孫亦軒, 王俊力, 邵 衛(wèi),

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué), 湖北 武漢 430065 2.湖北省武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430030)

阿爾茨海默病(AD)是嚴(yán)重的全球健康問題，發(fā)病率很高，而其發(fā)病機制假說眾多，有Aβ級聯(lián)假說、膽堿能假說、Tau蛋白異常磷酸化假說、神經(jīng)炎癥假說、金屬離子紊亂假說等，但仍未能有效解釋AD的發(fā)病過程。越來越多的文獻(xiàn)表明Keap1-Nrf2-ARE信號通路與AD的病理變化之間可能存在聯(lián)系。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)-核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)信號通路被認(rèn)為是多器官防御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控過程。通過探討Keap1-Nrf2-ARE信號通路如何調(diào)控氧化還原分子以及與AD的聯(lián)系，這可能有助于發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病機制以及一些靶向此途徑的化合物，也可能可以提供新的治療策略。

1 氧化應(yīng)激與AD

氧化應(yīng)激是由于活性氧(ROS)，如過氧化氫、次氯酸、超氧自由基和羥基自由基的增加而導(dǎo)致體內(nèi)氧化水平超過抗氧化防御而發(fā)生的損害。大量的報告表明，活性氧和氧化應(yīng)激在AD中通過具有有害的生物分子，特別是蛋白質(zhì)在起作用。而氧化應(yīng)激中的中心環(huán)節(jié)就是線粒體的功能失調(diào)。有科學(xué)家根據(jù)觀察AD患者中的線粒體功能失調(diào)從而提出了線粒體級聯(lián)假說，該假說指出，在散發(fā)性遲發(fā)性AD中，與年齡相關(guān)的線粒體功能喪失會影響APP的表達(dá)和處理，從而引發(fā)積累[1]。線粒體功能障礙已在AD中得到充分證明，在多個家族性AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的胚胎神經(jīng)元中已經(jīng)觀察到異常的線粒體軸突運輸，在淀粉樣斑塊或記憶損傷發(fā)生之前檢測到線粒體分裂、融合和功能的異常[2]。活性氧產(chǎn)生和抗氧化防御之間的平衡對正常細(xì)胞功能至關(guān)重要。然而，在AD中，抗氧化酶的活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致氧化損傷的無限制累積。當(dāng)不平衡時，ROS的過度產(chǎn)生和抗氧化防御不足相結(jié)合會導(dǎo)致氧化應(yīng)激。有證據(jù)表明，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加的線粒體損傷出現(xiàn)在AD臨床癥狀出現(xiàn)和病理學(xué)出現(xiàn)之前的早期階段[3]。研究者們還在死后的腦組織和外周系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了RNA、細(xì)胞核和線粒體DNA的氧化修飾，包括AD和ApoE4攜帶者臨床前或早期階段的細(xì)胞和分離線粒體[4]。線粒體活性氧可破壞線粒體膜電位，加速同一細(xì)胞器內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，因此，一小部分細(xì)胞器中活性氧生成的增加足以將活性氧損傷傳播到其他線粒體，最終影響整個細(xì)胞。因為在AD中觀察到了大量的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，就有科學(xué)家提出了通過抗氧化來治療AD。而Keap1-Nrf2-ARE信號通路就是細(xì)胞氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵通路，其調(diào)控的下游靶蛋白NQO1、HO-1等在抗氧化中起著非常重要的作用，且大量研究發(fā)現(xiàn)Nrf2信號通路與AD之間存在關(guān)聯(lián)，這可能有助于發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病機制。

2 Keap1-Nrf2-ARE信號通路概述

核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)是堿性區(qū)亮氨酸拉鏈型轉(zhuǎn)錄因子的帽狀n領(lǐng)(CNC)亞家族，1994年由P Moi等首次分離。Nrf2蛋白包含七個Nrf2 ECH同源(Neh)結(jié)構(gòu)域。Neh1結(jié)構(gòu)域是與小Maf蛋白二聚的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于Nrf2 N端的Neh 2結(jié)構(gòu)域通過DLG和ETGE基序介導(dǎo)與Keap1的相互作用，并包含七個賴氨酸殘基，它們是泛素化的目標(biāo)。Neh 3、Neh 4和Neh 5域是反式激活域，Neh 6結(jié)構(gòu)域是一個調(diào)節(jié)Nrf2穩(wěn)定性的富含絲氨酸的區(qū)域，Neh 7結(jié)構(gòu)域參與維甲酸X受體α(RXRα)結(jié)合[5]。

