宋冠林，王安琪，路來風(fēng), ，張 浩，李守輝，王昌祿,

(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程的推進(jìn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(加工)產(chǎn)生的固體廢物(主要組分為纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉等[1-2])已造成嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)面源污染.在肥料資源化過程中，單菌株發(fā)酵物料常出現(xiàn)營養(yǎng)分解利用不充分、腐熟不徹底等問題，而復(fù)合功能微生物中的酶類可協(xié)同作用于目標(biāo)物質(zhì)[3].市售的復(fù)合微生物菌劑主要為粉劑和粒劑[4]，具有易分散、運(yùn)輸穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，但酶活性較低；市售的高酶活塊狀復(fù)合菌劑較少.

目前，國內(nèi)已報道固體復(fù)合菌劑中溫(37℃)產(chǎn)羧甲基纖維素(CMC)酶的酶活力最高為 5289U/g[5].王勇[6]構(gòu)建了三元混合真菌復(fù)合腐熟劑，產(chǎn)纖維素酶的酶活力為 75.36U/g.有研究[7]表明，嗜冷菌對堆肥升溫有較好效果，且有更高酶活力的蛋白酶.彭宇等[8]以酶活力為 80U/g的中性蛋白酶菌劑 B生產(chǎn)甘蔗有機(jī)肥，可以明顯提高有機(jī)肥中的營養(yǎng)指標(biāo)及有效活菌含量.羅立津等[9]在耐低溫木質(zhì)纖維素降解菌群A25-3的基礎(chǔ)上補(bǔ)充釀酒酵母和綠色木霉制成固體復(fù)合菌劑，α-淀粉酶的酶活力為47.89U/g，可以有效提高堆肥體系的溫度，高效降解秸稈.為提高菌劑水解酶類酶活力、降低成本、延長菌劑保存時間，本研究以實(shí)驗(yàn)室專利菌株白黃鏈霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1與前期篩選出的優(yōu)勢菌構(gòu)建復(fù)合微生物體系，優(yōu)化發(fā)酵條件和多元輔料配比，得到酶活力較高的固態(tài)基質(zhì)，并在發(fā)酵前后合理補(bǔ)充助劑，經(jīng) 5L發(fā)酵罐放大，旨在建立一種新型水分散性生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的制備工藝，為進(jìn)行規(guī)?；逊侍峁┮环N可靠的生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與原料

白黃鏈霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)KC1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SY07、乳酸桿菌(Lactobacillus)RS1、綠色木霉(Trichoderma viride)LM1均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株.耐高溫蛋白分解菌 F19，從納米膜發(fā)酵雞糞有機(jī)肥中分離篩選.耐高溫纖維素分解菌 XWS2、硝化細(xì)菌 XN1、亞硝化細(xì)菌 YN3、硫化氫分解菌 HS1、硫化氫分解菌 HS2均從雞糞條垛堆肥中分離篩選，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJ1從安琪釀酒酵母粉中分離篩選.

麥麩、豆粕、稻殼，商丘馬培中食品有限公司；菌糠，天津市某食用菌公司；糠醛渣，日照苔上海洋生物科技有限公司；強(qiáng)興堆肥發(fā)酵菌劑，河南恒信農(nóng)化有限公司.

1.1.2 試劑與儀器

3，5-二硝基水楊酸(DNS)，天津百奧泰科技發(fā)展有限公司；三聚磷酸鈉(STPP)、木質(zhì)素磺酸鈉(CLF)，天津市江天化工科技有限公司；羧甲基纖維素，天津市百世化工有限公司；酪蛋白、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇 6000(PEG6000)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、糊精，北京索萊寶公司；海藻酸鈉(SA)，上海麥克林試劑公司；丙三醇、吐溫 80，天津康科德科技有限公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

Allegra X-30型臺式高速離心機(jī)，美國Beckman公司；Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀，瑞士 Tecan公司；Seven Easy型酸度計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司.

1.1.3 培養(yǎng)基

乳粉培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，脫脂乳粉 30，pH 7.0～7.2.

