王君，袁亞明，江晶晶，許慧卿，李松南

1.揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009

0 引言

噴灑農(nóng)藥是控制病蟲草害、保證糧食高產(chǎn)的必要措施，但也伴隨農(nóng)藥殘留等食品安全問題。含有農(nóng)藥殘留的食品原料是否安全，取決于農(nóng)藥的殘留量、毒性和食用劑量[1]。因此，制定農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)是目前各國際組織和國家加強(qiáng)農(nóng)藥殘留管控的通行做法，而農(nóng)藥殘留的高效、快速檢測(cè)則是重要技術(shù)手段。

目前農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)主要包括色譜(氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜、免疫親和色譜等)技術(shù)、光譜(拉曼光譜、紅外光譜、近紅外光譜、熒光光譜等)技術(shù)和生物(酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、生物傳感器、生物芯片等)技術(shù)[2]。其中，建立在免疫酶學(xué)基礎(chǔ)上的ELISA技術(shù)利用酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑，通過復(fù)合物的酶催化底物呈色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的定性或定量檢測(cè)[3]，已逐漸發(fā)展成為農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的主要技術(shù)之一。朱松明等[4]基于有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用，以吲哚酚乙酸酯為酶促水解反應(yīng)的顯色底物，通過物理吸附法固定乙酰膽堿酯酶并將其制備成農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)酶片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速定性篩檢。陳子鵬等[5]同樣以乙酰膽堿酯酶為酶源，基于ELISA技術(shù)原理建立了自助式農(nóng)藥殘留檢測(cè)平臺(tái)，通過圖像識(shí)別技術(shù)進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)。但上述研究中使用的乙酰膽堿酯酶是一種酯酶標(biāo)準(zhǔn)品，提取和純化工藝較為復(fù)雜，價(jià)格也較昂貴，這限制了其在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的大規(guī)模應(yīng)用。

酯酶是催化酯類化合物水解的一大類酶的總稱，廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中[6]。動(dòng)物肝臟、血液和組織中存在多種可以水解有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酯酶，且獲取和提取成本較低，可作為酯酶標(biāo)準(zhǔn)品的替代品以滿足市場(chǎng)需求[7]。徐斐等[8]研究發(fā)現(xiàn)，分級(jí)鹽析后透析得到的雞肝酯酶回收率較高，且均對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥響應(yīng)較敏感，適用于大規(guī)模動(dòng)物酯酶的制備。楊莉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，豬肝酯酶對(duì)雙(對(duì)硝基苯基)磷酸酯敏感性最高;與膽堿酯酶相比，豬肝酯酶對(duì)供試的多數(shù)有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨甲酸酯類農(nóng)藥的半抑制濃度(IC50)更低，敏感性更好。

盡管部分文獻(xiàn)已報(bào)道了動(dòng)物肝酯酶作為ELISA技術(shù)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)敏感酶源的潛在價(jià)值，但針對(duì)其提取、純化、結(jié)構(gòu)表征及對(duì)農(nóng)藥的敏感性響應(yīng)尚缺乏系統(tǒng)研究?；诖耍疚臄M采用硫酸銨分級(jí)鹽析后透析的方法分別從鵝肝、雞肝和豬肝中提取和純化酯酶，對(duì)3種動(dòng)物肝酯酶的蛋白組分進(jìn)行定性和定量分析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。西維因，又名甲萘威、胺甲萘，是目前常見的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，本文將其作為農(nóng)藥殘留敏感性響應(yīng)的農(nóng)藥模型，研究3種動(dòng)物肝酯酶在不同西維因質(zhì)量濃度下的酶活抑制率、敏感程度、檢出下限和IC50，以期為ELISA技術(shù)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的候選酶源開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鵝肝、雞肝和豬肝，購于揚(yáng)州市當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；西維因、三羥甲基氨基甲烷，上海阿拉丁科技股份有限公司產(chǎn)；2,6-二叔丁基對(duì)苯酚、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟、KCl、硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；溴酚藍(lán)，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司產(chǎn)；Marker蛋白，美國Bio-Rad中國有限公司產(chǎn)；固藍(lán)B鹽、α-萘酚、α-乙酸萘酯，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HR-6型組織勻漿機(jī)，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)；BenchTop Pro型臺(tái)式凍干機(jī)，美國Virtis公司產(chǎn)；1510型酶標(biāo)儀，美國 Thermo 公司產(chǎn)；DYY-11型電泳儀，北京市六一生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；1658000型垂直電泳槽，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)；H1650-W型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)；S-4800Ⅱ型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(SEM)，日本Hitachi公司產(chǎn)；DSC204F1型差示掃描量熱儀(DSC)，德國Netzsch公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物肝酯酶的提取和純化參照徐斐等[8]的方法，并稍作改進(jìn)。分別準(zhǔn)確稱取30.0 g新鮮雞肝、鵝肝和豬肝，依次加入100 mL Tris-乙酸緩沖液(0.1 mol/L的Tris溶液，含0.1 mol/L的KCl和0.001 mol/L的EDTA，用乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.4)、100 mL苯甲基磺酰氟(115 μmol/L)和100 mL 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(45 μmol/L)后，在冰水浴中用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，于8000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，即為動(dòng)物肝酯酶粗提物，于-18 ℃冰箱中凍藏，備用。

