黑乃恒 劉 鵬 陳彥平 靳琳玉 包 陽

舌鱗狀細胞癌在口腔癌中發(fā)病率最高，舌鱗狀細胞癌的發(fā)病率呈逐步上升的趨勢[1，2]，患病年齡也呈現(xiàn)出年輕化的勢頭[3，4]。舌鱗狀細胞癌患者5年生存率不足50%，惡性程度高，預(yù)后差。它的病因不明，危險因素主要包括遺傳因素、環(huán)境因素、局部不良刺激等。最新研究表明，這些危險因素繼續(xù)影響口腔組織細胞的生理環(huán)境，不同程度地導(dǎo)致分子表達異?；蛭蓙y，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括FAM83B的表達。FAM83B已被證實為EGFR/RAS信號通路的重要中介物并在多種癌癥中在mRNA水平高表達，包括乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、肺癌、睪丸甲狀腺癌和卵巢癌[5]。目前尚未對鱗狀細胞癌患者中其蛋白表達及其與臨床病理因素的關(guān)系進行詳細的研究，對FAM83B在舌鱗狀細胞癌中的表達及相關(guān)研究更是鮮有報道。本研究運用MTT實驗、劃痕愈合實驗、Ttanswell實驗和流式細胞技術(shù)分別評價敲低FAM83B舌鱗癌細胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力及凋亡的變化，初步探討FAM83B在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

資料和方法

1.材料

（1）細胞株：SCC-9、Cal-27人舌鱗狀細胞癌細胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。

（2）主要試劑及器械：Transwell小室(Corning)，TRIpure（BioTeke），F(xiàn)AM83B antibody（GeneTex），凝膠成像系統(tǒng)（北京六一，北京），熒光定量PCR儀（BIONEER，韓國）。

2.方法

（1）細胞培養(yǎng)：人舌鱗癌細胞系SCC-9和Cal-27培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱的條件設(shè)置為37℃，5% CO2將細胞置于其中培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細胞進行轉(zhuǎn)染。

（2）小干擾RNA引物設(shè)計、分組及轉(zhuǎn)染：根據(jù)FAM83B的基因序列，通過特異性siRNA引物設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計并篩選出了一條靶向FAM83B基因的siRNA（FAM83B siRNA，上游序列5＇-GCAACAAC GAATGCCAACC-3＇，下游序列5＇-ACGAAGCCGA GAATGAGTA-3＇），課題前期這部分工作先行已經(jīng)完成。同時設(shè)計不針對任何基因的隨機序列CsiRNA-NC 5＇-GGCACCCAGCACAATGAA-3＇，5＇-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3＇，以上序列均由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)實驗設(shè)計，設(shè)置A、B、C、D、E共5組，A未轉(zhuǎn)染組（Control）B陰性對照轉(zhuǎn)染組（NC）C siRNA-1轉(zhuǎn)染組（siRNA-1）D siRNA-2轉(zhuǎn)染組（siRNA-2）E siRNA-3轉(zhuǎn)染組（siRNA-3），先行利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染，48 h后，各組中FAM83B的干擾效率通過Western blot的檢測來完成。根據(jù)上述結(jié)果，選擇干擾效果最好的一組進行實驗。

（3）選擇干擾效果最好的1組作為實驗組、空載體轉(zhuǎn)染組作為陰性對照組、未轉(zhuǎn)染組為空白對照組，分別檢測各組的細胞增殖、遷移、侵襲能力及凋亡情況。

①MTT法檢測各組細胞增殖能力：將每組細胞接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，5×103個為設(shè)置的每孔細胞個數(shù)，待細胞貼壁后進行細胞轉(zhuǎn)染。將96孔板置于37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)0、24 h、48 h、72 h、96 h后進行MTT檢測，每孔加入20μL MTT染色液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，加入150μL DMSO以溶解細胞形成的紫色結(jié)晶，10 min的避光條件下靜置后在酶標(biāo)儀上測定其在570 nm處OD值，測定數(shù)據(jù)后進行分析。

②通過細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：將各組細胞利用200μL pipette tip造成細胞劃痕，通過清洗將細胞碎片清除，用顯微鏡按組觀察并拍照。準(zhǔn)備好37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱并將各組細胞置于其中培養(yǎng)并拍照記錄，記錄的時間點為0 h、24 h、48 h。

③細胞侵襲能力通過Transwell：實驗來測定每個樣本取5個在倒置顯微鏡下的視野，對侵襲至微孔膜下層的細胞計數(shù)，取均數(shù)。

④流式細胞術(shù)：收集各組轉(zhuǎn)染后細胞，離心、混勻、AV/PI雙染孵育后流式細胞儀檢測結(jié)果。

（4）統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用方差分析，多個樣本均數(shù)間的比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Western Blot檢測各組細胞中FAM83B蛋白表達結(jié)果