H2S選擇培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5.0，K2HPO40.5，KNO31.0，MgCl20.5，NaCl 0.5，NH4Cl 0.5，Na2CO31.0，F(xiàn)eCl20.01.在盛有50mL該培養(yǎng)基的250mL三角瓶中放置 1個 10mL離心管，離心管中加入 3mL 25% H2SO4和1g FeS，用于產(chǎn)生H2S.

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO41.0，NaCl 0.5，MgSO40.5，CaCl20.1，F(xiàn)eSO40.01，CoCl20.01.

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121℃滅菌20min.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多元輔料固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選

選取麥麩、菌糠、糠醛渣、稻糠(稻殼)、豆粕共 5種輔料，粉碎后以碳源與氮源質(zhì)量比為 1：1、碳氮比(C/N)為25設(shè)計基質(zhì)配比(表1).

表1 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)配制方案Tab.1 Program for solid-state fermentation substrate preparation

將 100g基質(zhì)置于 500mL三角瓶中，添加無機(jī)鹽培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)含水率為 40%～50%，121℃滅菌20min.將菌種活化后轉(zhuǎn)接至各自的種子培養(yǎng)基中：XWS2、F19、XN1、YN3、HS1、HS2、KC1、SY07 轉(zhuǎn)接至 LB 培養(yǎng)基[10]，LM1轉(zhuǎn)接至 PDB 培養(yǎng)基[11]，NJ1轉(zhuǎn)接至麥芽汁培養(yǎng)基[12]，RS1轉(zhuǎn)接至乳粉培養(yǎng)基，TD-1轉(zhuǎn)接至鏈霉菌 TD-1種子液培養(yǎng)基[11].菌株培養(yǎng)至對數(shù)期的 80%[13]，通過前期拮抗實(shí)驗(yàn)，確定菌懸液比例為 NJ1：SY07：TD-1：XWS2：F19：XN1：YN3：HS1：HS2：LM1：KC1：RS1＝3：3：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1，混合后得到混合菌液.將混合菌液以 10%的接種量接種至發(fā)酵基質(zhì)上，30℃發(fā)酵 7d，每天翻拌 1次，防止結(jié)塊，測定 CMC酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力.

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)C/N的確定

將篩選得到的高酶活固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)物料以 C/N為 15、20、25、30、35重新調(diào)整比例發(fā)酵.測定 CMC酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力.

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

在固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)基礎(chǔ)上，依據(jù)前期發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定各因素實(shí)驗(yàn)區(qū)間，參照L16(45)正交表調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，設(shè)置初始 pH(5、6、7、8)、培養(yǎng)溫度(25、30、35、40℃)、培養(yǎng)時間(5、7、9、11d)、接種量(5%、10%、15%、20%)、初始含水率(40%、50%、60%、70%)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件.

1.2.4 水分散性助劑篩選及用量的確定

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%的潤濕劑(SDS、PEG6000、SDBS)添加至最佳發(fā)酵產(chǎn)物上，加水混勻后裝入柱狀模具中壓緊，在鼓風(fēng)干燥烘箱中 40℃風(fēng)干至含水率為 15%，按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 1600—2001)進(jìn)行水分測定和監(jiān)控；再經(jīng)高速粉碎機(jī)破碎成粉，按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5451—2001)測定潤濕時間.調(diào)整潤濕劑添加量(1%、3%、5%)，確定潤濕劑種類和用量.

在含有潤濕劑的發(fā)酵產(chǎn)物上，添加分散劑(CMC、CLF、STPP)，方法同潤濕劑的實(shí)驗(yàn)方法，按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14825—2006)測定懸浮率，確定分散劑的種類及用量.

在含有潤濕劑、分散劑的發(fā)酵產(chǎn)物上，添加崩解劑〔CaCl2、(NH4)2SO4、SA〕，方法同潤濕劑的實(shí)驗(yàn)方法，崩解指標(biāo)分散次數(shù)的測定采用量筒混合法[14]，確定崩解劑的種類及用量.

在含有潤濕劑、分散劑、崩解劑的發(fā)酵產(chǎn)物上添加保護(hù)劑(丙三醇、吐溫 80、糊精)，方法同潤濕劑的實(shí)驗(yàn)方法，確定保護(hù)劑的種類和用量.

