鄒淳緣，許曉峰，盧仁泉，郭 林

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

肺癌是嚴(yán)重威脅全世界人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高居第1位［1］。早期診斷對(duì)提高肺癌手術(shù)切除成功率、改善遠(yuǎn)期生存結(jié)局具有十分重要的意義。而通過(guò)篩選敏感性、差異性表達(dá)的基因或蛋白，改進(jìn)影像學(xué)診斷技術(shù)等有助于早期發(fā)現(xiàn)及診治肺癌。腫瘤的發(fā)生離不開(kāi)環(huán)境的變化和基因的突變，進(jìn)而影響參與組織和細(xì)胞正常生長(zhǎng)和代謝的蛋白表達(dá)。因此，尋找特異性的腫瘤基因或蛋白，并可在外周血液中穩(wěn)定、高效檢測(cè)，無(wú)疑將為提高腫瘤早期診斷準(zhǔn)確度和臨床干預(yù)提供重要依據(jù)。抑癌基因（p53）［2］、蛋白基因產(chǎn)物（PGP9.5）［3］、轉(zhuǎn)錄因子（SOX2）［4］、腫瘤相關(guān)基因編碼蛋白（GAGE7）［5］、解旋酶（GBU4-5）［6］和黑色素瘤抗原（MAGE A1）［7］蛋白被證實(shí)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系，前期研究［8］發(fā)現(xiàn)其在肺癌外周血清中的抗體免疫染色陽(yáng)性率顯著高于健康體檢者；本研究擬進(jìn)一步探討肺癌腫瘤組織和外周血清中上述6種蛋白表達(dá)水平的相 關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選擇2018年5月—2020年5月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的肺癌患者共100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～ 75歲；② 經(jīng)胸部CT、引導(dǎo)穿刺及手術(shù)后病理學(xué)檢查確診為肺癌，均為單發(fā)病變；③可手術(shù)切除完整腫瘤組織和癌旁3 cm外正常肺組織；④ 取得患者的知情同意，臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺部轉(zhuǎn)移瘤，合并其他部位原發(fā)惡性腫瘤，已明確肺癌有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不適合手術(shù)切除；② 既往未行放化療。

100例患者中男性60例，女性40例，年齡52～ 75歲，平均（60.5±9.4）歲；腫瘤位于左側(cè)55例，右側(cè)45例；腫瘤臨床TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期45例，Ⅲa期30例；病理學(xué)類型為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）80例，小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）20例；分化級(jí)別為低分化40例，中分化35例，高分化25例，腫瘤最大直徑為1.5～ 5.0 cm，平均（3.5±1.3）cm。

1.2 研究方法

手術(shù)切除完整腫瘤組織和癌旁組織（癌組織3 cm外的肺組織），采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)上述6種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）法檢測(cè)其基因表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)外周血中血清蛋白的陽(yáng)性情況。

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法

常規(guī)制作石蠟組織切片，厚度5 μm，參照抗體二步法滴加順序進(jìn)行組織染色，以大鼠抗人p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白一抗（美國(guó)Sigma公司，1∶2 000）置于濕盒內(nèi)4 ℃溫育過(guò)夜，正常大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）為陰性對(duì)照；滴加驢抗大鼠二抗（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，1∶500）置于濕盒中27 ℃溫育 20 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）置于濕盒中27 ℃溫育20 min；DAB顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。以細(xì)胞染成黃色為強(qiáng)度指標(biāo)，陽(yáng)性細(xì)胞比例為數(shù)量指標(biāo)，分別賦值0～ 3分和0～ 4分，兩項(xiàng)乘積＜4分為陰性，≥4分為陽(yáng)性。

1.2.2 RTFQ-PCR檢測(cè)

采用德國(guó)Qiagen公司全量RNA提取試劑盒完成提取工作，冰上溶解、剪碎組織，加TRIzol萃取液，氯仿分層，乙醇溶解，RNeasy分離柱純化，緩沖液層析，反復(fù)多次，最后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。按德國(guó)Qiagen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)要求完成cDNA合成工作，1.0 μg樣品RNA+4 μL緩沖液+2 μL混合物+2 μL正反引物，加水至反應(yīng)總體積20 μL。采用日本Takara公司試劑盒測(cè)定目標(biāo)引物表達(dá)量，反應(yīng)體系為6.8 μL SYBER+0.4 μL DYE+0.4 μL正反引物2.0 μL cDNA，置于美國(guó)Baker公司PCR反應(yīng)儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s（95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s），共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGEA1目標(biāo)基因的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 ELISA測(cè)定

主要儀器為BIO-Tek全自動(dòng)酶標(biāo)儀，p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1對(duì)應(yīng)抗體試劑盒由杭州凱保羅生物科技有限公司提供。

