李珍珍 柴文宇 殷亮亮 李春年

活髓保存材料的選擇對于治療的成功與否具有很大影響，理想的活髓保存材料應(yīng)具有良好的抗菌性、生物相容性、密封性、可誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成、低孔隙度和溶解度以及易于操作等特點(diǎn)，然而至今，仍沒有任何一種材料能夠擁有所有這些特性[1，2]。目前臨床上使用的蓋髓材料包括氫氧化鈣類（如Dycal）、硅酸鈣基材料類（如MTA、iRoot BP Plus）、樹脂基類材料、玻璃離子類及生物因子材料類（如骨形成蛋白，BMPs）。

iRoot BP Plus是一種預(yù)混合型的新型生物陶瓷類材料，其操作簡單，固化時(shí)間短，可以增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的粘附、遷移、附著、增殖和礦化能力[3]。近年來大量研究[4～6]表明BMPs、VEGF、TGF-β等在牙本質(zhì)修復(fù)機(jī)制中起著重要的作用，可以促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖以及成牙本質(zhì)/成骨的分化，其中BMP-2是BMPs家族中最具活性的信號蛋白之一[7]，可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，在活髓保存方面具有很大前景。BMP-2、iRoot BP Plus作為常見誘導(dǎo)因子在牙髓細(xì)胞增殖分化方面是否存在差異，兩者聯(lián)合應(yīng)用是否可發(fā)揮協(xié)同作用，尚無研究證明。所以本研究通過BMP-2、iRoot BP Plus、BMP-2與iRoot BP Plus聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞，探究牙髓細(xì)胞牙本質(zhì)化過程中BMP-2與iRoot BP Plus之間的相互作用及影響以期為活髓保存材料的選擇提供實(shí)驗(yàn)參考。

材料與方法

1.主要試劑及儀器

胎牛血清（BI公司，以色列）；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；Mouse Anti-Human CD34-FITC、Mouse Anti-Human CD45-FITC、IgG-FITC（BioLegend公司，美國）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；Eastep? Super總RNA提取試劑盒（上海普洛麥格生物制品有限公司，中國）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒、一管式反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2*Universal SYBR Green qPCR Premix（上海圣爾生物科技有限公司，中國）；倒置相差顯微鏡（TH4-200，OLYMPUS，日本）；酶標(biāo)儀（Synergy-TH，Biotech，美國）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time System，Thermo，美國）。

2.牙髓細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

（1）牙髓細(xì)胞分離、培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)已通過河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號為[2020]027，且經(jīng)過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。

選取我院口腔頜面外科門診，患者年齡為12～20歲，因阻生或者正畸而拔除的新鮮的完整的第三磨牙或前磨牙，1小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移至無菌實(shí)驗(yàn)室，將新鮮的離體牙用含有1%雙抗的PBS沖洗三次，去除表面的血漬，如有多余的牙齦組織則先用眼科剪去除；然后將離體牙沿牙體長軸劈開，用拔髓針取出牙髓組織，并用眼科剪剪去根尖約2 mm的組織；將剩余的牙髓組織放入含有1%雙抗的PBS中清洗三次，放入少量DMEM的培養(yǎng)液，并用眼科剪將牙髓組織剪成體積約1 mm3的組織塊；之后將牙髓組織轉(zhuǎn)移至含有3 mg/mLⅠ型膠原酶和4 mg/mL的中性蛋白酶的離心管中，吹打均勻，37℃水浴消化15分鐘，每5分鐘輕輕震蕩一次，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中；將培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每三天換液，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況；待細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶底約80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

（2）流式細(xì)胞儀法進(jìn)行牙髓細(xì)胞的鑒定：取生長狀態(tài)良好、細(xì)胞形態(tài)正常的2代牙髓細(xì)胞，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化后，1000 r/min，離心5分鐘，去上清，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，制備成單細(xì)胞懸液；取3個(gè)EP管，每管加入100 uL細(xì)胞懸液，分別加入CD34、CD45以及陰性對照IgG各5 uL，4℃避光孵育20分鐘；PBS清洗離心后，每管加入300 uL PBS重懸細(xì)胞；流式細(xì)胞儀對3組樣本表面標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行鑒定。

