李 萍，宗文月，杜欣軍，王 碩

(1.食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種無(wú)芽孢、有周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌[1]，是一類能夠在人和動(dòng)物腸道內(nèi)生存的機(jī)會(huì)致病菌，能夠引起新生兒腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎[2].相關(guān)研究[3]表明，阪崎克羅諾桿菌是引起嚴(yán)重感染的機(jī)會(huì)病原體，尤其是在嬰兒、老年人和免疫功能低下的人中.出生體質(zhì)量小于2.5kg的嬰兒和出生不足 28d的新生兒有更高的感染風(fēng)險(xiǎn)[4].阪崎克羅諾桿菌主要存在于嬰幼兒配方奶粉及其他嬰幼兒食品中[5]，新生兒感染后的死亡率高達(dá) 80%[6]，幸存者往往患有嚴(yán)重的、不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病.阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒配方奶粉中的存活能力強(qiáng)，對(duì)嬰幼兒的危害較大，引起了大眾的廣泛關(guān)注.

許多環(huán)境損傷和內(nèi)源性過(guò)程可導(dǎo)致 DNA損傷，對(duì)細(xì)胞生存構(gòu)成直接威脅.在大多數(shù)細(xì)菌中，DNA損傷通過(guò)應(yīng)急反應(yīng)(SOS反應(yīng))的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程進(jìn)行處理[7-8].在大腸桿菌(Escherichia coli)中，SOS反應(yīng)是細(xì)胞遇到DNA損傷因子后被誘導(dǎo)的一種由40多個(gè)基因組成的調(diào)控機(jī)制，其中許多基因參與了 DNA損傷的耐受和修復(fù)，如 recA、lexA、umuDC、recN、sulA、polB、uvrA、uvrB 和 uvrD[9-12].這個(gè)過(guò)程受 SOS調(diào)節(jié)因子LexA和RecA的控制.SOS反應(yīng)通路是一種可誘導(dǎo)的 DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)[13].在沒(méi)有 DNA損傷的情況下，LexA阻止SOS基因的轉(zhuǎn)錄[14].當(dāng)DNA損傷時(shí)，重組蛋白 RecA在單鏈 DNA上形成核微絲.RecA核蛋白絲激活 LexA自身蛋白水解，SOS反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄被打開(kāi)[8,14].除了兩個(gè)關(guān)鍵的 SOS反應(yīng)調(diào)節(jié)因子 LexA和 RecA，其他一些壓力源和壓力反應(yīng)也可以控制 SOS反應(yīng)的因素[15].細(xì)菌暴露于DNA損傷劑以及其他環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)因素，這些因素會(huì)在宿主內(nèi)的許多部位觸發(fā)SOS反應(yīng)[16].

與NCBI中大腸桿菌的yebG基因(DNA損傷誘導(dǎo)蛋白)序列的比對(duì)結(jié)果表明，阪崎克羅諾桿菌中的ESA_01393基因序列覆蓋度為 67%，相似度為 68%.操縱子融合表明，在大腸桿菌中 yebG基因的表達(dá)受SOS反應(yīng)調(diào)節(jié)因子 LexA和 RecA的調(diào)控[9,17].Uranga等[18]研究發(fā)現(xiàn)，yebG基因是SOS反應(yīng)調(diào)控的一部分，在 DNA受到損傷后被高度誘導(dǎo).絲裂霉素C處理大腸桿菌后，會(huì)誘導(dǎo) yebG 基因的表達(dá)[17].因此，編碼 DNA損傷誘導(dǎo)蛋白的 yebG基因被鑒定為大腸桿菌的一種新的 SOS反應(yīng)調(diào)控基因[17]，但基因的功能尚不清楚.為了進(jìn)一步研究阪崎克羅諾桿菌中的 ESA_01393基因的功能，本研究在阪崎克羅諾桿菌 ATCCBAA-894中進(jìn)行了基因敲除，并對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成能力、耐干燥能力以及 DNA損傷修復(fù)能力進(jìn)行了評(píng)估，為后續(xù)阪崎克羅諾桿菌的致病性及耐干燥機(jī)制研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)ATCC BAA-894保存在本實(shí)驗(yàn)室的－80℃冰箱中.質(zhì)粒pCVD442、質(zhì)粒 pACYC184、大腸桿菌(Escherichia coli)S17-1λpir和大腸桿菌 DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存.質(zhì)粒 pCVD442-Q-H和質(zhì)粒 pACYC184-ESA_01393為本研究構(gòu)建(表1).