如圖1、圖2所示，A：未轉(zhuǎn)染組（Control）；B：陰性對照轉(zhuǎn)染組（NC）；C：siRNA-1轉(zhuǎn)染組（siRNA-1）；D：siRNA-2轉(zhuǎn)染組（siRNA-2）；E：siRNA-3轉(zhuǎn)染組（siRNA-3）與其他組相比，SCC-9和CAL-27兩細胞系中均是D組干擾RNA顯著降低了FAM83B蛋白水平。因此，筆者選擇D組干擾質(zhì)粒進行后續(xù)分析。將運用D組質(zhì)粒干擾后的SCC-9和CAL-27細胞定為實驗組C和C＇，與空白對照組（A組、A＇組）及陰性對照組（B組、B＇組）比較，實驗組SCC-9和CAL-27細胞中FAM83B表達量均明顯降低（均P＜0.05），即轉(zhuǎn)染成功，見圖3。

圖1 SCC-9細胞系中D組干擾RNA降低FAM83B蛋白水平最顯著

圖2 CAL-27細胞系中D組干擾RNA降低FAM83B蛋白水平最顯著

圖3 SCC-9和CAL-27兩細胞系RNA干擾后實驗組（C、C＇）FAM83B表達量均明顯降低

2.MTT法檢測增殖：實驗組下調(diào)FAM83B表達后與空白對照組及陰性對照組比較，實驗組SCC-9和CAL-27細胞OD值明顯低于對照組（均P＜0.05），見圖4、5。這表明下調(diào)FAM83B表達后，SCC-9和CAL-27細胞的體外增殖能力受到明顯抑制。

圖4 SCC-9細胞實驗組體外增殖能力明顯抑制，與空白對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。

圖5 CAL-27細胞實驗組體外增殖能力明顯抑制，與空白對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。

3.遷移能力變化：結(jié)果顯示FAM83B的敲低表達不但將愈合時間延長，對SSC-9、CAL-27的愈合能力也產(chǎn)生了較大影響，大大降低了愈合能力，與空白對照組及陰性對照組相比，細胞遷移能力顯著降低（均P＜0.05），見圖6、7。

圖6 通過劃痕實驗，實驗組SSC-9的愈合能力降低，與空白對照組和陰性相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。

圖7 通過劃痕實驗，實驗組CAL-27的愈合能力降低，與空白對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。

4.侵襲能力變化：使用Transwell檢測細胞的侵襲性，結(jié)果顯示，與空白或陰性對照細胞相比，F(xiàn)AM83B敲低顯著降低了細胞的侵襲性（均P＜0.05）見圖8。

圖8 Transwell檢測，SSC-9、CAL-27實驗組侵襲能力降低與對空白對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。

5.凋亡情況：流式細胞術(shù)AV/PI雙染顯示實驗組的凋亡率顯著高于對照組，轉(zhuǎn)染的SCC-9和CAL-27細胞凋亡率明顯升高（均P＜0.05），見圖9。表明FAM83B能抑制SCC-9和CAL-27細胞凋亡。

圖9 AV/PI雙染孵育后流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況：SSC-9、CAL-27實驗組凋亡明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。

討 論

舌鱗狀細胞癌的發(fā)病率高，早期即可發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)后差[6]。尋找舌鱗狀細胞癌有效的治療靶點是學(xué)者研究的熱點問題。最新研究顯示具有序列相似性83的家族（FAM83）成員在多種癌癥類型中具有致癌作用[7]，例如FAM83在多種人類腺癌中過表達，并促進腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[8]；最新研究顯示FAM83B可促進胃癌細胞的增殖[9]；FAM83B具有致癌作用可能與其含有DUF1669結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。FAM83B蛋白中的DUF1669結(jié)構(gòu)可以與CRAF結(jié)合，促進CRAF的膜定位從而增強MAPK信號。FAM83B蛋白還可與PI3K的亞單位和AKT結(jié)合，促進p110α和AKT的膜定位，從而增強AKT/m TOR信號[11]，因此針對MAPK和Akt/mTOR信號通路的靶向治療時，F(xiàn)AM83B的表達水平可作為一個很重要的參考因素[12]。并有可能成為的新靶點[13]。傳統(tǒng)的靶向藥只是針對某一種信號通路，但是各個信號通路之間其實都是相通的，彼此形成了一張關(guān)系網(wǎng)，阻斷其中一條會導(dǎo)致另外一條信號通路激活[14]。若只針對某一信號通路進行治療，必然導(dǎo)致耐藥。FAM83B可以同時作用于AKT/mTOR和MAPK信號系統(tǒng)，若抑制FAM83B的表達，從理論上來講可以同時抑制AKT/m TOR和MAPK這兩條信號系統(tǒng)。目前針對MAPK和Akt/m TOR信號通路的靶向治療目前已應(yīng)用于多種腫瘤的臨床試驗。FAM83家族成員對舌鱗癌細胞細胞功能的作用機制研究鮮有報道，近期有學(xué)者做了關(guān)于FAM83家族成員和頭頸部腫瘤關(guān)系的研究，Ji[15]等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83A的表達與頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床腫瘤分期呈正相關(guān)；郭靖等研究發(fā)現(xiàn)[16]，涎腺導(dǎo)管癌的發(fā)生可能與FAM83H的過表達存在關(guān)聯(lián)。筆者的研究結(jié)果初步表明，敲低FAM83B的表達可以對舌鱗狀細胞癌細胞的增殖、侵襲和遷移起到抑制作用，對細胞凋亡起到促進作用，但這一作用的具體調(diào)控途徑有待進一步研究。FAM83B有可能成為舌鱗狀細胞癌靶向治療新的靶點，為舌鱗狀細胞癌的治療提供新的思路。