劉 洋 張瑞紅 只素娟 劉蘭蘭 劉旭玥 馮曉寧 張曉麗

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，濟南 250012）

慢性腎臟疾病在中國較常見的是IgA腎病[1]，其次為糖尿病腎病、高血壓腎病及其他，它們的終末階段主要表現(xiàn)為腎纖維化[2-4]。腎纖維化的病理改變主要為腎小球硬化，腎間質(zhì)中大量膠原纖維形成等[5]。目前，我國患有慢性腎病的人數(shù)逐年增加[6]，臨床上治療慢性腎病發(fā)展為腎纖維化過程方面仍然十分困難[7]。在研究腎纖維化發(fā)生機制中，由于臨床標(biāo)本難以獲得，因此建立動物模型可以更方便地進行相關(guān)實驗研究。目前常用的構(gòu)建模型的方法包括手術(shù)建模、藥物或毒物誘導(dǎo)模型、復(fù)合模型和轉(zhuǎn)基因模型，其中，藥物或毒物建模的劑量和時間不易控制，復(fù)合模型過程比較繁瑣，轉(zhuǎn)基因模型花費高昂且其應(yīng)用范圍較窄，而手術(shù)建模的方法簡便、快捷、應(yīng)用廣，而且能更好地模擬人類腎纖維化的進程[8]。因此，本文主要對腎纖維化手術(shù)建模方法以及機制研究進行總結(jié)。

1 腎纖維化手術(shù)建模類型

腎纖維化手術(shù)建模主要包括3種類型：腎組織大部切除術(shù)、缺血再灌注損傷和單側(cè)輸尿管結(jié)扎。腎組織大部切除術(shù)建模的原理主要是通過將腎組織大部切除后，腎單位數(shù)量大大減少，而流經(jīng)腎的血流量變化不大，使殘余腎組織承壓增加，各種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的炎癥細胞大量浸潤，比如巨噬細胞，其可促進轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等促纖維化細胞因子釋放，然后通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使肌成纖維細胞不斷分泌膠原纖維，膠原纖維的大量沉積可引起腎纖維化發(fā)生[8]。缺血再灌注損傷模型誘導(dǎo)的腎纖維化建模的原理主要是因為缺血組織在沒有恢復(fù)正常的代謝功能時，由于再次恢復(fù)血運而加劇對腎小球和腎小管等的組織損傷，在后期也可導(dǎo)致腎組織發(fā)生纖維化[9]。單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù)建模的原理主要是輸尿管梗阻導(dǎo)致尿液不能正常排出而積聚于腎，從而導(dǎo)致腎腫大，腎小球濾過率減少，最后引起腎小管的快速萎縮、壞死和間質(zhì)中大量基質(zhì)堆積[10]。

1.1 腎組織大部切除術(shù)腎纖維化模型

制備方法：準(zhǔn)備6～8周雄性大鼠，隨機分為假手術(shù)組和模型組，麻醉大鼠，手術(shù)操作臺固定，去除腹部毛發(fā)且暴露區(qū)域足夠大，75%乙醇對腹部區(qū)域進行消毒。模型組在距左脊肋角1～2 cm處斜向外方切一小口以暴露左腎，游離腎周圍脂肪組織，絲線結(jié)扎上、下極腎組織約1/3，1周后再次手術(shù)將整個右腎切除，2次手術(shù)一共切除5/6腎組織；假手術(shù)組大鼠只需劃一切口，不需切除腎組織。模型構(gòu)建過程中，手術(shù)操作要求比較高，操作者應(yīng)熟練整個手術(shù)流程。同時，腎是一個易出血的臟器，應(yīng)重點做好止血準(zhǔn)備。在建立模型后的2、4、8、12周分別取腎組織，通過H-E染色（hematoxylin-eosin staining ）、Masson三色染色（Massontrichrome staining）、PAS染色（periodic acid-schiff staining）及免疫組織化學(xué)方法觀察腎組織結(jié)構(gòu)改變，主要觀察腎小球是否有局灶或全部硬化，腎小管是否有萎縮或擴張以及腎間質(zhì)纖維化的程度等[8-11]。

模型特點：該模型手術(shù)過程不算復(fù)雜，且可行性大，成功率也高。但是，手術(shù)存在出血、感染的可能，手術(shù)操作過程應(yīng)注重止血、無菌操作。