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒Tab.1 Bacteria strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑與儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司；KOD酶、Taq酶和dNTP mix(10mmol/L)，寶生物工程(大連)有限公司；氯霉素，上海麥克林生化科技有限公司；氨芐青霉素，BBI生命科學(xué)有限公司；限制性內(nèi)切酶，美國(guó) NEB公司；D2000DNA marker、1kb plus DNA marker、2×Taq PCR master mix和上樣緩沖液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；T4連接酶，賽默飛世爾科技公司；LB培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA計(jì)數(shù)培養(yǎng)基)，青島海博技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Sunrise-Basic型酶標(biāo)儀，帝肯奧地利有限責(zé)任公司；超微量分光光度計(jì)，德國(guó)Berthold公司；3-30K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)

使用NCBI找到ESA_01393基因(GenBank號(hào)為WP_004386660.1)，選取其上下游同源臂各700bp的相應(yīng)序列，使用Premier 5設(shè)計(jì)ESA_01393基因上下游同源臂的引物ESA_01393-Q F/ESA_01393-Q R和ESA_01393-H F/ESA_01393-H R，并且分別在上下游同源臂引物的 5′端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn).ESA_01393 1-F/ESA_01393 1-R和ESA_01393 2-F/ESA_01393 2-R為基因敲除驗(yàn)證的引物，分別位于 ESA_01393基因上和 ESA_01393基因的兩端各 700bp處.cpESA_01393 F/cpESA_01393 R為基因回補(bǔ)的引物，位于 ESA_01393基因上，并且在引物的 5′端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn).引物序列見(jiàn)表2.

表2 引物序列Tab.2 Sequences of primers

1.2.2 基因敲除及回補(bǔ)株的構(gòu)建

采用 Ji等[19]的方法并稍作改動(dòng)，對(duì) C.sakazakii ATCC BAA-894野生型(WT)進(jìn)行基因突變.使用ESA_01393-Q F/ESA_01393-Q R和ESA_01393-H F/ESA_01393-H R兩對(duì)引物從 WT的全基因組序列中擴(kuò)增出待敲除基因的上下游片段(表2).將上下游片段克隆到 pCVD442自殺載體中，產(chǎn)生重組載體pCVD442-Q-H.將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 S17-1λpir感受態(tài)中，通過(guò)電轉(zhuǎn)化構(gòu)建ΔESA_01393突變株.

使用 cpESA_01393F和 cpESA_01393R兩個(gè)引物構(gòu)建了含有 ESA_01393編碼序列及其啟動(dòng)子的互補(bǔ)質(zhì)粒 pACYC184-ESA_01393.將互補(bǔ)質(zhì)?？寺≈力SA_01393突變株中，獲得攜帶ESA_01393基因的回補(bǔ)株cpESA_01393.回補(bǔ)株引入的酶切位點(diǎn)分別為HindⅢ和BamHⅠ.

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線.將菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，菌液以 1：100比例轉(zhuǎn)接至新鮮的 LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng) 14h.從轉(zhuǎn)接開(kāi)始，每隔1h取樣，測(cè)定 600nm 處的吸光度(A600)直至平穩(wěn)期，必要時(shí)稀釋一定倍數(shù).用 LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，繪制生長(zhǎng)曲線.每個(gè)樣本重復(fù)3次.

1.2.4 運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定細(xì)菌軟瓊脂的遷移直徑(0.3%)對(duì)運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行評(píng)估[21].將菌株 WT、ΔESA_01393和cpESA_01393分別接種于無(wú)菌的LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng).分別取 10μL菌液置于軟瓊脂運(yùn)動(dòng)板(含0.3%瓊脂的 LB 瓊脂培養(yǎng)基)上，30℃培養(yǎng) 16h，觀察菌落大小，每個(gè)樣本重復(fù)3次.

