張曉麗 王立言 郝 晶 侯桂華 張玉華 張向紅△

（山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，1 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2 實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)與電鏡中心，3 信息化教學(xué)研究中心，濟(jì)南 250012）

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，電鏡技術(shù)在臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究方面的應(yīng)用越來越廣泛，許多醫(yī)學(xué)院校都開設(shè)了電鏡課程。如何在有限的時(shí)間內(nèi)使學(xué)生有興趣主動(dòng)學(xué)習(xí)，并獲得最好的效果，是值得探討的問題[1]。筆者所在電鏡實(shí)驗(yàn)室自20世紀(jì)80年代開始面向醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)本科生開設(shè)選修課，授課教師在長期的實(shí)踐教學(xué)工作中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)如下。

1 明確實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)

目前，電鏡教學(xué)尚無統(tǒng)一的教材和教學(xué)大綱，各高校對(duì)學(xué)生的培養(yǎng)目標(biāo)也沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[2]。根據(jù)多年工作的經(jīng)驗(yàn)，山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)室首先確立了本課程的培養(yǎng)目標(biāo)，具體包括：了解電鏡技術(shù)在科研及臨床中的應(yīng)用；培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)格、細(xì)致的科研作風(fēng)，提高學(xué)生的動(dòng)手操作能力[3]；教會(huì)學(xué)生認(rèn)識(shí)常見的正常和病理超微結(jié)構(gòu)?？傊ㄟ^實(shí)驗(yàn)教學(xué)，可以使學(xué)生對(duì)電鏡技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀、樣品制備原理及方法有一定了解，使其在今后的學(xué)習(xí)和工作中用到電鏡時(shí)，能夠順利閱讀并理解相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)研究目的選擇合適的樣品制備方法，正確分析電鏡相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容建設(shè)

電鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容豐富、專業(yè)性強(qiáng)、操作復(fù)雜、技術(shù)要求高。以往電鏡樣品制備過程的教學(xué)，通常由教師講解和示范，學(xué)生缺少動(dòng)手機(jī)會(huì)。通過多年的教學(xué)實(shí)踐，現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)教學(xué)可以滿足學(xué)生獨(dú)立完成取材至包埋的過程，其他由教師演示，學(xué)生參觀、提問和教師答疑來完成。為了提高學(xué)生學(xué)習(xí)電鏡的興趣、增加學(xué)生動(dòng)手操作的機(jī)會(huì)，對(duì)以下教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行了調(diào)整。

2.1 優(yōu)化包埋步驟，重點(diǎn)突出樣品取材

取材是樣品制備的第一步，取材失誤將導(dǎo)致后續(xù)工作無法進(jìn)行。因此要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中重點(diǎn)掌握動(dòng)物器官、組織和游離細(xì)胞的取材。針對(duì)容易出現(xiàn)的問題，和學(xué)生一起分析原因，找出解決辦法。如取材組織塊太大，固定液和包埋劑不能滲透到組織內(nèi)部，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)保存不良和切片困難的問題。共同分析可能由于新鮮組織柔軟，難以切割為形態(tài)規(guī)則的小組織塊；解決方法是可以先剪取較大的組織塊，放入固定液內(nèi)，硬化幾分鐘，此時(shí)再將組織塊切成 1 mm3的小塊，注意只切取表面固定好的組織。再比如學(xué)生遇到取材部位不準(zhǔn)確或切片方向不明確導(dǎo)致看不到想要的結(jié)構(gòu)時(shí)，教師可以引導(dǎo)學(xué)生對(duì)組織或器官進(jìn)行平面和立體的解析，進(jìn)一步了解組織或器官各部分的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而根據(jù)研究目的選取適當(dāng)?shù)奈恢?，像胃腸道、皮膚、角膜、視網(wǎng)膜、耳蝸、肌肉等在取材時(shí)要注意方向性，并且在取材時(shí)需做出標(biāo)記，或修整為與切面垂直的長方體形狀。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞來說，不同階段的培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異較大，更需掌握適當(dāng)?shù)娜〔臅r(shí)機(jī)，同時(shí)還要注意選擇合適的離心速度和離心時(shí)間，既要避免細(xì)胞團(tuán)塊太松散，又要防止結(jié)構(gòu)遭到破壞。