1.2.5 非離子表面活性助劑對菌劑發(fā)酵的影響

非離子表面活性助劑可以提高菌劑的發(fā)酵產(chǎn)酶活性，將 3% PEG6000、5%吐溫 80在發(fā)酵前加入，5% STPP、5%(NH4)2SO4在發(fā)酵后加入，分別在發(fā)酵第5天和第7天取樣烘干成型，測定3種水解酶的酶活力、水分散性指標(biāo).分別采用鋅氨絡(luò)鹽吸收比色法[15]和靛酚藍(lán)分光光度法[16]測定菌劑的 H2S去除率和NH3去除率.

1.2.6 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑制備工藝的放大

放大發(fā)酵前使用 75%乙醇對自制 5L發(fā)酵罐擦拭消毒，罐口覆 8層紗布.將裝料量由 100g/500mL放大為 1kg/5L，放大后的基質(zhì)不進(jìn)行滅菌處理.將發(fā)酵好的菌劑置于 1.5L泡沫箱中，碾壓成塊狀，其他發(fā)酵條件同 1.2.3節(jié)中最佳發(fā)酵條件、助劑添加時間與添加量同1.2.5節(jié)，將500mL三角瓶與5L發(fā)酵罐發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行比較.按照標(biāo)準(zhǔn) NY/T 798—2004《復(fù)合微生物肥料》中稀釋涂布平板法測定有效活菌數(shù)，按照標(biāo)準(zhǔn) GB 20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》測定pH.

1.2.7 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑貯藏穩(wěn)定性的測定

將生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑在 20～25℃密封貯存30d，檢測菌劑中的有效活菌數(shù)、水解酶的酶活力及除臭性能，評估生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的貯藏穩(wěn)定性.

1.2.8 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的豆粕堆肥效果驗(yàn)證

采用豆粕復(fù)配輔料稻殼粉、菌糠、香蕉皮粉進(jìn)行豆粕堆肥，調(diào)整 C/N 為 25：1，即 600g豆粕、150g菌糠、150g稻殼粉、9g香蕉皮粉.稱取909g混合物料裝入3L底部開孔的泡沫箱中，加入適量水將堆肥物料潤濕，按質(zhì)量比0.5%添加各類菌劑.實(shí)驗(yàn)組先將生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑溶于水中制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.99%的懸浮液，然后倒入堆肥物料中；對照組與空白組分別為向堆肥物料中直接撒入商業(yè)強(qiáng)興堆肥發(fā)酵菌劑菌粉與生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑未發(fā)酵基質(zhì)，調(diào)整含水率至60%，翻拌均勻，靜置發(fā)酵.

采用人工翻堆供氧，覆扎孔塑料薄膜保溫，將其置于 30℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵高溫期(50℃)前每2d翻堆 1次，進(jìn)入高溫期后待溫度下降即翻堆，使高溫期維持10d左右，揭膜覆蓋8層紗布，在發(fā)酵第40天測定堆肥品質(zhì)，按標(biāo)準(zhǔn) NY/T 525—2021《有機(jī)肥料》評價該生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑發(fā)酵效果.

1.3 水解酶類活性測定方法

1.3.1 CMC酶的酶活力測定

稱取10.0g固體菌劑，加入裝有100mL蒸餾水和玻璃珠的 500mL三角瓶中，靜置 20min，180r/min振蕩 30min，4000r/min離心 10min，上清液即為粗酶液，采用DNS法測定CMC酶[17]的酶活力.

1.3.2 中性蛋白酶的酶活力測定

參照 GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林酚法測定中性蛋白酶的酶活力.

1.3.3α-淀粉酶的酶活力測定

稱取 1.0g固體菌劑置于研缽中，加入少量二氧化硅和 2mL蒸餾水，研磨勻漿.將勻漿倒入離心管中，用 6mL蒸餾水分次將殘渣清洗并轉(zhuǎn)入離心管.提取液在室溫下靜置提取 15min，每隔 2min攪動 1次；4000r/min離心 10min，將上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液.采用DNS法測定α-淀粉酶[18]的酶活力.