3.條件培養(yǎng)液配制

（1）配制0.2 mg/mL iRoot BP Plus培養(yǎng)液：取0.5 g預(yù)混即用型iRoot BP Plus置于無菌模具中，放入37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，待其完全固化，研磨成粉，過篩備用。將研磨后的iRoot BP Plus粉末與25 mL DMEM培養(yǎng)液混合，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育7天，每24 h震蕩5 min。將iRoot BP Plus混合液離心，收集上清，0.22 um濾菌器過濾除菌，配制成20 mg/mL iRoot BP Plus浸提液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量20 mg/mL iRoot BP Plus浸提液加入DMEM培養(yǎng)液，稀釋成0.2 mg/mL iRoot BP Plus培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）配制100 ng/mL BMP-2培養(yǎng)液：按照說明書將10 ug BMP-2凍干粉溶于100 uL超純水中，配制成濃度為100 ng/uL的BMP-2溶液，分裝成10份，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∫环?00 ng/uL的BMP-2溶液，加入10 mL DMEM培養(yǎng)液，配制成100 ng/mL的BMP-2培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）配制100 ng/mL BMP-2與0.2 mg/mL iRoot BP Plus混合培養(yǎng)液：取一份100 ng/uL的BMP-2溶液，加入5 mL DMEM培養(yǎng)液，配制成200 ng/mL的BMP-2培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆?。取適量20 mg/mL iRoot BP Plus浸提液加入DMEM培養(yǎng)液，稀釋成0.4 mg/mL iRoot BP Plus培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆?。取適量200 ng/mL的BMP-2培養(yǎng)液，加入等量的0.4 mg/mL iRoot BP Plus培養(yǎng)液，混勻后配制成100 ng/mL BMP-2與0.2 mg/mL iRoot BP Plus混合培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.實(shí)驗(yàn)分組

A組：空白對照組，含常規(guī)DMEM培養(yǎng)液。

B組：0.2 mg/mL iRoot BP Plus培養(yǎng)液。

C組：0.2 mg/mL iRoot BP Plus與100 ng/mL BMP-2混合培養(yǎng)液。

D組：100 ng/mL BMP-2培養(yǎng)液。

5.BMP-2、iRoot BP Plus對牙髓細(xì)胞增殖的影響

取生長狀態(tài)良好的3-5代牙髓細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔100 uL接種于96孔內(nèi)；24 h后吸去DMEM培養(yǎng)液后，隨機(jī)分為四組分別處理牙髓細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)副孔，隔天換液；分別在培養(yǎng)第1、3、5、7 d時(shí)用酶標(biāo)儀檢測450 nm時(shí)各孔的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并繪制細(xì)胞生長曲線。

6.BMP-2、iRoot BP Plus對牙髓細(xì)胞分化的影響

（1）堿性磷酸酶（ALP）活性檢測：取生長狀態(tài)良好的3-5代牙髓細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，隨機(jī)分為四組分別處理牙髓細(xì)胞，分別于培養(yǎng)第7天及14天時(shí)，每孔加入0.1% TritonX-100裂解液200 uL，收集混合液加入96孔板中，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書加入50 uL待測樣本及50 ul顯色底液，37℃孵育30 min后加入100 uL終止液，酶標(biāo)儀405 nm處檢測各組OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（2）qPCR檢測各組牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)化相關(guān)基因的表達(dá)：取生長狀態(tài)良好的3-5代牙髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為四組分別處理牙髓細(xì)胞，隔天換液，分別于第5天及7天提取各組牙髓細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，通過qPCR分析各組牙髓細(xì)胞DSPP、BSP、ALP的RNA相對表達(dá)量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 qPCR基因引物序列

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS26.0軟件對各組數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），Graphpad Prism5進(jìn)行繪圖。

結(jié) 果

1.牙髓細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

（1）牙髓細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)結(jié)果：分離的牙髓組織通過改良組織塊酶消化法接種24h后，倒置顯微鏡下可觀察到有散在的細(xì)胞貼壁生長（圖1①），3天后可以觀察到有細(xì)胞從組織塊周圍爬出，以組織塊為中心，呈放射狀生長，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，有突起，細(xì)胞核呈圓形，居中（圖1②）；7天后細(xì)胞逐漸融合，即可生長至培養(yǎng)瓶底的80%（圖1③）；傳代后2代細(xì)胞鏡下可見細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，較均一，呈放射狀或者漩渦狀生長（圖1④）。

圖1 hDPCs形態(tài)觀察（ ×100）

（2）人牙髓細(xì)胞鑒定結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：培養(yǎng)的hDPCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44（94.07%）表達(dá)呈陽性，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34（0.35%）表達(dá)呈陰性，表明所培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測hDPCs表面標(biāo)記物

