王錦航 彭士雄 趙建廣 陳彥平 崔子峰

頭頸癌在全球發(fā)病率中排第七位，其中口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）較為多見[1]。近年對于OSCC的治療方案不斷更新，如在常規(guī)治療中聯(lián)合免疫、靶向治療等新模式，這使得部分患者的無瘤生存期延長，但總體患者的五年生存率卻沒有顯著改變，仍保持在50~60%[2]，因此仍有必要闡明OSCC發(fā)生或進展的潛在分子機制。

E2F1是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)控細胞周期、凋亡和DNA修復等過程，在乳腺癌、肺癌和胃癌等多數(shù)癌癥中被證明高表達可以促進癌癥的發(fā)生或進展[3]。survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族成員，在正常組織中低表達或不表達，但在多數(shù)癌癥中卻呈高表達，這一特性使其成為癌癥治療中潛在的理想靶標[4]。p53可通過誘導細胞凋亡或細胞周期停滯起到腫瘤抑制因子的作用，但在多數(shù)癌癥中編碼p53蛋白的TP53基因發(fā)生突變，產(chǎn)生突變型p53（mutant p53,mutp53），使原本的腫瘤抑制作用部分或完全喪失，從而促進惡性轉(zhuǎn)化[5]。通過以上三者的特征推測，它們在OSCC中可能也發(fā)揮著重要的作用，因此本研究擬通過免疫組化檢測E2F1、survivin和mutp53蛋白在OSCC中的表達情況，并探討三者表達以及與患者臨床病理特征間的相關(guān)性，為OSCC發(fā)生或進展機制的闡明提供新思路。

資料與方法

1.病例資料

收集于2013年1月至2014年12月間，52例經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的OSCC患者腫瘤組織及相應癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2.0 cm）樣本，詳細臨床病理資料見表1。所有患者術(shù)前均未接受任何腫瘤相關(guān)治療，且術(shù)后組織樣本由至少兩名病理科醫(yī)師獨立進行診斷，證實腫瘤組織具有典型鱗癌形態(tài)（圖1）以及癌旁為正常組織。該研究已通過河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會審批（編號：2020KY283），患者均已簽署知情同意書。

圖1 OSCC組織（HE，A×200，B×400）

表1 52例OSCC患者的臨床病理資料

2.免疫組化染色和結(jié)果判定

取OSCC和相應癌旁樣本的石蠟包埋組織，制成4μm的組織切片。SP試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京）行E2F1/survivin/mutp53蛋白的免疫組化染色。石蠟包埋的組織切片在二甲苯中脫蠟，100%~75%的梯度乙醇溶液中再水化，3% H2O215 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.1M EDTA（pH8.0）/枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）100℃2 min行抗原修復，正常羊血清封閉15 min。接下來，將切片與1：25的E2F1抗體（ab4070；NeoMarkers，USA）/1：50的survivin抗體（BM3975；博士德公司，武漢）/1：50的mutp53抗體（sc47698；普利萊基因技術(shù)有限公司，北京）4℃過夜，PBS沖洗后加入二抗（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京）37℃15 min。然后，將切片用DAB顯色（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京），使用蘇木精染色溶液復染1 min，置于80%~100%梯度乙醇溶液中脫水后，中性樹膠封片。最后，在顯微鏡下觀察染色的組織切片并捕獲圖像進行分析。以PBS緩沖液替代一抗的陰性切片作為陰性對照，E2F1、mutp53蛋白陽性表達為細胞核內(nèi)呈棕褐色的顆粒，survivin蛋白陽性表達為細胞質(zhì)或細胞核中呈棕黃色的顆粒。

判定標準為5個高倍鏡視野中計算100個腫瘤細胞中蛋白表達的陽性細胞百分比，＜5% 0分，5%～＜25% 1分，25%～＜50% 2分，51%～75% 3分，＞75% 4分；染色水平，無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項評分相加為每例標本蛋白表達的積分：0～1分 陰性（-），2～3分 弱陽性（+），4～5分 中度陽性（++），6～7分 強陽性（+++）。免疫組化結(jié)果至少由2名病理科醫(yī)師在雙盲情況下觀察所得。

3.統(tǒng)計學處理

應用SPSS（v17.0）軟件行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料由n表示。表達差異應用χ2檢驗分析，表達間的相關(guān)性應用Spearman等級相關(guān)性分析，與臨床病例特征的相關(guān)性應用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗（兩組間）和非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗（多組間）分析。結(jié)果均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.E2F1、survivin和mutp53蛋白在OSCC和癌旁組織中的表達差異分析

E2F1（圖2）、mutp53（圖3）的陽性產(chǎn)物呈深褐色顆粒位于細胞核，survivin（圖4）的陽性產(chǎn)物呈棕黃色的顆粒多數(shù)位于細胞核。分析結(jié)果由表2所示，E2F1、survivin和mutp53蛋白在OSCC組織中的陽性表達率分別為75.00%（39/52）、88.50%（46/52）和82.70%（43/52），均高于相應癌旁組織（P＜0.001）。