Nrf2分離五年后，Ken Itoh等首先命名Keap1，并確定Keap1通過結(jié)合Nrf2抑制抗氧化反應(yīng)元件的核激活。Keap1是基于Cullin 3(Cul3)的泛素E3連接酶的適配器亞單位。生理學(xué)上，Keap1與Nrf2結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2處于非活性且易于降解的狀態(tài)。當(dāng)受到自由基或化學(xué)應(yīng)激刺激時，Keap1-Cul3復(fù)合物的泛素E3連接酶活性下降，Nrf2從Keap1-Nrf2-ARE復(fù)合物解離并進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，導(dǎo)致ARE下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，包括許多抗氧化和解毒酶的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)表達(dá)[6]。

ARE，也稱為β-萘黃酮響應(yīng)元件(β-NF-RE)，分為四類。Ⅰ類和Ⅲ類基因由AP-1激活，而Ⅰ類和Ⅱ類基因由Nrf2誘導(dǎo)。ARE是對抗氧化應(yīng)激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心部分。Keap1/Nrf2/ARE途徑控制抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵成分的表達(dá)，以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，如GSH和TXN、血紅素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶(NQO1)。該信號通路調(diào)節(jié)100多個與抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞存活相關(guān)的基因和功能的表達(dá)，包括直接抗氧化蛋白、Ⅰ期和Ⅱ期親電解毒酶、有毒溶質(zhì)的運輸、自由基代謝、炎癥抑制、谷胱甘肽內(nèi)穩(wěn)態(tài)，蛋白酶體功能、DNA損傷識別以及各種相關(guān)生長因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[7]。

3 Keap1-Nrf2-ARE信號通路與AD的關(guān)系

Keap1-Nrf2-ARE途徑現(xiàn)在被認(rèn)為是AD和其他神經(jīng)退行性疾病的有希望的靶點。首先，Keap1-Nrf2-ARE途徑與一些與AD相關(guān)的標(biāo)記分子的表達(dá)密切相關(guān)，例如Aβ、tau蛋白等。其次，Keap1-Nrf2-ARE途徑與參與AD發(fā)展的其他途徑密切相關(guān)，如乙酰膽堿酯酶傳遞、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥等。

3.1Nrf2與Aβ:β淀粉樣蛋白(Aβ)是AD病人腦內(nèi)老年斑周邊神經(jīng)元沉積的病理產(chǎn)物，是AD的重要病理因素。Nrf2基因缺失的APP/PS1小鼠表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)增強，同時APP、Aβ1-42和Aβ1-40的細(xì)胞內(nèi)水平升高，來自Nrf2缺陷APP/PS1小鼠的神經(jīng)元也表現(xiàn)出內(nèi)小體、溶酶體和多泡體的增加積累[8]。這些發(fā)現(xiàn)為Nrf2在APP/Aβ加工和積累以及自噬功能障礙中的作用提供了線索。Kerr等證明通過特異性抑制Keap1激活Nrf2可防止AD引發(fā)的Aβ42肽引起的神經(jīng)元毒性[9]。Yu等的一項研究也顯示了在AD動物模型中使用Nrf2激活劑異落新婦苷可以使Aβ1-42水平和p-tau均降低[10]。Bahn等發(fā)現(xiàn)，Nrf2通過結(jié)合BACE1啟動子中的AREs抑制AD動物模型中BACE1的表達(dá)。Nrf2激活降低BACE1轉(zhuǎn)錄物和Aβ的產(chǎn)生，并改善認(rèn)知缺陷。另一方面，Nrf2的缺失增加了BACE1的表達(dá)和Aβ的生成，并加重了認(rèn)知缺陷。作者還披露，BACE1的Nrf2調(diào)節(jié)獨立于ROS抑制[11]。這項研究不僅將Nrf2的功能與Aβ的產(chǎn)生聯(lián)系起來，而且還揭示了Nrf2抑制BACE1的能力。相反，該研究還表明Nrf2不影響γ-分泌酶的活性或表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，Nrf2激活不僅抑制Aβ的產(chǎn)生，而且還減少了其聚集引起的損傷。