模型應(yīng)用：主要用于研究腎小球硬化導(dǎo)致的腎纖維化。Wen等[12]利用該模型，研究了青蒿素可通過NF-κB/NLRP3途徑減輕大鼠腎纖維化。另外，Zhu等[13]利用腎切除模型驗證了中藥（益氣化瘀通絡(luò)方）可通過影響Nrf2/Keap1信號通路，下調(diào)TGF-β1蛋白表達，從而減少殘余腎氧化應(yīng)激損傷及纖維化程度。

1.2 缺血再灌注損傷腎纖維化模型

制備方法：準(zhǔn)備6～8周雄性大鼠，隨機分為假手術(shù)組和模型組，麻醉大鼠后操作臺固定，剔除腹部毛發(fā)，并用75%乙醇進行消毒。打開腹腔后將雙側(cè)腎動脈鉗夾45 min，然后取下鉗夾進行再灌注24 h后，取血清和腎組織分別進行研究。操作時，嚴(yán)格把握鉗夾動脈血管的時間以及灌注時間，此步是該模型成功的關(guān)鍵。有研究證明，對照組血清乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和腎功能相關(guān)標(biāo)記物如血清尿素氮（b1ood urea nitrogen，BUN）和肌酐顯著增加[14]；通過H-E染色、Masson三色染色和PAS染色，可以觀察腎組織結(jié)構(gòu)變化和纖維組織含量變化（如是否有腎小球局灶或全部硬化、腎小管萎縮或擴張以及腎間質(zhì)纖維是否增加）[8]；通過免疫組織化學(xué)顯色可以觀察與腎纖維化相關(guān)標(biāo)記物的表達情況，如α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和TGF-β1等的含量改變[15-16]。

模型特點：該模型建模耗費時間相對較短，操作方法最簡單，腎纖維化特征比較明顯。但是，該模型的缺血時間不易控制，缺血時間短暫，其造成的損傷是可逆的，缺血時間較長的話，其損傷是不可逆的。

模型應(yīng)用：應(yīng)用較廣，大多數(shù)用于研究腎小球硬化。Zhou等[17]通過構(gòu)建缺血再灌注損傷腎纖維化模型驗證了CB2/β-catenin通路可促進腎纖維化，靶向抑制CB2或β-阻滯素1可抑制纖維化的進展。Qi等[18]發(fā)現(xiàn)C5a/C5aR1軸可促進小鼠腎缺血再灌注損傷后腎纖維化的進展。

1.3 單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型

制備方法：準(zhǔn)備6～8周雄性大鼠，腹腔注射麻醉劑后，將其固定于操作臺上，用剃毛器去除腹部毛發(fā)，噴灑75%乙醇對腹部區(qū)域進行消毒，在左側(cè)腹部行一切口，充分暴露輸尿管，并游離周圍脂肪組織，切除左側(cè)輸尿管，并縫合結(jié)扎傷口；假手術(shù)組大鼠僅打開腹腔暴露輸尿管，并游離周圍脂肪組織，但不處理輸尿管，分別于手術(shù)后3 d、7 d和14 d取腎組織，通過H-E染色等觀察腎組織結(jié)構(gòu)的改變[19-20]。手術(shù)操作時，應(yīng)注意嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，保護好腎周圍組織，同時需要將腎放于原位，并逐層縫合。腎小管間質(zhì)損傷評分主要根據(jù)腎小管上皮細胞是否有空泡變性、壞死以及變性、壞死的比例；腎小管是否有擴張或萎縮；間質(zhì)纖維化病變程度；通過尿常規(guī)檢測尿中有無紅細胞管型和蛋白管型等；腎間質(zhì)相對面積測定主要是通過Masson染色法之后，計算膠原纖維藍染面積占整個腎間質(zhì)面積百分比；腎小管間質(zhì)α-SMA含量主要是通過圖像分析，計算棕黃色染色面積占整個腎間質(zhì)面積的百分比[21]。

模型特點：該模型操作步驟簡單，同時建模時間短，可多次重復(fù)建模且病變一致，成功率較高。該模型的缺點是，此模型不適用于研究腎小球硬化，并且在建模前期，需要多次摸索導(dǎo)致腎纖維化特征較明顯的時間點。

模型應(yīng)用：主要適用于研究腎間質(zhì)纖維化。 Zhao等[22]通過構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型，驗證了L-肉堿可預(yù)防單側(cè)輸尿管梗阻模型中小管間質(zhì)炎癥和纖維化。另外，還有一些研究表明姜黃素[23]、雷公藤[24]等藥物可用于減輕單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎纖維化。

