張衡以挺

胰腺癌在發(fā)達國家的5年生存率＜5%，預后較差［1］。大量研究表明，姜黃素是一種高效的抗炎物質(zhì)，可改善糖尿病、肥胖癥等的預后［2］。姜黃素在糖尿病心肌病中有抑制細胞生長和誘導細胞凋亡的作用［3］。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是高度保守的細胞周期蛋白家族的一員，是細胞周期蛋白依賴性激酶的重要調(diào)節(jié)因子，通過抑制細胞周期抑制劑來控制細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換表達式，與多種腫瘤存在密切的關(guān)系［4］。NF-κB信號通路被公認為連接炎癥和癌癥的主要信號通路，靶向抑制NF-κB可能同時針對癌細胞和癌癥相關(guān)炎癥，可改善患者預后［5］。有研究表明，姜黃素在凝膠遷移率變化測定中降低胰腺癌細胞NF-kappaB與DNA結(jié)合的能力［6］。本文探討姜黃素對NF-κB通路和Cyclin D1通路的調(diào)控作用，及對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及試劑 BxPC-3細胞系購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。BxPC-3細胞系在含有10%FBS（Gibco）、100μg/mL鏈霉素和100μg/mL青霉素的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞系均在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。姜黃素（Curcumin）購自MCE公司（美國），使用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解，CCK-8試劑盒購自碧云天（中國）；RIPA裂解液購自碧云天（中國）。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天（中國）；PVDF膜購自Millipore公司（美國）；柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購自生工（中國）；PrimeScript? RT Master Mix購自TAKARA公司（日本）；Cleaved Caspase3、Caspase3、Bax、Bcl2、NF-kappaB、p-NF-kappaB和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody抗體購自CST公司（美國）。實驗時間 2021年10月至2021年11月。

1.2 細胞增殖試驗 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，每孔103個細胞，每組設(shè)3個重復。將10、20、30、40、50、60μmol/mL的姜黃素加入BxPC-3細胞處理48 h，將CCK-8試劑加入96孔板，CCK-8試劑：培養(yǎng)基體積比為1∶10。37℃培養(yǎng)1 h后，在460 nm波長處測量吸光度。

1.3 實時定量PCR 使用柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取BxPC-3細胞的總RNA。通過PrimeScript? RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄已提取到的RNA為cDNA，后續(xù)通過Bio-Rad系統(tǒng)進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為10μL，包括5μL SYBR Green Mix，10μmol/mL正向和反向引物，各1μL，模板2μL和無核酶水1μL。反應(yīng)程序如下：95℃3 min，40個循環(huán)，每個循環(huán)95℃ 10 s，60℃30 s。為了確定擴增特異性，對每個引物對的擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析。具體引物見表1。

表1 PCR使用的引物

1.4 Western Blot 使用預冷的PBS洗滌鐵壁細胞，使用RIPA裂解緩沖液在冰上裂解細胞15 min并用細胞刮刀刮下細胞。在4℃，1,200 r/min離心15 min后，轉(zhuǎn)移細胞上清液至EP管，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)定量分析結(jié)果將蛋白調(diào)至相同濃度，加入5×上樣緩沖液混勻，100℃變性5 min。稍微冷卻并離心后，將蛋白質(zhì)進行SDSPAGE凝膠電泳。電泳后，將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，切割目標蛋白條帶，用含5%脫脂奶粉（25 mM Tris、150 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.5）與一抗在4℃下孵育過夜。次日，TBST洗3次后，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，化學發(fā)光液顯色。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad prism 8.3軟件。計量資料以（±s）表示，用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素抑制BxPC-3細胞的增殖 40μg/mL姜黃素處理BxPC-3細胞48 h后細胞活力明顯低于20μg/mL處理48 h（P＜0.05）。隨著藥物濃度的增加，每個孵育時間組的細胞活力逐漸下降（P＜0.05）。姜黃素對BxPC-3細胞系的抑制作用呈劑量和時間依賴性趨勢。后續(xù)實驗選取40μg/mL處理48 h作為處理條件。見圖1。

圖1 姜黃素對BxPC-3 細胞活性的影響

2.2 姜黃素對胰腺癌細胞系BxPC-3凋亡的影響 為了確認姜黃素對細胞胰腺癌細胞系BxPC-3凋亡的影響，用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析在姜黃素處理相同條件下細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的組成型表達水平及Caspase-3的激活。結(jié)果證實與對照組相比，用姜黃素處理BxPC-3細胞后，凋亡蛋白Bax的表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平下調(diào)，Bax/Bcl-2比值上升，剪切的Caspase-3增多（P＜0.05）。表明姜黃素可能通過增加Bax/Bcl-2比值誘導胰腺癌細胞凋亡，從而激活caspase-3。見圖2。