主要步驟：向固相板內(nèi)每孔加入200 μL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS），按照固相板加樣示意圖，加入50 μL質(zhì)控品、校準(zhǔn)品、上樣控制品、稀釋好的待測(cè)樣本在相應(yīng)微孔中，確保所有微孔底部被溶液覆封，貼封板膜，室溫振蕩溫育60 min。每孔加工作液200 μL，重復(fù)上述步驟3次。每孔加入稀釋好的酶結(jié)合物工作液50 μL，貼封板膜室溫振蕩溫育30 min。重復(fù)洗板步驟，每孔加入混合好的顯色劑100 μL，室溫避光振蕩溫育15 min。與加入顯色劑相同的順序，每孔加入終止液50 μL，反應(yīng)結(jié)束30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度（D）值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 6種指標(biāo)的醫(yī)學(xué)臨界值Tab.1 Medical cut-off values of 6 indicators

1.3 觀察指標(biāo)

比較每例患者腫瘤組織與癌旁組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽(yáng)性率和基因表達(dá)水平的差異；將上述6種蛋白的陽(yáng)性率和基因表達(dá)水平分別與腫瘤的臨床病理學(xué)特征進(jìn)行相關(guān)分析，其中臨床特征包括患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學(xué)類型、TNM分期和分化級(jí)別。最后，將腫瘤組織中上述6種蛋白的表達(dá)與外周血清表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行t或F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表達(dá)與對(duì)應(yīng)血清表達(dá)水平的相關(guān)關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)及血清中陽(yáng)性表達(dá)的比較

腫瘤組織、血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織（P＜0.05，表2）。

表2 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)及血清中陽(yáng)性表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of positive protein expression in tumor tissues and adjacent tissues and serum［ n（%）］

2.2 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白的相對(duì)表達(dá)水平及血清中表達(dá)水平的比較

腫瘤組織、血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.05，表3）。

表3 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白相對(duì)表達(dá)水平及血清中表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of protein relative expression levels in tumor tissues and adjacent tissues and serum expression levels（）

表3 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白相對(duì)表達(dá)水平及血清中表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of protein relative expression levels in tumor tissues and adjacent tissues and serum expression levels（）

2.3 腫瘤組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)和相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤TNM分期和分化級(jí)別有關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05，表4）。

表4 腫瘤組織蛋白陽(yáng)性表達(dá)和相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.4 Relationship between positive and relative expression levels of protein in tumor tissues and clinicopathological characteristics of tumors［Quantification（n）］

2.4 血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE A1陽(yáng)性率及表達(dá)水平與腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

患者血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1陽(yáng)性率及表達(dá)水平與腫瘤TNM分期和分化級(jí)別有關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05，表5）。

表5 血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE A1陽(yáng)性率及表達(dá)水平與腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.5 Relationship between the positive rate and level of p53,PGP9.5,SOX2,GAGE7,GBU4-5,MAGE A1 in serum and the clinicopathological characteristics of tumors［Quantification（n）］

2.5 腫瘤組織中蛋白表達(dá)與外周血清表達(dá)水平的關(guān)系

腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表達(dá)與對(duì)應(yīng)血清表達(dá)水平具有較好的一致性（P＞0.05，圖 1）。

圖1 腫瘤組織中蛋白表達(dá)與外周血清表達(dá)水平的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of tumor tissue protein expression and peripheral blood serum expression

3 討論

血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體直接參與腫瘤進(jìn)展，惡性腫瘤細(xì)胞分泌的一些抗體可對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移發(fā)揮促進(jìn)作用，這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到大多數(shù)研究學(xué)者的證實(shí)［8］。隨著惡性腫瘤細(xì)胞改變細(xì)胞表面抗原，腫瘤細(xì)胞表面抗原出現(xiàn)，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體，國(guó)外一項(xiàng)研究［9］探討血清自身抗體在食管癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)130例食管癌患者和110例對(duì)照者進(jìn)行ELISA檢測(cè)，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，總靈敏度為83.08%，總特異度為72.73%，基于肯定判斷標(biāo)準(zhǔn)建立諾模圖，在校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證后，計(jì)算ROC曲線的曲線下面積為0.880，說(shuō)明血清自身抗體群聯(lián)合檢測(cè)對(duì)食管癌的早期診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。有研究［10-11］發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生早期人體免疫系統(tǒng)可識(shí)別腫瘤特異性抗原，細(xì)胞壞死后釋放至循環(huán)血液中。腫瘤相關(guān)抗原的改變，如過(guò)表達(dá)、突變、錯(cuò)誤折疊、異常退化等，導(dǎo)致腫瘤患者反應(yīng)性免疫應(yīng)答，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)自身抗體。獲得免疫原性的主要途徑有：①蛋白過(guò)度表達(dá)、突變、折疊錯(cuò)誤；② 異常表達(dá)，正常情況下腫瘤/睪丸抗原僅在人體生殖細(xì)胞中表達(dá)，但多種腫瘤中約有40個(gè)抗原異常表達(dá)（如MAGE A1、CAGE）；③蛋白轉(zhuǎn)譯后的修飾，如磷酸化、糖基化、剪切、氧化后出現(xiàn)新的表位；④ 蛋白異位表達(dá)，如腫瘤胞內(nèi)蛋白分泌到細(xì)胞外或重新定位到細(xì)胞表面。