1.4 菌劑其他指標(biāo)測定方法

1.4.1 除臭性能計算

考慮到菌劑可能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生不良?xì)怏w，設(shè)置 2個空白對照組，命名為 CK1、CK2.CK1為在NH3選擇培養(yǎng)基[19]與 H2S選擇培養(yǎng)基中不添加菌劑、添加外源臭味氣體組，CK2為在上述兩種培養(yǎng)基中添加菌劑、不添加外源臭味氣體組.實(shí)驗(yàn)組為上述兩種培養(yǎng)基中添加菌劑和外源臭味氣體組.按照式(1)和式(2)分別計算 NH3去除率(1r)和 H2S去除率(r2).

式中：G1、G2、G3分別為 CK1組、實(shí)驗(yàn)組、CK2組NH3釋放量，mg/L；G4、G5、G6分別為 CK1 組、實(shí)驗(yàn)組、CK2組H2S釋放量，mg/L.

1.4.2 有效活菌數(shù)及存活率計算

按照式(3)和式(4)分別計算有效活菌數(shù)(nm)和貯藏后有效菌存活率(r).

式中：n、n1分別為貯藏 30d前后菌劑的有效活菌數(shù)，g-1.

1.4.3 電導(dǎo)率的測定

將豆粕堆肥樣品與去離子水按質(zhì)量體積比 1：10混合，30℃、180r/min振蕩 30min，10000r/min離心 10min，用 0.45μm 濾膜過濾.用電導(dǎo)率儀測定上清液的電導(dǎo)率(σ).

1.4.4 終點(diǎn)C/N：初始C/N的測定

總碳(TOC)含量＝有機(jī)質(zhì)含量/1.732.總氮(TN)含量按照 H2SO4消解凱氏定氮法測定.有機(jī)質(zhì)含量參照NY/T 525—2021《有機(jī)肥料》中重鉻酸鉀容量法測定.

1.4.5 種子發(fā)芽指數(shù)的測定

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)按照標(biāo)準(zhǔn) NY/T 525—2021《有機(jī)肥料》測定.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用 SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)合鄧肯(Duncan)氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果與分析表中數(shù)據(jù)同列不同字母表示差異顯著(P＜0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)水解酶的酶活力測定結(jié)果見表2.

表2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)水解酶的酶活力Tab.2 Enzyme activity of solid-state fermentation substrate hydrolase

含有糠醛渣與菌糠的組合水解酶的酶活力較低.雖然糠醛渣含有大量有機(jī)質(zhì)[20]，可供給微生物生長所需營養(yǎng)，但其微孔結(jié)構(gòu)中酸度過大[21]，會抑制微生物的生長；菌糠為食用菌培養(yǎng)基殘渣，其粗纖維等組分已降解和轉(zhuǎn)化[22]，不足以提供微生物代謝所需養(yǎng)分.因此，選用麥麩和稻糠為碳源，豆粕為氮源作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì).

2.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)C/N的確定

麥麩、稻糠、豆粕發(fā)酵基質(zhì)比例見表3.

表3 麥麩、稻糠、豆粕發(fā)酵基質(zhì)比例Tab.3 Fermentation substrate ratio of wheat bran，rice bran and soybean meal

不同 C/N下固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)水解酶的酶活力結(jié)果見表4.當(dāng)初始C/N為25時，CMC酶和中性蛋白酶的酶活力均處于最低水平；C/N為 20時，CMC酶和α-淀粉酶的酶活力最高；C/N 為 30時，中性蛋白酶的酶活力最高.綜合考慮，選取C/N為20.

表4 不同C/N下固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)水解酶的酶活力Tab.4 Enzyme activity of solid-state fermentation substrate hydrolase under different C/N

2.3 固態(tài)發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以水解酶的酶活力為指標(biāo)，優(yōu)化初始 pH(A)、培養(yǎng)溫度(B)、培養(yǎng)時間(C)、接種量(D)、含水率(E)發(fā)酵條件，結(jié)果見表5.

表5 固態(tài)發(fā)酵條件正交優(yōu)化Tab.5 Orthogonal optimization of solid-state fermentation conditions

產(chǎn) CMC酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶的最佳發(fā)酵條件分別為 A3B2C4D1E4、A3B2C1D3E1、A4B2C2D1E4.綜合考慮，確定最佳發(fā)酵條件為方案 A3B2C2D1E1，即：初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間7d、接種量5%、含水率40%.以上述條件進(jìn)行驗(yàn)證，CMC酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力分別為 1878.6、203.8、37.0U/g，說明方法穩(wěn)定可行.