3.2Nrf2與p-tau:Tau病理學(xué)被認(rèn)為是AD認(rèn)知能力下降和神經(jīng)退行性變的主要驅(qū)動因素。Jo等的一項研究表明，Nrf2可以通過誘導(dǎo)核點蛋白52(NDP52)來降低p-tau的水平。NDP52是一種自噬銜接蛋白，其誘導(dǎo)促進(jìn)自噬介導(dǎo)的p-tau降解。Jo等還揭示了這種Nrf2活性的機制，其結(jié)果是Nrf2與NDP52啟動子中的AREs結(jié)合[12]。最近，還有科學(xué)家報道Nrf2調(diào)節(jié)選擇性自噬過程，有助于清除tau。他們觀察到老化的Nrf2-/-動物中BAG3、NBR1、NDP52和p62的表達(dá)與年輕Nrf2-/-中的動物比較顯著降低，表明Nrf2在衰老期間維持這些基因的適當(dāng)表達(dá)水平方面起著關(guān)鍵作用[13]。許多Nrf2激活劑，如富馬酸二甲酯和大蒜素對p-tau AD動物模型顯示出積極作用[14,15]。

3.3Nrf2與神經(jīng)炎癥:小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥為AD病理學(xué)的一大重要特征。在AD中，Aβ斑塊區(qū)域附近的小膠質(zhì)細(xì)胞可能被慢性激活，且NF-κB水平升高，從而導(dǎo)致持續(xù)分泌有害的促炎癥細(xì)胞因子和ROS/RNS，這些過程加速了神經(jīng)退行性變。此外，Terada等還觀察到AD患者海馬旁神經(jīng)炎癥與tau病理直接正相關(guān)[16]。所有這些發(fā)現(xiàn)表明，神經(jīng)炎癥可能在AD的進(jìn)展和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，消除神經(jīng)炎癥可能會減少AD的進(jìn)展和癥狀。在神經(jīng)炎癥中NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生(IL-6、COX2和iNOS)，而Nrf2誘導(dǎo)基因主要是抗炎(包括CD36、IL-17D)。在這種情況下，Nrf2和NF-κB之間的不平衡可能對AD的發(fā)病機制很重要。因此，Nrf2可能在AD中發(fā)揮有價值的抗炎作用。一些研究證實，Nrf2激活可抑制Aβ或tau注射引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)元損傷[17]。

3.4Nrf2與乙酰膽堿酯酶:乙酰膽堿(ACh)是一種在神經(jīng)末梢釋放的有機神經(jīng)遞質(zhì)。乙酰膽堿在膽堿能神經(jīng)元中由乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)產(chǎn)生，ChAT使用乙酰輔酶A和膽堿作為底物。釋放后，乙酰膽堿通過乙酰膽堿酯酶(AChE)代謝為膽堿和醋酸鹽。在AD患者的大腦中觀察到乙酰膽堿水平的缺乏和乙酰膽堿酯酶水平的增加。乙酰膽堿通過乙酰膽堿酯酶的快速水解終止膽堿能突觸的脈沖傳遞。因此，降低活性乙酰膽堿酯酶水平可以增強膽堿能功能。盡管沒有明確的證據(jù)表明Nrf2對乙酰膽堿酯酶的影響，但幾種Nrf2激活劑在AD小鼠模型中顯示出對膽堿能功能的積極影響，同時乙酰膽堿酯酶水平降低，乙酰膽堿和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶水平顯著升高[18]。Zhang等發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡開始時，乙酰膽堿酯酶存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞死亡時，乙酰膽堿酯酶存在于細(xì)胞核或凋亡小體中。此外，使用藥理抑制劑降低活性乙酰膽堿酯酶的水平可以抑制細(xì)胞凋亡。他們得出結(jié)論，乙酰膽堿酯酶可能是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物和調(diào)節(jié)器[19]。這可能解釋了AD腦內(nèi)高水平的乙酰膽堿酯酶是因為越來越多的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Nrf2的抗凋亡作用可減少膽堿能神經(jīng)元的丟失，膽堿能神經(jīng)元可維持乙酰膽堿的產(chǎn)生，從而最大限度地減少神經(jīng)認(rèn)知能力的下降。然而，需要進(jìn)一步研究乙酰膽堿酯酶在細(xì)胞凋亡中的作用以及Nrf2激活對乙酰膽堿酯酶功能和分布的影響。