2.2 對(duì)樣品制備環(huán)節(jié)進(jìn)行有序剪輯及分割

將以往演示甚至省略的樣品制備環(huán)節(jié)進(jìn)行有序剪輯和分割，例如將整個(gè)樣品制備過程分解成載網(wǎng)的選擇與清洗，支持膜的選擇與制備，刀的選擇與玻璃刀的制備，包埋塊修整等幾個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。不同的樣品要選擇不同的載網(wǎng)和切片刀；利用酸堿法清洗載網(wǎng)；利用漂浮法制備Formvar膜，通過膜的顏色判斷其厚度及一致性；采用平衡斷裂法制備45°的玻璃刀，了解斷裂成刀時(shí)越接近“角對(duì)角”斷裂，刀刃越鋒利，切片時(shí)的擠壓變形越??；斷裂越慢，刀刃的可用區(qū)域越長；在超薄切片機(jī)上手工修整包埋塊，暴露出樣品并將頂面修成一定的形狀。這些內(nèi)容由學(xué)生親自動(dòng)手操作，提高了學(xué)生對(duì)電鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)的興趣，增強(qiáng)了學(xué)生的實(shí)踐操作能力。

2.3 增加即時(shí)可獲得結(jié)果的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

利用超薄切片機(jī)制備0.5～2.0 μm厚度的半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色3～5 min后即可用光鏡觀察。由于結(jié)構(gòu)保存良好，且比石蠟切片薄很多，半薄切片能觀察到更細(xì)微結(jié)構(gòu)，不僅可用于定位及對(duì)同一部位進(jìn)行光鏡和電鏡的對(duì)比觀察，還能用于肌肉、腎、腫瘤等疾病的診斷。另外負(fù)染色樣品制作簡單，在細(xì)菌、病毒和寄生蟲的診斷及噬菌體、孢子、核酸、蛋白質(zhì)晶體等大分子材料的研究分析方面有顯著的成效。指導(dǎo)學(xué)生直接對(duì)沉降的顆粒懸液樣品進(jìn)行負(fù)染色，干燥后快速進(jìn)行電鏡觀察。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中增加的這些內(nèi)容可以使學(xué)生更充分了解電鏡技術(shù)在科研和臨床中的實(shí)際應(yīng)用。

2.4 強(qiáng)化超薄切片及電子染色內(nèi)容

超薄切片是樣品制備的關(guān)鍵。了解超薄切片機(jī)的結(jié)構(gòu)及工作原理，其操作可在對(duì)刀之后由學(xué)生親自動(dòng)手，調(diào)節(jié)進(jìn)刀尺度和切片速度，觀察切片過程。了解切片厚度的判斷方法及影響因素，指導(dǎo)學(xué)生用3種方式撈取超薄切片，介紹各自優(yōu)缺點(diǎn)。了解電子染色的原理及常用染色劑的特點(diǎn)，指導(dǎo)學(xué)生利用手工和自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行染色。了解切片缺陷及染色污染產(chǎn)生的原因，有些可以憑借操作者的經(jīng)驗(yàn)予以排除，有些無法彌補(bǔ)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。樣品制備每一步都必須嚴(yán)格、精細(xì)，以此培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)致的工作作風(fēng)。

2.5 重視電鏡調(diào)整與結(jié)構(gòu)分析

電鏡圖像的質(zhì)量不僅取決于樣品制備，還與整個(gè)儀器的狀態(tài)密切相關(guān)。確保足夠的燈絲亮度；選擇合適的加速電壓；調(diào)節(jié)聚光鏡光闌、物鏡消像散，對(duì)電子束進(jìn)行校正合軸；學(xué)習(xí)欠焦、正焦、過焦3種狀態(tài)的調(diào)整；正確地進(jìn)行電鏡操作，才能拍攝出高質(zhì)量的透射電鏡照片。指導(dǎo)學(xué)生在電鏡下進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察，認(rèn)識(shí)細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，了解組織和細(xì)胞病變時(shí)常見的超微結(jié)構(gòu)改變，并與機(jī)能和代謝的變化相聯(lián)系，為學(xué)生以后閱讀理解相關(guān)文獻(xiàn)、正確分析電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果打好基礎(chǔ)。

