畢炯炯，馬英杰

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450003 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

肝纖維化被認(rèn)為是各種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。在各種致病因素作用下，肝內(nèi)靜止的星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，形成纖維性疤痕，最終進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，直接影響患者預(yù)后。因該過程具有可逆性，早期逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程對慢性肝病的治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，各種癌癥、慢性肝病、神經(jīng)退行性疾病、代謝相關(guān)疾病和免疫疾病的發(fā)病機(jī)制與自噬功能障礙或過度的自噬相關(guān)。自噬通量的增加可減緩肝纖維化進(jìn)程，但二者間的作用關(guān)系仍存在爭議。同樣，在急性或慢性肝病的病理生理學(xué)過程中外泌體也發(fā)揮重要作用。外泌體可與自噬相互協(xié)調(diào)，通過溶酶體降解或直接釋放到細(xì)胞外來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在酒精性肝病動物模型中發(fā)現(xiàn)，自噬抑制以及自噬體和溶酶體功能受損與外泌體生成增多有關(guān)。同樣，外泌體有與自噬通量合作感知細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的能力。因此，外泌體和自噬之間通過相互關(guān)聯(lián)來支持細(xì)胞存活，而這種關(guān)聯(lián)過程是維持肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)，但其中的相關(guān)機(jī)制尚未被闡明。

1 HSCs與肝纖維化

肝纖維化主要是由于ECM過度沉積，其中HSCs激活是關(guān)鍵。生理狀態(tài)下，HSCs呈靜止?fàn)顟B(tài)，位于肝竇周Disse間隙內(nèi)，是維生素A的主要儲存場所。肝損傷后，鄰近肝細(xì)胞通過旁分泌釋放大量細(xì)胞因子(如TGF-β、PDGF、IL-1β等)作用于HSCs，使其向肌成纖維母細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致HSCs增殖和激活,產(chǎn)生大量的ECM。同時(shí)，其自身還伴有TGF-β、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型纖維膠原、MMPs、TIMPs等細(xì)胞因子分泌的增加，促使HSCs在體內(nèi)持續(xù)激活，并通過其分泌的TIMPs抑制ECM的分解,從而促進(jìn)肝纖維化，進(jìn)一步加重肝損傷[1]?；罨腍SCs具有促炎和促纖維化特性。此外，HSCs激活后，其分泌的MMPs及其內(nèi)源性抑制劑TIMPs表達(dá)的不平衡也可影響肝纖維化進(jìn)程。MMP家族負(fù)責(zé)ECM所有成分的逆轉(zhuǎn)和降解。其中MMP-12、MMP-19能促進(jìn)纖維化，MMP-1、MMP-8、MMP-13具有抗纖維化特性，表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，減輕纖維化。在肝纖維化過程中，HSCs的活化過程除了通過各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)外，還與損傷刺激下誘導(dǎo)的各種信號通路有關(guān)，如TGF-β/Smads信號通路、NF-κB信號通路、PI3K/AKT/mTOR信號通路、Hedgehog信號通路等。深入了解影響HSCs活化的因素是肝纖維化防治的重要策略。

2 自噬與肝纖維化

自噬是一種存在于所有有核細(xì)胞中的分解代謝過程，具有高度的保守性，主要通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)的大分子和細(xì)胞器，對細(xì)胞的生存、分化、生長及內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要意義。在肝纖維化過程中，自噬參與HSCs活化的機(jī)制逐漸被認(rèn)識，其對HSCs可能具有雙重作用。

2.1通過參與脂滴降解，促進(jìn)肝纖維化:自噬通過參與脂滴降解，為激活HSCs提供能量，增加ECM釋放，直接促進(jìn)肝纖維化。在肝纖維化小鼠模型中，脂多糖誘導(dǎo)的自噬通過介導(dǎo)AKT-MTOR和AMPK-ULK1途徑，促使HSCs中自噬體形成和自噬通量增加，誘導(dǎo)脂滴消化，降低視黃醇水解成游離脂肪酸，進(jìn)一步氧化，為激活HSCs提供能量，并下調(diào)Bambi的表達(dá)，增加HSCs對TGF-β的纖維化反應(yīng)的敏感性[2]，促進(jìn)纖維化。相反的，蝦青素被發(fā)現(xiàn)能抑制自噬，通過向下調(diào)控NF-κB的表達(dá)和翻譯，抑制HSCs能量供應(yīng)，緩解肝纖維化[3]。因此，激活HSCs自噬可促進(jìn)纖維化。

2.2通過抗炎作用，抑制肝纖維化:自噬也能負(fù)向調(diào)控HSCs的激活，通過抗炎作用，抑制肝纖維化。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，自噬抑制劑3-MA可抑制NF-κB易位入核，降低炎癥細(xì)胞的浸潤和膠原的沉積，改善肝纖維化[4]。自噬與肝纖維化之間的作用關(guān)系仍存在爭議。此外，在肝纖維化進(jìn)程中，因細(xì)胞類型的差異，自噬具有不同的特性。肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞(liver endothelial cells，LSECs)中自噬基因Atg7缺失導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，使其抗氧化應(yīng)激能力下降，加重纖維化，但過度的自噬激活可導(dǎo)致caveolin-1降解，損傷LSECs的防御功能，最終促進(jìn)纖維化化[5]。因此，LSECs中任何自噬失調(diào)都可能加重肝纖維化。自噬在肝纖維化過程中可能發(fā)揮促纖維化和抗纖維化雙重作用，選擇性調(diào)控纖維化細(xì)胞的自噬可能是未來抗纖維化治療新方法。

