王笑笑，陳 曦，李敏敏，宋 寧，孫冬瑗，蔣英英,

1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 濰坊 261035

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部常見(jiàn)的鱗狀細(xì)胞癌，其病因包括吸煙、飲酒及人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染等［1-2］。對(duì)于早期OSCC患者，手術(shù)和放療是腫瘤根治的兩種主要方法［3］。而對(duì)于晚期患者，由于OSCC復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅58%［4-5］。因此，了解OSCC的分子特征，尋找有希望的治療靶點(diǎn)，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)OSCC、改善患者預(yù)后具有重要意義。

核仁蛋白8（nucleolar protein 8，NOL8）是一種基因編碼蛋白質(zhì)，與胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［6-8］。作為RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP)，可能參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控和核糖體的生物發(fā)生［9-11］。然而NOL8在OSCC中的作用及其機(jī)制目前仍不清楚。

本研究主要探究NOL8在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)情況，觀察NOL8表達(dá)水平變化后對(duì)OSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的影響，旨在為OSCC機(jī)制的研究和診斷治療提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑

OSCC細(xì)胞系HN6和CAL-27由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院贈(zèng)予，正常對(duì)照細(xì)胞由口腔黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。HN6和CAL-27培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、2%青霉素-鏈霉素，細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，0.25%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶溶液購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司，TRIzol試劑購(gòu)自武漢艾瑞科生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司，matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、NOL8均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）、含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline with Tween-20，TBST）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Ki-67、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）及β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，波形蛋白（vimentin）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析

應(yīng)用基因表達(dá)譜交互分析2（gene expression profiling interactive analysis 2，GEPIA2）（gepia2.cancer-pku.cn）［12］、腫瘤免疫評(píng)估資源（tumor immune estimation resource，TIMER）（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）［13］、阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析（the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal，UALCAN）（http://ualcan.path.uab.edu）［14］及RNA相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（the encyclopedia of RNA interactomes，ENCORI）（http://starbase.sysu.edu.cn）［15］在線分析NOL8在頭頸部鱗癌組織中的表達(dá)情況。GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)使用“Expression DIY”下的“Box plot”進(jìn)行檢索，設(shè)置條件為：①Gene：NOL8；② Cancer：HNSC。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)使用“Diff Exp”進(jìn)行檢索，設(shè)置條件為：①Gene Symbol：NOL8；② Cancer：HNSC。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)使用“TCGA”進(jìn)行檢索，設(shè)置條件為：①Gene：NOL8；② Cancer：HNSC；③Analysis：Expression。ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)使用“Pan-Cancer”下的“Gene Differential Expression”進(jìn)行檢索，設(shè)置條件為：①Gene：NOL8；② Cancer：HNSC；③Chart type：Box plot；④ Data scale：log2-scale。

1.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)

用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用RTFQ-PCR試劑盒進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性（循環(huán)數(shù)1次）：95 ℃ 30 s；PCR（循環(huán)數(shù)40次）：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s。NOL8引物正向序列為5‘-GTCAGCCCTCAGTCATGGATT-3‘，反向序列為5‘-CACACGAAGGCAGTTTTTCATC-3‘；β-actin正向序列為5‘-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3‘，反向序列為5‘-CTCCTTAATGT CACGCACGAT-3‘。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成NOL8小干擾RNA，分別為實(shí)驗(yàn)組（si-NOL8-1，si-NOL8-2）和陰性對(duì)照組，si-NOL8-1靶序列為5‘-GCAACAGGCTGCACAAAAA-3‘，si-NOL8-2靶序列為5‘-GGAGTGGATTTCCATATGA-3‘。將細(xì)胞放于6孔板中，細(xì)胞密度為60%～ 80%，24 h后應(yīng)用Lipo8000TM試劑配制轉(zhuǎn)染體系，混合后靜置20 min，輕滴入6孔板中，放于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用RTFQPCR進(jìn)行敲低效率檢測(cè)，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