2.4 水分散性助劑的篩選

對固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的潤濕劑、分散劑、崩解劑進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖1所示.

圖1 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的潤濕劑、分散劑、崩解劑的篩選Fig.1 Screening of wetting agent，dispersant and disintegrating agent for solid fermentation substrate

潤濕時間及懸浮率是衡量分散劑效果的重要指標(biāo)[23].不同潤濕劑類別影響生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的潤濕時間，潤濕時間越短，說明潤濕效果越好.圖1(a)為添加 3種潤濕劑的生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的潤濕時間.當(dāng)選取 PEG6000為潤濕劑時，生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的潤濕時間最短.

懸浮率的測定用來確定菌劑的最高噴灑濃度，懸浮率越高則水分散性越高.圖1(b)為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)添加不同分散劑的懸浮率.分散劑為非離子表面活性劑 STPP時，菌劑懸浮率顯著高于各處理組(P＜0.05).

分散次數(shù)為崩解劑測定指標(biāo)，即將水中沉積物分散至不可再分散的顛倒次數(shù).圖1(c)為菌劑中添加不同崩解劑的分散次數(shù).結(jié)果表明，(NH4)2SO4作為崩解劑時分散次數(shù)最少，故崩解劑選用(NH4)2SO4.

在 40℃烘干時，測定 3種保護(hù)劑(丙三醇、吐溫80、糊精)對菌劑水解酶酶活力的保護(hù)作用，結(jié)果如圖2所示.當(dāng)選用丙三醇時，CMC酶的酶活力達(dá)1377.2U/g，CMC酶的酶活力增加量最大；當(dāng)選用吐溫80時，CMC酶的酶活力與其他兩種保護(hù)劑相比略低，無顯著性差異(P≥0.05)，但吐溫 80組的中性蛋白酶和α-淀粉酶的酶活力均為最高，與各處理組中性蛋白酶的酶活力和α-淀粉酶的酶活力差異顯著(P＜0.05).綜合考慮，選用非離子表面活性劑吐溫80作為保護(hù)劑.

圖2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)添加不同保護(hù)劑的水解酶的酶活力Fig.2 Hydrolytic enzyme activity of solid-state fermentation substrate with different protective agents

2.5 水分散性助劑用量的確定

助劑用量篩選單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6.由表6可知：助劑選用 3% PEG6000、5%STPP、5%(NH4)2SO4時，水分散性指標(biāo)最優(yōu).雖然需考慮生產(chǎn)成本，但用1% 吐溫 80時菌劑的中性蛋白酶的酶活力最高，CMC酶的酶活力與 5%吐溫 80相差甚大，故保護(hù)劑吐溫80的用量為5%.

表6 助劑用量的篩選Tab.6 Screening of the dosage of auxiliaries

2.6 非離子表面活性劑類助劑對菌劑發(fā)酵及質(zhì)量的影響

助劑中 PEG6000和吐溫 80為非離子表面活性劑，將這兩種助劑在發(fā)酵前添加，基質(zhì)發(fā)酵 5d、7d，烘干后的生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑各指標(biāo)測定結(jié)果見表7.與2.5節(jié)中CMC酶的酶活力相比，非離子表面活性劑不能加速基質(zhì)發(fā)酵進(jìn)程，生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑發(fā)酵7d產(chǎn)水解酶的酶活力顯著高于發(fā)酵5d(P＜0.05).菌劑中H2S分解菌HS1和HS2可有效去除H2S，亞硝化細(xì)菌 YN3和硝化細(xì)菌 XN1可抑制 NH3的逸出，將其轉(zhuǎn)化固定為離子，發(fā)酵 7d對臭味物質(zhì) H2S的去除率與發(fā)酵 5d相比有顯著性差異(P＜0.05)，兩組NH3去除率與水分散性差異不顯著(P≥0.05).

