利鉑為基礎的化療或介入治療抵抗是臨床尚未解決的瓶頸問題。近年來，對奧沙利鉑耐藥機制的研究涉及藥物在細胞內的運輸、解毒、DNA損傷反應與修復、細胞死亡和表觀遺傳學機制［14］等多個方面。對細胞這些功能的深入探索和挖掘有助于進一步推動奧沙利鉑和其他鉑類化療藥物在臨床上的實踐應用。

LncRNA雖然不編碼、翻譯成蛋白質，但近年來研究［4］顯示，lncRNA可以靶向mRNA、miRNA、cirRNA或蛋白，通過調控表觀遺傳學、轉錄及轉錄后調控等途徑影響細胞內的信號轉導通路，發(fā)揮不同的生物學功能。既往有研究［15］鑒定出了74種與HCC相關的lncRNA，近年來亦不斷發(fā)現(xiàn)新的lncRNA參與調控HCC的化療耐藥［16-20］。在食管鱗狀細胞癌和高惡性程度膠質瘤中，LINC00601與多種分子聯(lián)合可以作為不良預后指標［6-7］。也有研究［8］報道，LINC00601在HCC組織中表達增加，并通過激活細胞的MAPK信號轉導通路參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。為進一步驗證LINC00601在奧沙利鉑化療耐藥的HCC中的作用，我們進行了一系列體外實驗，結果表明，LINC00601在HCC細胞中的高表達能夠調控GADD45A的核轉位，抑制HCC細胞凋亡，進而導致HCC細胞對于奧沙利鉑耐藥。

GADD45A基因是p53和MAPK信號轉導通路的關鍵組成部分，可能誘導細胞周期阻滯［21］、DNA修復和細胞凋亡［22］，其主要在細胞核中發(fā)揮生物學功能。GADD45A作為P53基因下游分子，被視為促進細胞凋亡的重要基因之一［23］。近期有研究［24］證實，下調GADD45A的表達可以顯著抑制caspase 3蛋白的激活，抑制細胞凋亡的發(fā)生；而另一方面，過表達GADD45A可以直接改善HCC細胞對奧沙利鉑的耐藥，其具體機制是通過抑制AKT信號轉導通路并參與調控凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達［25］。以上實驗探索的均是GADD45A表達水平對于凋亡或耐藥性的調控，然而我們在實驗中首次發(fā)現(xiàn)，LINC00601能與GADD45A結合，通過非表達水平負調控GADD45A翻譯后的核轉位，從而干擾GADD45A在細胞核中的正常定位和功能，最終導致奧沙利鉑耐藥性的產(chǎn)生。這提示我們GADD45A存在表達水平以外的調控機制和信號轉導通路，然而，LINC00601調控或修飾GADD45A更深入的分子機制有待于進一步探索。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了在奧沙利鉑耐藥細胞中高度表達的LINC00601基因，其可以抑制DNA修復蛋白GADD45A的核轉位，干擾GADD45A在細胞核內的功能，從而減少奧沙利鉑誘導的細胞凋亡，最終導致奧沙利鉑化療耐藥。進一步深入研究靶向LINC00601/GADD45A信號轉導通路的藥物，有望為克服HCC奧沙利鉑耐藥提供新的臨床治療策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。