圖2 姜黃素對BxPC-3 細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達量的影響

2.3 姜黃素降低CyclinD1的表達 姜黃素處理可抑制其蛋白質(zhì)和mRNA表達水平，表明姜黃素通過CyclinD1停滯細胞周期。見圖3。

圖3 姜黃素對BxPC-3 細胞中CyclinD1表達量的影響

2.4 姜黃素下調(diào)NF-κB信號通路的激活 與對照組比較，姜黃素處理BxPC-3細胞系后，NF-κB的磷酸化水平降低（P＜0.05），表明姜黃素可能抑制NF-κB信號通路的活化。見圖4。

圖4 姜黃素對BxPC-3 細胞中NF-kappaB通路激活情況的影響

3 討論

姜黃，是姜科的草本植物。該植物產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，包括黃酮類、生物堿類、單寧類和酚酸類，其中活性疏水性多酚二亞甲基甲烷（姜黃素）尤為引人注目。姜黃素用于治療各種疾病，包括炎癥性疾病、肝病、代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病，最重要的是，用于治療多種癌癥。大量研究表明姜黃素在體外對多種惡性細胞系具有有效的抗腫瘤作用，并在裸鼠模型中具有化學預防作用，這一作用主要通過誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖實現(xiàn)［7］。MARQUARDT等［8］發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過阻斷NF-κB通路治療預后不良的肝癌患者。HAN等［9］發(fā)現(xiàn)姜黃素通過下調(diào)microRNA-27a抑制胸腺癌細胞的細胞活力、遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明，不同濃度姜黃素對胰腺癌細胞系BxPC-3的細胞增殖有一定的抑制作用，并促進細胞凋亡。

Bcl-2作為抗凋亡因子，Bax蛋白作為促凋亡蛋白，參與細胞凋亡。研究結(jié)果表明姜黃素可通過減少抗凋亡因子Bcl-2，增加促凋亡蛋白Bax，減少Bcl-2/Bax比值誘導細胞凋亡。細胞凋亡取決于起始Caspase（例如Caspase-8和-9）和Caspase（Caspase-3、-6和-7）［10］?；熕幬锿ǔＭㄟ^PARP-Caspase3通路誘導癌細胞凋亡［11］。本研究結(jié)果表明，姜黃素通過促進Caspase3剪切，誘導細胞凋亡。NF-kappaB通路在許多細胞過程中發(fā)揮重要作用，如細胞代謝、存活、分化、增殖、運動和血管生成［12］。近年來，越來越多的研究表明NF-κB與腫瘤耐藥性相關(guān)，使NF-κB成為治療癌癥的新靶點［13］。NF-κB因子調(diào)節(jié)和控制各種蛋白質(zhì)的表達，包括細胞因子和干擾素。這些蛋白質(zhì)與炎癥和癌癥進展密切相關(guān)。姜黃素對NF-κB依賴性途徑具有抑制作用，從而抑制腫瘤和誘導細胞凋亡。大量研究表明，NF-κB信號通路與細胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)［14］。本研究結(jié)果表明，姜黃素處理BxPC-3細胞系后，NF-κB的磷酸化水平降低，表明姜黃素抑制NF-kappaB信號通路的活化，且與其誘導凋亡相關(guān)。在人類癌癥中，細胞周期蛋白D1比細胞周期蛋白D2或D3更頻繁失調(diào)，因此，已被更廣泛地表征。CyclinD1的過度表達導致CDK活性失調(diào)、細胞在有絲分裂信號受限的條件下快速生長、繞過關(guān)鍵細胞檢查點，并最終導致腫瘤生長。CyclinD1是已知的參與細胞周期停滯的關(guān)鍵分子，是增殖細胞G1期細胞周期調(diào)節(jié)所必需的［15］。本研究結(jié)果表明，姜黃素通過抑制細胞CyclinD1的表達而導致細胞生長停滯。

綜上所述，姜黃素能抑制胰腺癌細胞系BxPC-3增殖、誘導細胞凋亡、促進細胞周期停滯，其作用機制與下調(diào)CyclinD1、抑制NF-κB活化有關(guān)。