1.2.5 生物膜形成能力的測(cè)定

用結(jié)晶紫染色法測(cè)定阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成能力[22].取吸光度介于 0.6～0.8之間的菌株WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393的菌液制備懸浮液.每孔加入100μL懸浮液，37℃孵育48～72h；加入 200μL 99%甲醇固定生物膜，15min后棄去上清液.在室溫下風(fēng)干后，用 200μL 1%結(jié)晶紫染料染色30min，用無(wú)菌水洗滌3次；加入200μL 95%乙醇進(jìn)行脫色.以培養(yǎng)基為陰性對(duì)照.使用Sunrise-Basic酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光度，每個(gè)樣本重復(fù)3次.

1.2.6 耐干燥性的測(cè)定

參照Farrow等[23]的方法并稍加改動(dòng)進(jìn)行細(xì)菌干燥耐受性的評(píng)估.將菌株 WT、ΔESA_01393和cpESA_01393培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，獲得懸浮液.為了記錄初始細(xì)胞數(shù)，將每種細(xì)菌懸浮液的10μL樣品用PBS緩沖液稀釋至 100μL，然后連續(xù)稀釋并接種至 PCA計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)，此時(shí)為干燥前的菌落數(shù).吸取200μL的菌液置于96孔板中，然后將 96孔板放在無(wú)菌干燥器里，再將干燥器置于溫度42℃、相對(duì)濕度45%的培養(yǎng)箱恒溫恒濕培養(yǎng)，進(jìn)行耐干燥性實(shí)驗(yàn)評(píng)估，時(shí)間為 6d.為了確定菌體干燥后的死亡率，將 100μL的 PBS置于每個(gè)干燥的樣品上，在室溫下孵育 5min，將菌體吹吸重懸后進(jìn)行梯度稀釋.使用PBS進(jìn)行連續(xù)稀釋并接種到PCA計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù).每個(gè)樣本重復(fù)3次.

1.2.7 紫外線照射

根據(jù) Oh等[24]的方法并稍加改動(dòng)，評(píng)估紫外線(UV)照射后菌體的死亡率.菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393培養(yǎng)至 A600＝0.6～0.8，然后將菌液分別放置在培養(yǎng)皿里，使用紫外燈進(jìn)行照射.將分別照射了5min、10min和15min的3種菌株用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，涂布至 PCA固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本重復(fù)3次.

1.2.8 絲裂霉素C處理

根據(jù) Oh等[24]的方法并稍加改動(dòng)，評(píng)估絲裂霉素 C處理后菌體的死亡率.菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393培養(yǎng)至 A600＝0.6～0.8，然后將 3種菌株的菌液分別置于離心管中，加入 0.1%的絲裂霉素 C，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).將分別培養(yǎng)了 10min、20min和30min的3種菌株用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，涂布至 PCA固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本重復(fù)3次.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn).用 GraphPad Prism 簡(jiǎn)單單向 t-test檢驗(yàn)或多重比較，*和**分別表示組間具有顯著性差異(P＜0.05)和極顯著差異(P＜0.01).

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除結(jié)果的驗(yàn)證

利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了突變株ΔESA_01393及其回補(bǔ)株 cpESA_01393.ΔESA_01393和 cpESA_01393菌株通過(guò) PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證.分別以 WT菌株和ΔESA_01393菌株DNA為模板進(jìn)行PCR.如圖1(a)所示，以ESA_01393 1-F/ESA_01393 1-R為引物，WT菌株擴(kuò)增出 315bp的產(chǎn)物，ΔESA_01393菌株沒(méi)有出現(xiàn) DNA條帶.如圖1(b)所示，以ESA_01393 2-F/ESA_01393 2-R為引物，WT菌株擴(kuò)增出 1710bp的產(chǎn)物，ΔESA_01393菌株擴(kuò)增出1395bp的產(chǎn)物.如圖1(c)所示，以 cpESA_01393F/cpESA_01393R為引物，cpESA_01393菌株擴(kuò)增的DNA條帶為315bp.PCR結(jié)果表明，ΔESA_01393和cpESA_01393菌株構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖1 阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因敲除和回補(bǔ)株構(gòu)建結(jié)果的驗(yàn)證Fig.1 Validation of the results of ESA_01393 gene knock-out and cpESA_01393 complementary strain in C.sakazakii