取30 mL動(dòng)物肝酯酶粗提物置于冰水浴中，添加一定質(zhì)量的硫酸銨至整個(gè)體系中硫酸銨飽和度為30%，于4 ℃冰箱中靜置2 h，低溫(4 ℃)、8000 r/min條件下離心 15 min，收集上清液；將得到的上清液在冰水浴中繼續(xù)添加一定質(zhì)量的硫酸銨至整個(gè)體系中硫酸銨飽和度為70%，于4 ℃冰箱中靜置2 h，重復(fù)上述離心步驟，收集并凍干沉淀，于-18 ℃冰箱中凍藏，備用。準(zhǔn)確稱取1.5 g凍干粉，與10 mL PBS緩沖液(0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液)混勻后裝入透析袋(截留分子質(zhì)量8000～14 000 kDa)中，磁力攪拌透析6 h，于8000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，即得純化后的動(dòng)物肝酯酶溶液。

用BCA試劑盒測(cè)定動(dòng)物肝酯酶溶液中蛋白的質(zhì)量濃度；將上述純化后的動(dòng)物肝酯酶溶液凍干后得到固體動(dòng)物肝酯酶，稱量其質(zhì)量，記為W/g，按照如下公式計(jì)算動(dòng)物肝酯酶得率。

1.3.2 動(dòng)物肝酯酶蛋白組成測(cè)定通過SDS-PAGE測(cè)定3種動(dòng)物肝酯酶的蛋白組成[10]，其堆積凝膠和分離凝膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和8%，電泳電壓分別為80 V和120 V。將3種固體動(dòng)物肝酯酶分別配制成質(zhì)量濃度為8 mg/L的酶液，然后準(zhǔn)確量取200 μL酶液和50 μL Tris-HCl緩沖液(1.5 mol/L，pH值為 8.8)，置于離心管中并混合均勻，沸水浴處理8 min，于12 000 r/min條件下離心5 min后，量取8 μL上清液加入凝膠孔。根據(jù)Marker蛋白中各蛋白分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lgM/(kDa)與各蛋白的遷移距離L/cm繪制的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線為L=-34.13lgM+182.7，R2=0.990 1。通過Image J軟件計(jì)算動(dòng)物肝酯酶對(duì)應(yīng)每個(gè)泳道中蛋白條帶的分子質(zhì)量及其相對(duì)含量。

1.3.3 動(dòng)物肝酯酶的微觀形態(tài)觀察分別稱取一定質(zhì)量的固體動(dòng)物肝酯酶，用導(dǎo)電膠將其固定在金屬載物臺(tái)上，真空噴金90 s后，于SEM下觀察其微觀形態(tài)。采集條件為：加速電壓10 kV，放大倍數(shù)5000倍。

1.3.4 動(dòng)物肝酯酶的熱力學(xué)特性測(cè)定準(zhǔn)確稱取5 mg固體動(dòng)物肝酯酶，置于DSC坩堝中，按照質(zhì)量比1∶3添加15 mg蒸餾水，混合均勻后靜置2 h。DSC的掃描溫度范圍為 40～120 ℃，掃描速度為10 ℃/min[11]。

1.3.5 動(dòng)物肝酯酶的酶活力測(cè)定準(zhǔn)確稱取5 mg固體動(dòng)物肝酯酶，用1 mL PBS緩沖液溶解后，加入1 mL含不同質(zhì)量濃度西維因(0.5～10.0 mg/L)的PBS緩沖液和25 μL底物(100 mmol/Lα-乙酸萘酯丙酮溶液)，混合均勻后于30 ℃恒溫振蕩水浴中孵育5 min，再加入0.25 mL 顯色劑溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6%的SDS溶液，其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的固蘭B鹽)，繼續(xù)于30 ℃恒溫振蕩水浴中孵育5 min。以不加底物的樣品溶液作為空白對(duì)照，在595 nm處測(cè)定上述溶液的吸光度，比較不同質(zhì)量濃度的西維因?qū)悠访富钜种坡实挠绊慬12]。動(dòng)物肝酯酶的酶活力和酶活抑制率計(jì)算公式如下：