3 外泌體分泌與肝纖維化

外泌體是由晚期核內(nèi)體或多囊泡體的膜向內(nèi)出芽形成，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNAs、miRNAs和lncRNAs等多種載體，這些生物活性物質(zhì)能從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，從而調(diào)控受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，并介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。由外泌體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)和miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)是肝纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵機(jī)制。在肝纖維化過程中，外泌體可介導(dǎo)并促進(jìn)相鄰的HSCs、LSECs、Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞之間細(xì)胞間通信的分泌功能，從而誘導(dǎo)HSCs的激活和遷移。外泌體的數(shù)量及種類會受到肝臟微環(huán)境改變的影響。大量研究證實(shí)HSCs可作為外泌體的受體細(xì)胞發(fā)揮作用。如：肝細(xì)胞外泌體miR-27a負(fù)向調(diào)控PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬，促進(jìn)HSCs的活化和增殖，從而加速代謝相關(guān)脂肪性肝病的纖維化。巨噬細(xì)胞外泌體miR-103-3p可被鄰近的HSCs吸收，并通過抑制KLF4因子促進(jìn)HSCs的激活[6]。不同細(xì)胞來源的外泌體可通過調(diào)控自噬或者靶向調(diào)節(jié)信號通路等途徑，抑制HSCs活化，緩解肝纖維化。來自人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來阻止HSCs的激活，降低α平滑肌肌動蛋白(SMA)和I型膠原蛋白的表達(dá),減少膠原積累，抑制炎癥，增加肝細(xì)胞再生，從而改善肝功能，減緩肝纖維化[7]。脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體miR-181-5p通過抑制HSCs的活化，靶向作用于Stat3和Bcl2，從而增加自噬，減少TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)程[8]。NK細(xì)胞外泌體miR-223可以通過降低自噬基因Atg7水平，抑制自噬，從而阻止TGF-β1誘導(dǎo)的HSCs激活[9]。此外，HSCs也可作為外泌體的供體細(xì)胞。HSCs的外泌體miR-214可以穿梭于HSCs和肝細(xì)胞之間，調(diào)節(jié)小鼠原代肝細(xì)胞中的CCN2表達(dá)，而外泌體miRNA-199a-5p則靶向調(diào)節(jié)CCN2，抑制HSCs中纖維生成信號通路。目前關(guān)于HSCs作為外泌體供體細(xì)胞的作用以及這些外泌體對肝臟微環(huán)境影響的研究較少。

4 外泌體和自噬在肝纖維化中的關(guān)聯(lián)

自噬分子參與晚期核內(nèi)體的分布，外泌體的釋放以及核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的組成也與自噬體的成熟有關(guān)。此外，外泌體不但可以通過封裝自噬蛋白作為載物來影響自噬水平，還可以通過介導(dǎo)相關(guān)信號通路，如mTOR信號通路、TGF-β1/Smads信號通路等參與自噬調(diào)控。同樣的，自噬通量增加會抑制外泌體的釋放并誘導(dǎo)其溶酶體降解。兩種途徑交叉調(diào)控，影響著各種疾病的發(fā)展，且環(huán)境依賴性是影響二者相關(guān)作用的關(guān)鍵因素。

4.1外泌體調(diào)控自噬：外泌體對自噬的影響取決于其親代細(xì)胞和刺激條件。二者可能協(xié)同作用來對抗細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。在急性肝衰竭中應(yīng)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以顯著降低caspase-3和Bax的水平，并上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而減輕肝細(xì)胞凋亡并促進(jìn)自噬。脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以通過激活自噬來改善肝纖維化。過表達(dá)的miR-29a可以通過降低LC3BII和p-ULK的水平來減輕自噬，從而減輕BDL小鼠的肝損傷和纖維化[10]。由此可見，外泌體可通過傳遞特定的miRNA調(diào)控靶細(xì)胞自噬，來促進(jìn)疾病的病理生理學(xué)進(jìn)程。目前尚未確定自噬受損的肝細(xì)胞是否會釋放特定的外泌體來影響肝纖維化進(jìn)程。