由漢尹生物科技（上海）有限公司設(shè)計(jì)合成NOL8慢病毒過(guò)表達(dá)載體，分為實(shí)驗(yàn)組（NOL8）和陰性對(duì)照組。將細(xì)胞放于6孔板中，細(xì)胞密度為20%～ 30%，24 h后每孔加入10 mg/mL聚凝胺進(jìn)行NOL8過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染。于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后更換含10 μg/ mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基，篩選2～ 3次建立NOL8過(guò)表達(dá)慢病毒穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，每天定時(shí)加入CCK-8試劑，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（D）值，連續(xù)檢測(cè)5 d。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞密度達(dá)到100%后，行劃痕操作，1×PBS沖洗后，在顯微鏡下于0、24及48 h觀察記錄劃痕愈合情況。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

將matrigel基質(zhì)膠均勻鋪于transwell上室中，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，在transwell上室內(nèi)接種5×104個(gè)細(xì)胞/200 μL，下室內(nèi)加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～ 48 h后，4%多聚甲醛溶液固定，0.5%結(jié)晶紫染色，擦去未侵襲的細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS沖洗細(xì)胞3次，加入全細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解液后于105℃金屬浴中煮10 min，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液。然后進(jìn)行配膠，上樣，10%SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉后，一抗［E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）］4 ℃溫育過(guò)夜。第2天二抗室溫溫育1 h，最后用電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）超敏發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)上顯影，成像后用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.8 裸鼠皮下移植瘤模型

選用BALB/c 4周齡裸鼠構(gòu)建皮下移植瘤模型。分別收集NOL8過(guò)表達(dá)及對(duì)照組CAL-27細(xì)胞2×107個(gè)/mL，于裸鼠下肢兩側(cè)背部皮下注射100 μL細(xì)胞懸液，每3～ 5 d觀察移植瘤的生長(zhǎng)。3周后結(jié)束觀察并將裸鼠安樂(lè)死，取腫瘤組織拍照并稱(chēng)重。此外，將瘤體于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行H-E染色，并使用Ki-67抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料均以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOL8在OSCC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況

TIMER、GEPIA2、ENCORI及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析顯示，在頭頸部鱗癌中，與癌旁正常組織相比，NOL8在頭頸部鱗癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)（圖1A～ 1D）。RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NOL8在3種細(xì)胞系中的表達(dá)情況，與正?？谇火つぜ?xì)胞相比，NOL8在OSCC細(xì)胞系HN6、CAL-27中的表達(dá)水平較高（圖1E）。

圖1 NOL8在OSCC組織及細(xì)胞系的表達(dá)情況Fig.1 The relative expression of NOL8 in OSCC tissues and cell lines

2.2 敲低NOL8表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影 響

RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NOL8-1、si-NOL8-2的相對(duì)表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組（圖2A）。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NOL8小干擾RNA后CAL-27細(xì)胞增殖能力顯著降低（圖2B）。

圖2 敲低NOL8表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of knocking down NOL8 expression on the cell proliferation of OSCC

2.3 敲低NOL8表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h時(shí)si-NOL8-1、si-NOL8-2與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，敲低NOL8的表達(dá)可限制CAL-27細(xì)胞遷移能力（圖3A）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低NOL8表達(dá)后，CAL-27細(xì)胞的體外侵襲能力同樣被抑制（圖3B）。

圖3 敲低NOL8表達(dá)對(duì)OSCC細(xì)胞的遷移及侵襲能力的影響Fig.3 Effect of knocking down NOL8 expression on cell migration and invasion of OSCC

2.4 過(guò)表達(dá)NOL8對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影響

RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CAL-27和HN6細(xì)胞中，NOL8過(guò)表達(dá)組（NOL8）的相對(duì)表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組（圖4A）；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NOL8組的CAL-27和HN6細(xì)胞增殖能力顯著高于陰性對(duì)照組（圖4B）。

圖4 過(guò)表達(dá)NOL8對(duì)OSCC細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 Effect of overexpression of NOL8 on cell proliferation of OSCC

2.5 過(guò)表達(dá)NOL8對(duì)OSCC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h時(shí)CAL-27及HN6細(xì)胞中NOL8過(guò)表達(dá)組的愈合率均高于陰性對(duì)照組（圖5A）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)NOL8后，CAL-27及HN6細(xì)胞的體外侵襲能力增強(qiáng)（圖5B）。