2.BMP-2、iRoot BP Plus對牙髓細(xì)胞增殖影響的結(jié)果

各組細(xì)胞貼壁后生長狀態(tài)穩(wěn)定，A組牙髓細(xì)胞生長曲線呈“S”形，接種后3天進(jìn)入對數(shù)生長期，7天后進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長狀態(tài)良好；誘導(dǎo)1天后，各組細(xì)胞OD值比較無明顯差異（P＞0.05）；誘導(dǎo)3天后，B、C、D組OD值均高于A組OD值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中C組OD值最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組與D組之間無明顯差異（P＞0.05）；誘導(dǎo)5天后，各組細(xì)胞增殖較快，B、C、D組OD值均高于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中C組OD值最高，B組與D組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；誘導(dǎo)7天后，各組細(xì)胞增殖速度減緩，各組之間均有明顯差異（P＜0.05），其中C組OD值最高，其次依次是D組、B組，A組OD值最低，見圖3。

圖3 CCK8檢測細(xì)胞增殖曲線

3.BMP-2、iRoot BP Plus對牙髓細(xì)胞分化影響的結(jié)果

（1）堿性磷酸酶（ALP）活性檢測結(jié)果：誘導(dǎo)7天及第14天時(shí)，B、C、D組ALP活性均高于A組，其中C組最高，D組次之，最后是B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)第14天較第7天相比各組ALP活性均上調(diào)，見圖4。

圖4 ALP活性檢測

（2）qPCR檢測各組牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)化相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果：誘導(dǎo)5天時(shí)，與A組相比除BSP基因相對表達(dá)量無明顯差異外（P＞0.05），ALP、DSPP基因mRNA相對表達(dá)量均提高，其中C組顯著高于B、D組，D組高于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；誘導(dǎo)7天時(shí)，各組基因表達(dá)均上調(diào)，各實(shí)驗(yàn)組DSPP、ALP、BSP基因mRNA相對表達(dá)量均高于A組，其中C組高于B、D組，D組高于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 qPCR檢測各組牙髓細(xì)胞第5天及第7天（①）ALP，（②）BSP，（③）DSPP的相對表達(dá)量

討 論

活髓保存的目的是保護(hù)牙髓，促進(jìn)具有正常生理功能的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的形成，維持牙齒的穩(wěn)定。牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體起源于胚胎時(shí)期的外胚間充質(zhì)，主要由成牙本質(zhì)細(xì)胞組成，不僅可以修復(fù)硬組織，還可以修復(fù)牙髓本身的軟組織，包括血管生成和神經(jīng)源性修復(fù)[8]。有研究表明iRoot BP Plus可促進(jìn)暴露牙髓部位鈣橋的形成，并促進(jìn)人牙髓細(xì)胞增殖，在生物相容性方面與MTA相似甚至更高[8～10]。BMP-2也可促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖，并影響其早期向成骨細(xì)胞/成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，在修復(fù)過程中的不同部位和階段均有不同的表達(dá)量[11～14]。同時(shí)BMP-2還可與其他誘導(dǎo)因子發(fā)揮協(xié)同作用，劉彩宏等人[15]發(fā)現(xiàn)BMP-2與生長因子TGF-β1聯(lián)合后可提高人牙周膜干細(xì)胞中成骨相關(guān)基因Runx2、ALP、OCN的蛋白及mRNA表達(dá)量；陸彥玲等人[16]發(fā)現(xiàn)BMP-2與糖皮質(zhì)激素地塞米松聯(lián)合后可明顯促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖，提高相關(guān)基因ALP、DSPP、DMP-1 mRNA相對表達(dá)量。那么BMP-2是否可以聯(lián)合iRoot BP Plus在牙髓細(xì)胞增殖分化過程中起到作用呢？因此，我們設(shè)計(jì)并進(jìn)行了此次研究。