2.2 ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCCBAA-894生長(zhǎng)的影響

比較阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及 cpESA_01393回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖2所示.與野生型相比，ΔESA_01393突變株顯示出相似的生長(zhǎng)速率，表明基因缺失后其生長(zhǎng)未受影響，同時(shí) cpESA_01393回補(bǔ)株的 A600沒(méi)有明顯變化.這說(shuō)明 ESA_01393基因的缺失不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，是細(xì)菌的非致死基因，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)是非必需的，同時(shí)也排除了生長(zhǎng)規(guī)律不同對(duì)后續(xù)研究結(jié)果的影響.

圖2 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線比較Fig.2 Comparision of growth curves for the growth of WT，ΔESA_01393 and cpESA_01393 strains of C.sakazakii

2.3 ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCC BAA-894運(yùn)動(dòng)能力的影響

阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的運(yùn)動(dòng)性鑒定結(jié)果如圖3所示.阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株在 0.3%的瓊脂培養(yǎng)基上形成大小相似的運(yùn)動(dòng)環(huán)；與野生型比較，ΔESA_01393突變株運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有較大變化，回補(bǔ)株運(yùn)動(dòng)能力也與野生型相似.運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑的測(cè)量結(jié)果表明，基因 ESA_01393的缺失不影響阪崎克羅諾桿菌的運(yùn)動(dòng)能力.

圖3 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的運(yùn)動(dòng)性鑒定Fig.3 Mobility identification of WT，ΔESA_01393and cpESA_01393 strain of C.sakazakii

2.4 ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCC BAA-894生物膜形成能力的影響

生物膜的形成取決于細(xì)菌誘導(dǎo) SOS反應(yīng)的能力[25].為了驗(yàn)證 ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCC BAA-894生物膜形成能力的影響，評(píng)估了野生型、突變株和回補(bǔ)株的生物膜形成量(圖4).與野生型相比，ΔESA_01393突變株所形成的生物膜形成量略有減少，但沒(méi)有顯著性.cpESA_01393回補(bǔ)株顯示出與野生型菌株相似的生物膜形成能力.生物膜的形成過(guò)程可能受到多種因子的調(diào)節(jié)，基因ESA_01393可能不是主要的調(diào)控因子.

圖4 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的生物膜合成能力比較Fig.4 Comparision of biofilm formation of the WT，ΔESA_01393 and cpESA_01393 strain of C.sakazakii

2.5 ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCC BAA-894耐干燥性的影響

阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的干燥死亡率如圖5所示.與野生型相比，ΔESA_01393突變株干燥死亡率更高，回補(bǔ)株表現(xiàn)出與野生型相似的干燥死亡率.因此，ESA_01393的缺失會(huì)降低阪崎克羅諾桿菌耐受干燥環(huán)境的能力，該基因能夠在一定程度上抵抗干燥環(huán)境的壓力.

圖5 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的干燥死亡率Fig.5 Drying mortality rate of WT，ΔESA_01393and cpESA_01393 strain of C.sakazakii

阪崎克羅諾桿菌具有一些重要的毒力相關(guān)因子或應(yīng)激生存因子，尤其是在各種不利環(huán)境條件下仍能存活的能力，最顯著的是耐干燥和耐滲透脅迫的能力[26].細(xì)菌不斷地暴露在變化和壓力的環(huán)境中.全部調(diào)節(jié)系統(tǒng)的協(xié)調(diào)反應(yīng)使細(xì)菌能夠生存并適應(yīng)各種環(huán)境壓力[27].多因子和冗余分子機(jī)制參與了持久性和耐受性細(xì)胞的生成和生存[28-29]，其中最著名的耐壓機(jī)制包括應(yīng)激反應(yīng)、SOS反應(yīng)、抗氧化能力、毒素-抗毒素系統(tǒng)(TA)、群體感應(yīng)、能量代謝和藥物外排泵[29-32].最近有研究[15]表明，雖然 SOS反應(yīng)最初被認(rèn)為是調(diào)節(jié) DNA損傷修復(fù)，但其對(duì)細(xì)菌的耐受性也有著重要影響.在大腸桿菌中，SOS反應(yīng)在細(xì)胞持續(xù)形成的過(guò)程中增加了細(xì)菌的抗生素耐藥性[33-34].在阪崎克羅諾桿菌中，SOS反應(yīng)參與了生物膜的形成、K+的積累[35]、海藻糖和甜菜堿的合成[36]等過(guò)程，因此很可能經(jīng)由以上途徑間接參與該菌的耐干燥調(diào)控.然而到目前為止，在阪崎克羅諾桿菌中還沒(méi)有 SOS反應(yīng)基因參與耐干燥機(jī)制的報(bào)道.在大腸桿菌中，yebG基因被鑒定為一種新的SOS反應(yīng)調(diào)控基因[17]，而阪崎克羅諾桿菌中yebG基因的同源物ESA_01393基因可能通過(guò)SOS反應(yīng)參與該菌的耐干燥過(guò)程.