圖5 過(guò)表達(dá)NOL8對(duì)OSCC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Fig.5 Effect of overexpression of NOL8 on cell migration and invasion of OSCC

2.6 NOL8表達(dá)改變對(duì)OSCC細(xì)胞EMT的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CAL-27細(xì)胞中敲低NOL8表達(dá)后，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平升高，而N-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)水平降低；在CAL-27及HN6細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NOL8后，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平降低，而N-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)水平升高（圖6）。

圖6 NOL8表達(dá)改變對(duì)CAL-27和HN6細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effect of the change of NOL8 expression on EMT-related proteins in CAL-27 and HN6 cells

2.7 NOL8表達(dá)改變對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影 響

裸鼠皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NOL8過(guò)表達(dá)的CAL-27細(xì)胞形成的皮下移植瘤瘤體體積（圖7A）及瘤重（圖7B）均顯著大于陰性對(duì)照組。通過(guò)瘤體組織H-E和Ki-67免疫染色進(jìn)一步觀察瘤體組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)NOL8過(guò)表達(dá)CAL-27細(xì)胞的移植瘤生長(zhǎng)較陰性對(duì)照組更迅速（圖7C）。

圖7 NOL8表達(dá)改變對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of NOL8 expression on the growth of subcutaneously xenograft tumor in nude mice

3 討論

OSCC是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的人類(lèi)惡性腫瘤，目前采用的手術(shù)、放療、生物免疫等聯(lián)合治療取得了顯著進(jìn)展，但由于腫瘤復(fù)發(fā)率高，患者5年生存率低，尋找新的OSCC預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)改善患者的診斷、治療和預(yù)后至關(guān)重要［3，16］。

NOL8含有RNA識(shí)別基序，是一種RBP，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，包括對(duì)mRNA前體的剪接和加工、mRNA的穩(wěn)定性及其降解等過(guò)程［9，17］。既往研究表明，NOL8與多種類(lèi)型癌癥的生物學(xué)行為密切相關(guān)，如前列腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌［6-8］。在前列腺癌中，NOL8高表達(dá)與前列腺癌低生存率相關(guān)，并且可以通過(guò)激活β-catenin/TCF信號(hào)通路促進(jìn)EMT，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲［6］。此外，NOL8與結(jié)直腸癌的臨床預(yù)后也有關(guān)［7，18］。NOL8不僅通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲發(fā)揮促癌作用，還可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮在彌漫性胃癌中的抑癌作用［8］。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，NOL8在OSCC組織及細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)，表明其可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程具有密切聯(lián)系。通過(guò)體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NOL8高表達(dá)可以顯著提高OSCC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

OSCC轉(zhuǎn)移率高，其轉(zhuǎn)移往往與腫瘤遷移和侵襲有關(guān)，進(jìn)一步探究OSCC轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制至關(guān)重要［16］。研究［19-20］發(fā)現(xiàn)，EMT在OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲，EMT過(guò)程的癌細(xì)胞的外形及內(nèi)部分子都發(fā)生了變化，其中上皮性標(biāo)志物（E-cadherin）表達(dá)減少和間質(zhì)標(biāo)志物（N-cadherin、vimentin）表達(dá)增加能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。有研究［19］發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin和Notch通路等可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT來(lái)促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。此外，NOL8可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)，如對(duì)mRNA前體hnRNA的剪接加工和mRNA的穩(wěn)定性及其降解等過(guò)程［17］。進(jìn)一步研究顯示，敲低NOL8可以上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平和下調(diào)N-cadherin、vimentin的表達(dá)水平，而過(guò)表達(dá)NOL8則結(jié)果相反，表明NOL8可促進(jìn)OSCC細(xì)胞EMT的發(fā)生。初步判斷NOL8可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT發(fā)生進(jìn)而影響OSCC細(xì)胞遷移及侵襲能力，但其參與和調(diào)控這一過(guò)程的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NOL8在OSCC組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可以促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，NOL8還能夠誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞EMT的發(fā)生。本研究證實(shí)，NOL8作為OSCC的致癌因子，可能為OSCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究提供新的思路，為OSCC的防治提供新的線索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。