本研究通過BMP-2、iRoot BP Plus、BMP-2與iRoot BP Plus聯(lián)合作用于牙髓細(xì)胞，經(jīng)CCK-8細(xì)胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)第1天時(shí)各組牙髓細(xì)胞OD值之間無明顯差異，第3、5、7天時(shí)C組OD值均高于其它各組，其中第3天、第5天時(shí)B組與D組之間無明顯差異，第7天時(shí)D組OD值明顯高于B組OD值，我們可以得出結(jié)論：BMP-2、iRoot BP Plus均能促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖，且BMP-2促進(jìn)作用優(yōu)于與iRoot BP Plus，兩者聯(lián)合后可能起到協(xié)同作用，較單獨(dú)使用BMP-2或者iRoot BP Plus更能促進(jìn)人牙髓細(xì)胞增殖。關(guān)于BMP-2、iRoot BP Plus可對牙髓細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用的結(jié)果與大多數(shù)研究[15～18]相一致，同時(shí)有研究指出iRoot BP Plus由于其低細(xì)胞毒性的原因隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長可能對牙髓細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響[19]，這有可能是導(dǎo)致本研究中第7天時(shí)D組OD值明顯高于B組OD值的原因。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）在羥磷灰石晶體的形成過程中具有重要的作用，是參與牙本質(zhì)礦化重要的非膠原蛋白之一，其活性在成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞礦化的初始階段上調(diào)，因此ALP可作為牙髓干細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物[20，21]。本研究中ALP活性檢測結(jié)果顯示第7天及第14天時(shí)，C組ALP活性均高于B組及D組，且D組高于B組，同時(shí)第14天較第7天相比各組ALP活性均上調(diào)；qPCR結(jié)果顯示第5天和第7天時(shí)C組ALP基因相對表達(dá)量最高，其次是D組、B組，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長ALP的相對表達(dá)量持續(xù)增長，有研究指出ALP在人牙髓干細(xì)胞處于分化初始階段，未表達(dá)相關(guān)特異性牙本質(zhì)蛋白時(shí)即可檢測到，同時(shí)ALP表達(dá)量的上調(diào)與誘導(dǎo)時(shí)間的延長及牙髓干細(xì)胞的增殖活躍性密切相關(guān)[22]，這與本研究結(jié)果相一致。

牙本質(zhì)唾液磷蛋白(dentin salivary phosphoprotein，DSPP）是主要的牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，具有高度磷酸化的特性，是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的特異性標(biāo)記物[23，24]。有研究指出DSPP在牙本質(zhì)的早期礦化過程中有重要的作用，能夠調(diào)控牙本質(zhì)礦化，誘導(dǎo)礦化晶體形成[25]。骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）是成牙本質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞礦化檢測的特征性標(biāo)記物，是參與牙本質(zhì)礦化重要的非膠原蛋白之一，主要是在成熟的骨組織中呈高表達(dá)，是成牙本質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞分化晚期的標(biāo)志性蛋白，因此在誘導(dǎo)早期呈現(xiàn)低表達(dá)量[26]。本研究中qPCR結(jié)果顯示第5天和第7天時(shí)C組DSPP基因相對表達(dá)量最高，其次是D組、B組，且隨著時(shí)間的延長各處理組的DSPP基因相對表達(dá)量上調(diào)，第5天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組BSP基因相對表達(dá)量較對照組均無明顯差異，但在第7天時(shí)三組實(shí)驗(yàn)組BSP基因相對表達(dá)量均上調(diào)，且C組最高，其次依次為D組、B組。以上結(jié)果提示BMP-2與iRoot BP Plus聯(lián)合可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞成功向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，促使人牙髓細(xì)胞分泌更多的礦化基質(zhì)，且作用效果較單獨(dú)使用BMP-2、iRoot BP Plus效果更佳。有研究表明直接應(yīng)用BMP-2或其下游轉(zhuǎn)錄因子的激活因子，可通過上調(diào)DSPP基因的表達(dá)來增強(qiáng)再生牙本質(zhì)橋的形成[27]。同時(shí)Lu等人[28]也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IRoot BP Plus可明顯促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞中礦化相關(guān)基因DSPP、COL1、BSP、OPN、ALP的表達(dá)量，這與本研究結(jié)果相一致。

同時(shí)郭冕等人[29]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可通過介導(dǎo)MAPK通路和BMP/Smad通路從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且有研究表明iRoot BP Plus可通過MAPK通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨/牙源性分化[28]，那么我們可以有理由推測BMP-2與iRoot BP Plus聯(lián)合后可通過MAPK通路發(fā)揮協(xié)同作用，高效誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞增殖、分化，但是其中涉及的轉(zhuǎn)錄因子等機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究探討。同時(shí)本研究中采用的iRoot BP Plus提取物是根據(jù)以往查閱的參考文獻(xiàn)[30]并加以改良制作，而不是直接應(yīng)用該材料，所以iRoot BP Plus對牙髓組織的作用效果有待進(jìn)一步研究。

總之通過本研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2較iRoot BP Plus在誘導(dǎo)hDPCs增殖、分化方面更具優(yōu)勢；兩者聯(lián)合可發(fā)揮協(xié)同作用，較單獨(dú)使用對人牙髓細(xì)胞增殖及成牙本質(zhì)分化有明顯促進(jìn)作用。