3 開展綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)課程

2017年開始，電鏡實(shí)驗(yàn)室與同位素研究中心及分子生物教學(xué)平臺(tái)聯(lián)合開展“細(xì)胞學(xué)縱向綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)課程”，全方位覆蓋細(xì)胞學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)和方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、增殖狀態(tài)觀察、分泌因子測(cè)定、移植瘤小鼠模型制備、細(xì)胞及腫瘤的石蠟和超薄切片制備、結(jié)構(gòu)觀察等內(nèi)容。通過近4年的實(shí)踐，學(xué)生選課積極，課堂氣氛活躍，能主動(dòng)聯(lián)系所學(xué)理論知識(shí)，對(duì)“細(xì)胞-腫瘤”這一主題提出問題并展開討論，使學(xué)生了解電鏡技術(shù)與其他學(xué)科的聯(lián)系及在解決實(shí)際問題中的應(yīng)用，開拓了視野，培養(yǎng)了發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的科研實(shí)踐能力。

4 改變實(shí)驗(yàn)教學(xué)形式

集中授課時(shí)，將學(xué)生進(jìn)行適當(dāng)分組，進(jìn)行小班化教學(xué)，教師可以更具體地指導(dǎo)每名學(xué)生操作；集中授課時(shí)間之外，對(duì)學(xué)生開放實(shí)驗(yàn)室。學(xué)生可以自主預(yù)約進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間；允許學(xué)生自帶實(shí)驗(yàn)材料參與實(shí)驗(yàn)室技術(shù)服務(wù)工作，同時(shí)將服務(wù)中經(jīng)常遇到的問題介紹給學(xué)生，使學(xué)生盡早接觸到科研和臨床實(shí)踐；同時(shí)將常用的電鏡技術(shù)整理匯編成技術(shù)手冊(cè)，由熟練的技術(shù)人員操作，并錄制成實(shí)驗(yàn)教學(xué)視頻，且通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)資源共享，為學(xué)生創(chuàng)造自主學(xué)習(xí)的良好環(huán)境[4]。

5 注重學(xué)生反饋

電鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容繁雜，實(shí)驗(yàn)報(bào)告很容易寫成流水賬。目前，鼓勵(lì)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)課后，提出對(duì)該課程的意見和建議，學(xué)生都會(huì)比較積極地參與其中，這些意見和建議對(duì)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有非常重要的意義。指導(dǎo)教師對(duì)學(xué)生的建議基本能做到件件有回應(yīng)。例如，有學(xué)生建議建立微信群，以便對(duì)課程相關(guān)問題隨時(shí)進(jìn)行討論。經(jīng)充分討論，指導(dǎo)教師不僅建立了微信群，同時(shí)還申請(qǐng)了公共郵箱，更加方便指導(dǎo)教師和學(xué)生之間的即時(shí)交流。還有學(xué)生建議按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)流程制備樣本，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。指導(dǎo)教師鼓勵(lì)這部分學(xué)生自主預(yù)約時(shí)間，參與實(shí)驗(yàn)室的開放教學(xué)。這些措施提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，使學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情高漲。

綜上所述，大型儀器用于教學(xué)，存在著教學(xué)內(nèi)容匱乏的難點(diǎn)。大型儀器應(yīng)用于教學(xué)的目的不應(yīng)僅局限于學(xué)會(huì)儀器的開、關(guān)及參數(shù)選擇，更應(yīng)該著重于實(shí)際應(yīng)用和拓展，在儀器原理和操作的學(xué)習(xí)過程中培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、思考能力和創(chuàng)新實(shí)踐能力[5]。近年來，山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室注重加強(qiáng)教學(xué)內(nèi)容建設(shè)，將實(shí)驗(yàn)教學(xué)與技術(shù)服務(wù)相結(jié)合，著重開發(fā)可用于面向?qū)W生開放的教學(xué)項(xiàng)目，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)形式，提高學(xué)生對(duì)電鏡技術(shù)的興趣和動(dòng)手操作能力。這些措施既提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量，又促進(jìn)了技術(shù)服務(wù)的開展。目前，技術(shù)服務(wù)送樣合格率明顯提高，來咨詢的師生對(duì)電鏡技術(shù)大多都有了一定的了解。這些改變又進(jìn)一步激發(fā)了實(shí)驗(yàn)人員的工作熱情。今后，電鏡室將根據(jù)學(xué)生自身的學(xué)習(xí)能力以及對(duì)自我要求的不同，開設(shè)不同層次的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程[6]，充分發(fā)揮電鏡在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的作用，保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)開放的長期性、穩(wěn)定性和持續(xù)性。