4.2外泌體調(diào)控自噬相關(guān)信號通路

4.2.1mTOR信號通路：Zou[11]等發(fā)現(xiàn)mTOR作為mTOR信號通路的下游信號分子，直接負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬的同時(shí)又能通過下調(diào)外泌體標(biāo)記物來抑制肝細(xì)胞中的外泌體釋放。在不利條件下，mTOR通路受到抑制，外泌體與自噬均上調(diào)。Gao[12]等發(fā)現(xiàn)，PDGF及其下游信號分子SHP2能夠抑制mTOR內(nèi)源性抑制劑REDD1的表達(dá)，從而增強(qiáng)mTOR信號和外泌體釋放。相反，mTOR信號通過抑制自噬和激活ROCK1信號通路促進(jìn)外泌體釋放。這些外泌體可誘導(dǎo)HSCs的遷移，導(dǎo)致促纖維化信號的放大。mTOR信號通路是抑制還是誘導(dǎo)外泌體分泌仍存在爭議，最終作用可能與靶細(xì)胞類型有關(guān)。此外，外泌體可以與自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子PI3K/Akt/mTOR或AMPK/mTOR通路相互作用，分別通過減少過度自噬或誘導(dǎo)自噬來促進(jìn)細(xì)胞生存[13]。

4.2.2TGF-β1/Smads信號通路:TGF-β1是導(dǎo)致肝纖維化的重要細(xì)胞因子之一。外泌體可通過下調(diào)TGF-β1/Smads信號通路來抑制自噬，改善肝纖維化。來自MSCs的外泌體miR-618通過負(fù)向調(diào)控Smad4來抑制肝纖維化的進(jìn)展[14]。外泌體miR-122通過下調(diào)TGF-β1/Smad信號通路來抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[15]。過表達(dá)的miR-210能負(fù)向調(diào)節(jié)Smad4，增加缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞凋亡[16]。相反的，脂多糖處理的巨噬細(xì)胞外泌體中高表達(dá)的miR-500可靶向抑制MFN2，從而通過TGF-β/Smads信號通路促進(jìn)HSC的增殖和活化，加速肝纖維化。血清外泌體miR-500可作為晚期肝纖維化診斷的生物標(biāo)志物。

4.2.3Hedgehog信號通路:Hedgehog信號通路主要由Hh配體、蛋白受體Ptc與Smo、轉(zhuǎn)錄因子Gli組成[17]。由于自噬，凋亡的肝細(xì)胞可以釋放大量的Hh配體，這些配體與HSCs上的相關(guān)受體結(jié)合，最終激活Hh信號通路和HSCs，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。在原發(fā)性肝癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，Gli1誘導(dǎo)MIRLET7BHG轉(zhuǎn)錄的激活，上調(diào)Smo，并經(jīng)原發(fā)性肝癌來源的外泌體傳遞，介導(dǎo)hedgehog途徑激活HSCs，從而促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生，為治療原發(fā)性肝癌提供了一條新的途徑[17]。

4.2.4其他信號通路：NF-κB信號通路多參與炎癥反應(yīng)，而關(guān)于肝纖維化的研究較少?，F(xiàn)有研究認(rèn)為下調(diào)NF-κB信號通路可抑制自噬，緩解肝纖維化。外泌體miR-378通過上調(diào)NF-κB通路促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[18]。Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)與HSCs活化有關(guān)。在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以通過Wnt/β-catenin信號通路抑制HSCs的活化，從而改善纖維化。外泌體miR-30a通過靶向Beclin-1信號通路抑制自噬，在心肌梗死和肝纖維化中發(fā)揮重要作用。

4.2.5lncRNA/miRNA/自噬相關(guān)基因軸：外泌體lncRNAs可以通過lncRNA/miRNA/自噬相關(guān)基因軸或miRNA/自噬相關(guān)基因軸影響自噬水平，促進(jìn)纖維化程度。Xie[19]等發(fā)現(xiàn)敲除原發(fā)性肝癌中高表達(dá)的lncRNA-SNHG7后，miR-29b表達(dá)下調(diào)，DN-MT3A表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)HSCs活化和自噬。這一結(jié)果提示lncRNA-SNHG7/miR-29b/DNMT3A軸參與了自噬誘導(dǎo)的肝纖維化。lncRNAs為肝纖維化的診斷和治療提供了更多的靶點(diǎn)。

5 小 結(jié)

在肝纖維化進(jìn)程中，自噬和外泌體途徑都受到影響，不同肝細(xì)胞類型決定了自噬水平的上調(diào)或下調(diào)，從而表現(xiàn)出抗纖維化和促纖維化特性。同樣，外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通訊作用，也能夠通過激活受體細(xì)胞的不同信號通路改變其功能，影響HSCs的激活和遷移，調(diào)控炎癥反應(yīng)、自噬以及氧化應(yīng)激等，最終緩解肝纖維化的進(jìn)展。兩者在纖維化過程中存在相互串?dāng)_和重疊，這種交叉調(diào)節(jié)關(guān)系仍存在爭議，而通過干預(yù)二者間共享的作用靶點(diǎn)，能否達(dá)到抗纖維化的放大效應(yīng)尚未明了，有待繼續(xù)研究?，F(xiàn)階段關(guān)于外泌體調(diào)控自噬的研究，多集中在以miRNA調(diào)控自噬為主的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)上，深入研究發(fā)現(xiàn)lncRNA也可通過自噬影響肝纖維化進(jìn)程，未來可繼續(xù)探討外泌體中其他生物活性物質(zhì)對自噬的調(diào)控作用，為肝纖維化的治療提供新的思路。