3.5Nrf2與線粒體功能障礙:線粒體是一種靈活的超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞器，控制著關(guān)鍵分子元素的生物能量流動。線粒體的整體動力學(xué)性質(zhì)由融合和分裂兩種活動控制。融合通過抑制線粒體斷裂，可以延緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而分裂在細(xì)胞凋亡中起著積極的作用。線粒體質(zhì)量控制過程中的不平衡可能導(dǎo)致線粒體功能障礙。在Nrf2基因敲除小鼠中觀察到與年齡相關(guān)的線粒體氧化應(yīng)激以及受損的線粒體功能，而Nrf2激活增強了線粒體功能，抑制了線粒體抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)的表達(dá)[20]。線粒體功能障礙在AD早期發(fā)生，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變，促進(jìn)突觸損傷和凋亡。APP、Aβ和p-tau可干擾線粒體成分，導(dǎo)致線粒體動力學(xué)異常、生物發(fā)生缺陷、自噬減少、線粒體吞噬減少、ATP生成受損和氧化損傷增加，Nrf2可減少這些損傷并維持線粒體功能。Nrf2在線粒體保護(hù)中的作用是Nrf2激活在AD治療中的另一個有益作用。

4 Nrf2激活劑在AD臨床試驗中的應(yīng)用

自1906年AD出現(xiàn)以來，F(xiàn)DA只批準(zhǔn)了5種治療AD的藥物，分別是他克林、利凡斯的明、加蘭他敏、多奈哌齊和美金剛。前四種藥物均是乙酰膽堿酯酶抑制劑，后一種是一種N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，常用于治療中重度AD。然而，這些藥物均不能終止或逆轉(zhuǎn)AD的進(jìn)程，且具有廣泛的副作用。

Nrf2可直接或間接干擾Aβ和p-tau，Mangialasche在2010年提出了多靶點治療AD，運用的是乙酰膽堿酯酶抑制劑與抗氧化劑或NMDA受體拮抗劑一起給予，前面也提到Nrf2激活后可以起到抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種作用，所以使用單一的Nrf2激活劑可能比聯(lián)合多種藥物更降低成本、副作用更少，藥物相互作用更少。已經(jīng)有許多天然的或是合成的Nrf2激活劑在神經(jīng)退行性疾病的實驗室研究或臨床前模型得到驗證[21]。最近，一些參與AD臨床試驗的藥物也被證明能激活Nrf2。2014年，苯磷硫胺被納入AD臨床試驗。四年后，Tapias等證明，在P301S AD活體模型中，苯磷硫胺可以激活Nrf2，并降低p-tau[22]。在FDA批準(zhǔn)的可激活Nrf2的藥物中，富馬酸二甲酯被認(rèn)為是治療AD的有希望的藥物。富馬酸二甲酯在不同的AD模型中表現(xiàn)出積極作用，包括黃腐酚、小豆蔻素和綠原酸這些天然存在的藥物，都可以通過Nrf2激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)能力。Nrf2的特異激動劑特丁基對苯二酚在實驗中被發(fā)現(xiàn)可以通過激活Nrf2/ARE信號通路進(jìn)而降低可溶性Aβ水平從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用并可以誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的產(chǎn)生，這表明Nrf2在AD中可以清除病理性沉積物。目前，數(shù)十種天然和合成Nrf2激活劑可用于進(jìn)一步深入研究其在AD模型中的作用。這些化合物可能是藥物開發(fā)的良好起點。通過化學(xué)修飾有可能改善這些分子的化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，以達(dá)到更好的治療效果。

5 展 望

Nrf2信號通路是抗氧化的主要通路，調(diào)控著Ⅱ期解毒酶和抗氧化蛋白的生成，Nrf2在AD中除了能改善氧化應(yīng)激狀態(tài)外，大量證據(jù)還表明其能改善炎癥、抑制乙酰膽堿酯酶與線粒體功能障礙，除此之外，其還能抑制Aβ、p-tau等AD病理產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以，研制出Nrf2的激活劑似乎能實現(xiàn)多靶點、多途徑、多通路的治療作用，但是,Nrf2通路本身很復(fù)雜，可以通過不同的機制激活，且現(xiàn)有的Nrf2激活劑因其下游作用廣泛，往往會產(chǎn)生很多副作用，所以，研究如何更好的激活Nrf2以及減少副作用可能是今后研究的重中之重。