式中，E為樣品的酶活力/(U·mL-1)，D為樣品的稀釋倍數(shù)，K為α-萘酚在pH 值為6.4條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/(L·mol-1)，T為反應(yīng)時(shí)間/min，A為溶液的吸光度，I為酶活抑制率/%，E2為無農(nóng)藥抑制時(shí)樣品的酶活力/(U·mL-1)，E1為一定質(zhì)量濃度西維因抑制時(shí)樣品的酶活力/(U·mL-1) 。

西維因檢測(cè)下限定義為與3倍抑制率標(biāo)準(zhǔn)差平均值相對(duì)應(yīng)的農(nóng)藥質(zhì)量濃度[8,12]。參考楊莉等[9]的方程擬合方法，通過酶活抑制率方程可計(jì)算當(dāng)I=50%時(shí)的農(nóng)藥質(zhì)量濃度，即該動(dòng)物肝酯酶對(duì)此農(nóng)藥的IC50/(mg·L-1)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，并使用SPSS和Origin8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，單因素方差分析通過Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)物肝酯酶得率及蛋白質(zhì)量濃度分析

不同動(dòng)物肝酯酶得率及蛋白質(zhì)量濃度見表1。由表1可知，鵝肝酯酶得率最高(14.58%)，雞肝酯酶得率最低(8.82%)，這可能與動(dòng)物肝來源、肝成分組成等有關(guān)[12]。鵝肝、雞肝和豬肝酯酶的蛋白質(zhì)量濃度分別為11.58 mg/mL、9.96 mg/mL和12.47 mg/mL，均高于經(jīng)EDAC-Procainamide-CH-Sepharose 4B和Procainamide-ECH-Sepharose 4B親和層析柱純化的鲅魚腦組織膽堿酯酶(0.003 2 mg/mL)[13]和蔥蠅乙酰膽堿酯酶(0.11 mg/mL)[14]，表明硫酸銨分級(jí)鹽析后透析的方法適合動(dòng)物肝酯酶的提取和純化，但動(dòng)物肝酯酶得率較低的問題還需進(jìn)一步優(yōu)化和探索。從動(dòng)物肝酯酶得率和蛋白質(zhì)量濃度綜合考慮，鵝肝和豬肝更適合作為動(dòng)物肝酯酶提取的原料。

表1 不同動(dòng)物肝酯酶得率及蛋白質(zhì)量濃度Table 1 Yield and protein mass concentration of esterases obtained from different animal liver esterases

2.2 動(dòng)物肝酯酶的蛋白組成分析

不同動(dòng)物肝酯酶的SDS-PAGE圖譜如圖1所示，其中，M為 Marker蛋白，A為鵝肝酯酶，B為雞肝酯酶，C為豬肝酯酶。不同動(dòng)物肝酯酶的蛋白組成及相對(duì)含量見表2。由圖1和表2可知，鵝肝、雞肝和豬肝酯酶蛋白的分子質(zhì)量均為30～110 kDa。鵝肝酯酶中分子質(zhì)量為55 kDa的蛋白相對(duì)含量最高(14.31%)，其次是分子質(zhì)量為43 kDa和37 kDa的蛋白(11.36%和11.15%)，而分子質(zhì)量為101 kDa和110 kDa的蛋白相對(duì)含量較低(<5%)。雞肝酯酶中分子質(zhì)量為55 kDa的蛋白相對(duì)含量也最高(16.74%)，其次是分子質(zhì)量為43 kDa和37 kDa的蛋白(13.10%和12.93%)，而分子質(zhì)量為101 kDa和110 kDa的蛋白相對(duì)含量較低(<2%)。于曉航等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過分級(jí)鹽析和排阻色譜法得到的雞肝酯酶蛋白的分子質(zhì)量主要分布在49～90 kDa，且農(nóng)藥敏感性較好。豬肝酯酶中分子質(zhì)量為55 kDa的蛋白相對(duì)含量也最高(14.67%)，其次是分子質(zhì)量為34～43 kDa的蛋白(10.21%～10.97%)，而分子質(zhì)量為101 kDa和110 kDa的蛋白相對(duì)含量較低(<4%)，該結(jié)果與D.B?ttcher等[15]的研究結(jié)果一致。綜上所述，分子質(zhì)量為55 kDa的蛋白是3種動(dòng)物肝酯酶中最主要的蛋白成分，且在雞肝酯酶中的相對(duì)含量最高，在豬肝酯酶中的相對(duì)含量最低。