2 腎纖維化的發(fā)病機制

當(dāng)腎組織受損時，可促進以巨噬細胞為代表的炎癥細胞浸潤，進而這些炎癥細胞釋放各種與纖維化相關(guān)的細胞生長因子，導(dǎo)致間質(zhì)中大量膠原纖維沉積，使腎結(jié)構(gòu)受損、功能減弱，是腎纖維化形成中的重要分子機制。目前對于腎纖維化發(fā)生機制的研究主要集中于以下幾條經(jīng)典的信號通路，通過對參與腎纖維化的信號通路的研究，可以發(fā)現(xiàn)新的分子靶點，為臨床腎纖維化的診斷與治療提供實驗基礎(chǔ)。

2.1 TGF-β1/Smad通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

TGF-β1是驅(qū)動腎纖維化的重要因素，可直接激活Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起下游與纖維化相關(guān)靶基因的過度表達。研究證實，TGF-β1/Smad通路的失調(diào)在腎纖維化發(fā)生中起重要作用[25]。

TGF-β是生長因子超家族的一部分，在哺乳動物中已經(jīng)鑒定出 3 種，其中對TGF-β1的研究最多。TGF-β1 及其2 種 TGF-β 受體 （TGF-β receptor，TGFβ-R）Ⅰ和Ⅱ在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）和纖維化中起關(guān)鍵作用[25]。在腎纖維化發(fā)展進程中，TGF-β1與其受體結(jié)合可以誘導(dǎo)Smad3發(fā)生磷酸化，從而觸發(fā)其下游與纖維形成緊密相關(guān)的基因如α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）、纖連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）等的表達，使膠原纖維在腎臟組織中大量沉積[26-27]。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

Wnt/β-catenin信號通路在進化上高度保守、復(fù)雜而關(guān)鍵，參與調(diào)控細胞命運、組織穩(wěn)態(tài)、器官發(fā)育、損傷和修復(fù)。它在正常成人腎中相對沉默，但在腎臟疾病患者和建立的腎纖維化的動物模型中，由于腎組織受到損傷，該信號通路被重新激活[28]，長時間和過量的信號通路激活可導(dǎo)致腎纖維化[29]。，Wnt/β-catenin信號通路的激活在慢性梗阻性腎病和腎間質(zhì)纖維化所致腎損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[30]。

Wnt家族中至少有19個Wnt家族成員對腎的發(fā)育至關(guān)重要，其缺失可導(dǎo)致各種腎臟疾病的發(fā)生[31]。Wnt蛋白可通過與Frizzed（Fzd）受體家族及其共受體LRP5/6相互作用，通過細胞膜傳遞信號，激活Disheveled（Dsh/DVL），進而將信號傳遞給β-連環(huán)蛋白（β-catenin）[31]，β-catenin在細胞核中募集后，與T細胞特定的轉(zhuǎn)錄因子（TCF）或淋巴增強因子（LEF）結(jié)合，調(diào)控Wnt下游基因的表達[32]。Wnt/β-catenin信號通路主要通過誘導(dǎo)其靶基因的表達而發(fā)揮生物學(xué)活性。近年來，大量與腎纖維化相關(guān)的靶基因包括FN、Snail1、基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、成纖維細胞特異性蛋白1及RAS等組分相繼被發(fā)現(xiàn)[31-32]，并發(fā)現(xiàn)了幾種Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，包括可溶性Frizzed相關(guān)蛋白（SFRPs） 、Wnt抑制因子、Dickkopf（DKK）家族和抗衰老蛋白Klotho等。SFRPs與Frizzed序列具有同源性，可以在細胞外空間與Wnts結(jié)合和隔離，進而阻止其與Fzd受體結(jié)合；Wnt抑制因子和Klotho可與Wnt蛋白結(jié)合，并阻止其信號傳遞；DKK家族蛋白通過與LRP5/6共受體結(jié)合和內(nèi)化來拮抗Wnt/β-catenin信號通路的激活[28，33]。