表7 非離子表面活性劑類助劑對發(fā)酵進(jìn)程的影響Tab.7 Effects of non-ionic surfactants on fermentation process

發(fā)酵前添加非離子表面活性劑(T組)對菌劑質(zhì)量影響結(jié)果見表8.發(fā)酵前添加非離子表面活性劑可在一定程度上提高水解酶的酶活力水平，特別是中性蛋白酶的酶活力可達(dá) 267.8U/g，與發(fā)酵后添加非離子表面活性劑(CK組)相比提高了 95.8%，亦可促進(jìn)臭味物質(zhì) H2S的吸收，但基本不影響生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的NH3吸收與其水分散性.

表8 發(fā)酵前添加非離子表面活性劑對菌劑質(zhì)量的影響Tab.8 Effect of adding non-ionic surfactants before fermentation on the quality of microbial agents

2.7 5L發(fā)酵罐放大制備生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑

將原有制備工藝放大，研究放大后指標(biāo)變化，結(jié)果見表9.放大后菌劑水解酶的酶活力、水分散性、除臭效果、有效活菌數(shù)均低于三角瓶發(fā)酵，5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn) CMC酶的酶活力、中性蛋白酶的酶活力、α-淀粉酶的酶活力、H2S去除率、有效活菌數(shù)，與500mL三角瓶發(fā)酵具有顯著性差異(P＜0.05).這說明放大發(fā)酵不易翻堆與拌勻，造成中心物料發(fā)酵不充分，基質(zhì)未經(jīng)滅菌，原著微生物同外源微生物發(fā)生拮抗作用.菌劑用作水分散劑時，推薦使用量為0.99%，生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑成品指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》.

表9 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑放大發(fā)酵后指標(biāo)變化Tab.9 Index changes of fermentation agent of bio-organic fertilizer after amplification and fermentation

2.8 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑貯藏穩(wěn)定性的測定

表10列出了生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑成品密封室溫貯藏 30d后指標(biāo)變化.貯藏后菌劑水解酶的酶活力發(fā)生了一定變化，CMC酶的酶活力由1247.3U/g提升至 1718.9U/g，主要由于貯藏時纖維素分解菌仍可利用菌劑基質(zhì)中殘留的營養(yǎng)物質(zhì)代謝；中性蛋白酶的酶活力顯著下降，可能由于自然條件下酶活力水平存在一定損失；有效活菌數(shù)隨時間的延長有所下降，雖與貯藏前相比有顯著性差異，但存活率達(dá)到了83.2%；α-淀粉酶的酶活力、水分散性指標(biāo)、除臭指標(biāo)、有效活菌數(shù)之間差異不顯著.貯藏30d的生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑成品指標(biāo)也均符合國家標(biāo)準(zhǔn) GB20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》.

表10 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑貯藏30d后指標(biāo)變化Tab.10 Index changes of fermentation agent of bio-organic fertilizer after 30 days storage

2.9 生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑在豆粕堆肥中效果驗(yàn)證

國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 525—2021《有機(jī)肥料》中規(guī)定腐熟有機(jī)肥技術(shù)指標(biāo)要求：含水率≤30%、pH 5.5～8.5、有機(jī)質(zhì)≥30%、總養(yǎng)分(TN+P2O5+K2O)≥4.0%、種子發(fā)芽指數(shù)(GI)≥70%.70% GI只能說明堆肥對作物抑制作用較?。籊I≥85%，才說明堆肥完全腐熟；當(dāng) GI≥100%時，堆肥對作物無毒性[24]；腐熟完全的堆肥要求σ＜9.0mS/cm、終點(diǎn) C/N：初始C/N＜0.6[25-26]，此時對種子發(fā)芽無抑制作用.本研究以 GI≥85%、σ＜9.0mS/cm、終點(diǎn) C/N：初始 C/N＜0.6為腐熟評判標(biāo)準(zhǔn).

30℃發(fā)酵40d后豆粕堆肥指標(biāo)測定結(jié)果見表11.添加生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑組(KJ)、強(qiáng)興發(fā)酵菌劑組(QX)含水率顯著低于對照組(CK).外源微生物代謝活躍促使堆肥溫度升高，揭膜后加速了水分蒸發(fā).堆肥發(fā)酵過程中，pH會呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢.在初始階段，由于可利用的能量物質(zhì)較多，微生物繁殖快，其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸使pH下降；堆肥繼續(xù)進(jìn)行，有機(jī)酸隨著溫度升高而揮發(fā)，同時，有機(jī)氮向銨態(tài)氮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的氨使pH又開始回升.堆肥有機(jī)質(zhì)含量反映了有機(jī)物分解菌的分解能力，其產(chǎn)生的水解酶類加速了有機(jī)質(zhì)的分解，可知KJ組和QX組中的分解菌在發(fā)酵過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，CK組中原有微生物分解能力較弱，發(fā)酵后 KJ組的有機(jī)質(zhì)最低，與CK組有顯著性差異.