表2 免疫組化檢測E2F1、survivin和mutp53蛋白的表達

圖2 E2F1在OSCC和癌旁組織中的表達

圖3 mutp53在OSCC和癌旁組織中的表達

圖4 survivin在OSCC和癌旁組織中的表達

2.OSCC組織中E2F1與survivin、mutp53蛋白表達間的相關(guān)性分析

對OSCC組織中E2F1、survivin和mutp53蛋白免疫組化結(jié)果行Spearman等級相關(guān)性分析。結(jié)果由表3所示，OSCC組織中E2F1蛋白的表達與survivin（rs＝0.446，P＝0.001）和mutp53（rs＝0.386，P＝0.005）蛋白的表達均呈正相關(guān)。

表3 OSCC中E2F1與survivin、mutp53蛋白表達間的相關(guān)性

3.OSCC組織中E2F1、survivin和mutp53蛋白表達水平與患者臨床病理特征間的相關(guān)性分析

分析結(jié)果由表4所示，E2F1蛋白的表達水平與OSCC患者的性別（P＝0.5864）、年齡（P＝0.352）、細胞分化（P＝0.089）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.097）和腫瘤分期（P＝0.247）均無相關(guān)性。survivin蛋白表達水平與OSCC患者的細胞分化（P＝0.005）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）及腫瘤分期（P＜0.001）相關(guān)，但與年齡（P＝0.385）和性別（P＝0.693）無關(guān)。mutp53蛋白表達水平與OSCC患者的細胞分化（P＝0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）及腫瘤分期（P＜0.001）相關(guān)，但與年齡（P＝0.875）和性別（P＝0.838）無關(guān)。

討 論

E2F1作為調(diào)控數(shù)千個下游靶基因的轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中起著重要作用，其異常表達可影響腫瘤細胞的代謝重編程或腫瘤進展[6]。Jiang等[7]研究表明，E2F1可通過影響葡萄糖攝取、乳酸或ATP產(chǎn)生來調(diào)節(jié)尤因肉瘤細胞中的有氧糖酵解途徑以促進病情發(fā)展，可作為潛在的治療靶點。Chen等[8]的研究中，E2F1在腎透明細胞癌中呈高表達，并且其高表達與患者的總生存期和無進展期較短有顯著相關(guān)性，表明E2F1可能起到促癌作用。但另有研究卻發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)論，如在前列腺癌中E2F1充當腫瘤抑制因子的角色[9]，這可能取決于不同病理組織的特異性。盡管在多種癌癥中E2F1的功能已經(jīng)得到明確，但尚未證實其在OSCC發(fā)生或惡性進展中是否發(fā)揮作用。本研究通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)E2F1蛋白在OSCC中呈高表達，可能發(fā)揮促癌基因的作用。但在進一步分析與OSCC患者臨床病理的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，E2F1的高表達與性別、年齡、細胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期均無相關(guān)性。這與Shen等[10]研究結(jié)論相似，E2F1在胃癌組織中的表達高于低級別上皮內(nèi)瘤變組織，但與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、浸潤深度和遠處轉(zhuǎn)移等因素均無相關(guān)性，提示E2F1的突變過表達可能發(fā)生在癌變早期，待完全轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒院笃浔磉_則無明顯變化。因此，本研究推測OSCC中E2F1蛋白的高表達可能也是癌變早期的關(guān)鍵步驟，值得進一步探討證實。

為挖掘可能與E2F1發(fā)揮協(xié)同作用的異常活化蛋白，研究選擇了具有E2F結(jié)合位點的survivin蛋白進行分析[11]。作為IAP家族中最小的成員，survivin在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用，但在多數(shù)終末分化的組織中表達卻是沉默的，這使得成年人中survivin的表達被視為癌癥的首要指標[12]。而survivin同時也是p53的直接靶標，這也從p53的抑制作用解釋了成年人體內(nèi)缺乏survivin的原因[13]。作為一種強大的癌癥抑制因子，p53可通過促進細胞生長停滯、DNA修復以及調(diào)節(jié)自噬或代謝等方式來保護基因組[14]，然而編碼p53腫瘤抑制蛋白的TP53基因約在50%的人類癌癥中高度突變，導致完整p53蛋白中的單個氨基酸被取代而產(chǎn)生mutp53，使原本具有的腫瘤抑制作用部分或完全喪失，并獲得獨立于野生型p53的新致癌活性[15，16]。本研究先行通過免疫組化檢測了survivin和mutp53蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)兩者均在OSCC中呈高表達，并且都與患者的細胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)，其中強陽性例數(shù)隨細胞分化越低、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期越高等因素而增多。進一步經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，E2F1蛋白的表達水平與survivin和mutp53蛋白的表達水平均呈正相關(guān)。這些實驗驗證了本研究之前假設(shè)，survivin和mutp53的異常高表達狀態(tài)可能在OSCC的發(fā)生或進展中與E2F1發(fā)揮著協(xié)同作用。