2.6 ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCC BAA-894受到UV照射和絲裂霉素C處理的影響

UV照射和絲裂霉素C處理后，比較阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的死亡率，結(jié)果如圖6所示.由圖6(a)可知：在短時(shí)間內(nèi)(5min和 10min)，菌株的 DNA受到損傷時(shí)，與野生型相比，ΔESA_01393菌株的死亡率顯著升高.由圖6(b)可知：當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間 UV照射(15min)和絲裂霉素C處理(30min)時(shí)，菌株的DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷，菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393顯示出相似的菌株死亡率，且死亡率均達(dá)到 90%以上.這可能是由于 DNA損傷比較嚴(yán)重，引起細(xì)菌細(xì)胞大量死亡.結(jié)果表明，阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因參與了DNA損傷修復(fù)過(guò)程.

圖6 UV照射和絲裂霉素C處理后，野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補(bǔ)株的死亡率比較Fig.6 Comparison of mortality rates of the WT，ΔESA_01393 and cpESA_01393 strain afterUV irradiation and treated with mitomycin C

細(xì)菌的 SOS反應(yīng)是一種廣泛存在的處理 DNA損傷的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[37].SOS反應(yīng)是由含有損傷的DNA 復(fù)制過(guò)程中單鏈 DNA 的積累引起的[38].當(dāng)DNA聚合酶在 DNA損傷處停止而復(fù)制解旋酶繼續(xù)解開(kāi)DNA時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA[39].SOS反應(yīng)需要多個(gè)基因的表達(dá)，這些基因在 DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮多種功能，包括切除修復(fù)、同源重組、翻譯DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂停止[12].DNA損傷修復(fù)后恢復(fù)正常生理狀態(tài)，DNA損傷較廣泛時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[40].因此，當(dāng)發(fā)生 DNA損傷時(shí)，細(xì)菌會(huì)激活 SOS反應(yīng)，以適應(yīng) DNA損傷壓力[41-42].最常見(jiàn)的引起 DNA損傷的因素包括了紫外線照射和復(fù)制抑制劑抗生素絲裂霉素 C暴露[43].研究[41-42]發(fā)現(xiàn)紫外線照射后的大腸桿菌通過(guò) SOS反應(yīng)進(jìn)行 DNA損傷修復(fù)，也有研究[9]表明yebG基因受SOS反應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)，但沒(méi)有明確該基因的功能.本研究證實(shí)了阪崎克羅諾桿菌中yebG基因的同源物ESA_01393基因參與UV照射和絲裂霉素C處理引起的DNA損傷修復(fù)過(guò)程，并發(fā)揮了重要的作用.

3 結(jié) 論

采用同源重組的方法敲除了阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因，并對(duì) ESA_01393基因的功能進(jìn)行研究.比較了阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及 cpESA_01393回補(bǔ)株在生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成、耐干燥性和 DNA損傷修復(fù)能力等方面的差異.研究發(fā)現(xiàn) ESA_01393基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成沒(méi)有明顯影響，但是可能作為細(xì)菌 SOS反應(yīng)的一部分，參與了該菌耐干燥和DNA損傷修復(fù)過(guò)程.本研究為了解阪崎克羅諾桿菌 ESA_01393基因的功能及其在阪崎克羅諾桿菌中的分子機(jī)制提供了參考.