表11 40 d生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑豆粕堆肥評價表Tab.11 Evaluation table of soybean meal composting with 40 d fermentation agent of bio-organic fertilizer

從表11結(jié)果來看，添加菌劑可在一定程度上增加養(yǎng)分，菌劑中未添加根際促生菌，但起升溫作用的微生物具備一定的養(yǎng)分分解釋放的作用，KJ組的TN含量、P2O5含量、K2O 含量均最高，同 CK 組差異均顯著.電導(dǎo)率反映堆肥浸提液中可溶性鹽的含量，KJ組和 QX組在發(fā)酵后可顯著降低堆肥的含鹽量.KJ組終點(diǎn)C/N∶初始C/N的值最小，腐熟更為徹底.KJ組在發(fā)酵后種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于QX組和CK組，堆肥中有機(jī)酸等中間產(chǎn)物和NH3、H2S等毒性物質(zhì)已被充分分解轉(zhuǎn)化.以上 3種堆肥產(chǎn)品均達(dá)到 NY/T 525—2021《有機(jī)肥料》的要求.

以腐熟度指標(biāo)電導(dǎo)率、終點(diǎn) C/N：初始 C/N、種子發(fā)芽指數(shù)為最終評價指標(biāo)，可得出腐熟度為 KJ組＞QX組＞CK組.這說明該生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑腐熟效果最優(yōu)，加速了堆肥腐熟.同時，總養(yǎng)分結(jié)果表明，KJ組和QX組的菌劑提高了堆體品質(zhì).

3 結(jié) 語

本文依托復(fù)合功能菌發(fā)酵多元輔料研制成一種水分散性生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑，該發(fā)酵菌劑基質(zhì)質(zhì)量比為 麥 麩 ： 稻 糠 ： 豆粕＝18：7：25，發(fā)酵條件為初始 pH 7.0、培養(yǎng)溫度 30℃、培養(yǎng)時間 7d、接種量5%、含水率 40%，在發(fā)酵前添加 3% PEG6000和 5%吐溫 80、烘干前添加 5%STPP和 5%(NH4)2SO4，經(jīng)5L發(fā)酵罐放大后產(chǎn)CMC酶的酶活力為1247.3U/g，中性蛋白酶的酶活力為 216.5U/g，α-淀粉酶的酶活力為 21.9U/g，H2S去除率為 58.7%，NH3去除率為63.1%，有效活菌數(shù)為 7.86×109g-1，潤濕時間為105.2s，懸浮率為 40.7%，分散次數(shù)為 7.3次，水分散用量為 0.99%，具有良好的貯藏穩(wěn)定性.菌劑應(yīng)用于豆粕堆肥中可加速腐熟，制備的生物有機(jī)肥堆體總養(yǎng)分(TN＋P2O5＋K2O)含量高達(dá) 5.54%，電導(dǎo)率為 2.67 mS/cm，終點(diǎn) C/N：初始 C/N 為 0.34，GI高達(dá)143.15%，符合國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 525—2021《有機(jī)肥料》的要求.所用固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)成分簡單、價格低廉、培養(yǎng)時間短、產(chǎn)水解酶的酶活力高，將水分散體系應(yīng)用于生物有機(jī)肥發(fā)酵菌劑開發(fā)，兼具制備方法簡易、成本低廉、分散性較好等優(yōu)點(diǎn)；攻克了傳統(tǒng)腐熟發(fā)酵菌劑發(fā)酵不充分、菌群單一、堆肥操作復(fù)雜等問題；適合規(guī)?；a(chǎn)，本工藝稍作優(yōu)化還可應(yīng)用于飼料添加劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有實(shí)際應(yīng)用意義.