在癌癥的早期階段，機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以識(shí)別出腫瘤細(xì)胞通過(guò)體液免疫表達(dá)的少量異常蛋白質(zhì)即腫瘤特異性抗原，并產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的抗體。不同種類肺癌的患者可以檢測(cè)血清中的腫瘤特異性抗原。這些抗體不僅可以在診斷出肺癌時(shí)檢測(cè)到，而且在某些情況下甚至可以在臨床癥狀出現(xiàn)前5年檢測(cè)到［12］。Chapman等［13］研究發(fā)現(xiàn)，歐洲人特有的7種自身抗體p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5的靈敏度為76%，特異度為92%。Zhang等［10］研究發(fā)現(xiàn)，腺癌組GBU4-5、PGP9.5水平高于鱗狀細(xì)胞癌組，表明GBU4-5和PGP9.5有可能用于區(qū)分腺癌和鱗狀細(xì)胞癌。然而腺癌組進(jìn)一步分為原位腺癌組和浸潤(rùn)性肺腺癌組，這兩組自身抗體的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能用于區(qū)分特定的腺癌類型，表明雖然自身抗體可用于早期肺癌篩查，但不能用作準(zhǔn)確診斷的手段。Infante等［14］首次發(fā)現(xiàn)p53與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，靈敏度為27%，特異度為90%。原因是p53不僅在肺癌中表達(dá)，而且在許多其他惡性腫瘤（如結(jié)直腸癌、乳腺癌等）中也表達(dá)。Parrales等［15］研究發(fā)現(xiàn)，p53在50%以上的癌癥中表達(dá)，這與腫瘤細(xì)胞的活性密切相關(guān)，是潛在的癌癥治療靶點(diǎn)。Qin等［16］研究發(fā)現(xiàn)，GBU4-5的靈敏度為7%，特異度為98%，曲線下面積為0.91，CAGE的靈敏度為14%，特異度為98%，曲線下面積為0.90，SOX2的靈敏度為14%，特異度為99%，曲線下面積為0.93。這些自身抗體靈敏度高，但特異度低，聯(lián)合檢測(cè)特異度高，但靈敏度較低。Du等［11］研究報(bào)道，聯(lián)合檢測(cè)7種自身抗體（p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、CAGE和MAGEA1）比單抗體檢測(cè)更有利。

本研究顯示，肺癌組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽(yáng)性率和基因表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。p53是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，也是目前研究最廣泛的腫瘤抗原，在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變［17］。p53蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，p53基因突變導(dǎo)致p53蛋白失活是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要步驟［18］。PGP9.5是神經(jīng)元胞質(zhì)基因產(chǎn)物，屬于泛素水解酶，是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)特異性蛋白［19］。其表達(dá)不依賴神經(jīng)分化而獨(dú)立存在，與腫瘤的病理學(xué)分期密切相關(guān)，在原發(fā)性肺癌中大量表達(dá)，但在正常肺部組織中幾乎不表達(dá)［20］。SOX2具有HMG DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)。SOX2通過(guò)與靶基因HMG結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，調(diào)控胚胎和組織發(fā)育，維持干細(xì)胞多能性、增殖性和決定細(xì)胞壽命等［21］。SOX2誘導(dǎo)腫瘤癌信號(hào)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和BCL2L1，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖；同時(shí)SOX2是肺腺癌預(yù)后不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［22］。GAGE7屬于腫瘤/睪丸抗原，在正常組織中不表達(dá)，只在惡性腫瘤及睪丸組織中表達(dá)，具有抗細(xì)胞凋亡活性［23］。GBU4-5屬于腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合RNA解旋酶，在癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，具有腫瘤特異性和免疫原性［24］。MAGE A1在正常組織中不表達(dá)，只在惡性腫瘤和睪丸組織中表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)，與基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤進(jìn)展有關(guān)［25］。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽(yáng)性率及基因表達(dá)水平與腫瘤TNM分期和分化級(jí)別有關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05），提示p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1表達(dá)上調(diào)與腫瘤的惡性程度有關(guān)。腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與外周血清上述蛋白的陽(yáng)性表達(dá)具有較好的一致性（P＞0.05）。證實(shí)通過(guò)外周血檢測(cè)對(duì)應(yīng)抗體與腫瘤組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)具有直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，肺癌腫瘤組織和外周血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與腫瘤TNM分期和分化級(jí)別密切相關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。