2.3 Notch信號通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

Notch 信號通路的主要功能是調(diào)節(jié)細胞間的相互作用[34]。該通路主要由Notch配體、 Notch 受體以及Notch 的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch配體包括Jagged 1（Jg1）、Jagged 2（Jg2）、Delta樣1（Dll1）、Delta樣3（Dll3）或Delta樣4（Dll4）。Notch 受體由 Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4組成[35]。這些受體在接受信號細胞的質(zhì)膜上，經(jīng)過糖基化、糖醛樣轉(zhuǎn)換酶和亞當(dāng)金屬蛋白酶受體的第二次切割，配體與受體結(jié)合后再啟動第3次切割，然后Notch 受體胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域被轉(zhuǎn)移到細胞核，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如Rbpj和Maml結(jié)合，促使相關(guān)基因的表達[36-38]。相關(guān)文獻證實，腎受損可引起Notch信號活性及Notch 受體表達增加，導(dǎo)致上皮脫分化、肌成纖維細胞活化和基質(zhì)沉積等[36]，從而引起腎纖維化改變。

在新生兒及成人階段Notch信號通路通常是被抑制的，如果發(fā)生腎損傷，該通路則被重新激活[29]。相關(guān)研究證實，Notch信號通路的異常激活與腎纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[35]。

2.4 Hedgehog（Hh）信號通路在腎纖維化發(fā)生中的作用

Hh信號通路比較復(fù)雜，它參與胚胎發(fā)育過程中多方面的調(diào)節(jié)，在組織內(nèi)平衡中起著決定性作用，當(dāng)腎組織受損時，Hh信號通路被異常和持續(xù)地激活[39]。其激活主要直接靶向作用于腎纖維化發(fā)生的中心事件——肌成纖維細胞（大部分來源于腎間充質(zhì)干細胞樣細胞）的活化、增殖與轉(zhuǎn)化，提示該通路的激活與纖維化發(fā)生密切相關(guān)[40-41]。

Hh信號通路主要由Hh配體、Patched受體（Ptch受體）、共受體（Cdon/Ihog，Boc/Boi，Gas1）、換能器Smooth（Smo）及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli組成，該通路分為經(jīng)典模式和非經(jīng)典模式通路[40]。在經(jīng)典模式通路中，當(dāng)腎組織受損時，Hh信號增加，Hh在共受體輔助下與Ptch結(jié)合后下調(diào)Ptch的膜表達，從而使Smo在膜表面富集，Smo進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使Gli與其抑制蛋白su fu及Cos2分離，從而開始活化與核轉(zhuǎn)位，最終激活靶基因，如Gli1、Ptch1、N-myc及細胞周期蛋白D/E等[39-40]。非經(jīng)典通路的特點是與配體無關(guān)的Ptch激活或Smo激活，通過TGF-β、Wnt等多信號的調(diào)節(jié)直接激活Gli使其轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究證實，Gli1可增加肌成纖維細胞的活性使其大量增殖，可還誘導(dǎo)EMT關(guān)鍵因子Snail1以及Twist1上調(diào)，上皮細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，間質(zhì)中膠原纖維過度沉積引起腎臟纖維化的發(fā)生[39-42]。

盡管慢性腎臟疾病的發(fā)展過程比較緩慢，但最終都可引起腎纖維化的發(fā)生。在腎纖維化發(fā)生過程中，膠原纖維大量沉積，腎結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可導(dǎo)致腎功能嚴(yán)重缺失。腎纖維化過程是否可以逆轉(zhuǎn)，取決于參與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展過程的各種因素，因此研究其發(fā)生機制尤為重要。本綜述總結(jié)了幾種常見的通過外科手術(shù)建立腎纖維化動物模型的方法，以及參與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展過程的幾條經(jīng)典的信號通路，以期為關(guān)注腎纖維化的研究者提供一些參考。通常情況下，如果研究者主要關(guān)注腎小球硬化型的腎纖維化，一般選用通過腎大部切除術(shù)或者腎缺血再灌注來建立腎纖維化的動物模型；如果研究者主要研究腎間質(zhì)纖維化，一般建議通過單側(cè)輸尿管梗阻建立腎纖維化的動物模型。目前，臨床上對于腎纖維化的患者仍缺乏效果良好的治療方法，通過腎纖維化的動物模型以研究腎纖維化的發(fā)生機制可以有助于該疾病相關(guān)新藥研發(fā)和更有效精準(zhǔn)的治療。醫(yī)學(xué)研究人員通過建立各種腎纖維化的動物模型來研究腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展機制，尋找參與腎纖維化的信號通路；藥物研發(fā)人員以這些信號通路中的分子為靶點，研發(fā)相應(yīng)信號分子的激動劑或抑制劑，開發(fā)可能應(yīng)用于治療人類腎臟纖維化的藥物，減輕或防止腎臟纖維化的發(fā)生。