表2 不同動(dòng)物肝酯酶的蛋白組成及相對(duì)含量Table 2 Protein composition and relative content of esterases obtained from different animal liver esterases

圖1 不同動(dòng)物肝酯酶的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE image of esterases obtained from different animal liver esterases

2.3 動(dòng)物肝酯酶的微觀結(jié)構(gòu)分析

不同動(dòng)物肝酯酶的SEM圖譜如圖2所示。由圖2可知，鵝肝、雞肝和豬肝酯酶蛋白顆粒大小不一，以片狀結(jié)構(gòu)為主，表面較光滑，存在少量球形蛋白，這可能與蛋白種類和干燥工藝有關(guān)。這與陳珂等[16-17]的研究結(jié)果一致。陳珂等[16]研究發(fā)現(xiàn)，噴霧干燥的乳清蛋白顆粒呈現(xiàn)表面皺縮的不規(guī)則球形，而真空冷凍干燥的乳清蛋白顆粒呈現(xiàn)表面光滑的片狀結(jié)構(gòu)。李向紅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，冷藏凍干后的草魚肌原纖維蛋白呈現(xiàn)表面光滑的片層結(jié)構(gòu)。

圖2 不同動(dòng)物肝酯酶的SEM圖譜Fig.2 SEM images of esterases obtained from different animal liver esterases

2.4 動(dòng)物肝酯酶的熱力學(xué)性質(zhì)分析

在DSC升溫過程中，蛋白結(jié)構(gòu)的無序化或聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的解開會(huì)導(dǎo)致吸熱現(xiàn)象，而超過一定溫度后，蛋白變性則會(huì)導(dǎo)致放熱現(xiàn)象，這些都與蛋白的種類和性質(zhì)有關(guān)[18]。不同動(dòng)物肝酯酶的DSC圖譜如圖3所示。由圖3可知，鵝肝和豬肝酯酶分別在54 ℃左右出現(xiàn)1個(gè)放熱峰、在100 ℃左右出現(xiàn)1個(gè)吸熱峰;而雞肝酯酶在59 ℃和78 ℃左右出現(xiàn)2個(gè)放熱峰，這與鮭魚球蛋白的熱力學(xué)分析結(jié)果一致[19]。對(duì)3種動(dòng)物肝酯酶的DSC圖譜進(jìn)一步分析，可以得到起始溫度(To)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Tc)和熱焓值(ΔH)4個(gè)熱力學(xué)特征參數(shù)(見表3)。由表3可知，在第1個(gè)放熱峰(Peak Ⅰ)中，3種動(dòng)物肝酯酶的To無顯著差異，但ΔH存在顯著差異，且雞肝酯酶的ΔH最大，表明雞肝酯酶的熱穩(wěn)定性最好；在第2個(gè)吸/放熱峰(Peak Ⅱ)中，豬肝酯酶和鵝肝酯酶的To顯著大于雞肝酯酶，且ΔH均存在顯著差異。上述3種動(dòng)物肝酯酶在熱力學(xué)性質(zhì)上的差異，主要與其蛋白組成及相對(duì)含量緊密相關(guān)，且與SDS-PAGE數(shù)據(jù)一致。

表3 不同動(dòng)物肝酯酶的熱力學(xué)特征參數(shù)Table 3 Thermodynamic characteristic parameters of esterases obtained from different animal liver esterases

圖3 不同動(dòng)物肝酯酶的DSC圖譜Fig.3 DSC curves of esterases obtained from different animal liver esterases

2.5 動(dòng)物肝酯酶對(duì)西維因的抑制響應(yīng)分析

按抑制劑與酶的結(jié)合方式，可逆抑制分為同位抑制作用和別位抑制作用。前者指抑制劑與酶活性中心結(jié)合阻斷酶分子的結(jié)合基團(tuán)或催化基團(tuán)，或與酶-底物復(fù)合物結(jié)合，阻止底物形成產(chǎn)物；后者指抑制劑與酶活性中心以外的部位結(jié)合，通過酶分子構(gòu)象的改變影響底物與酶的結(jié)合，進(jìn)而影響催化效率。西維因可與膽堿酯酶活性中心絲氨酸的羥基結(jié)合，阻止乙酰膽堿與膽堿酯酶的結(jié)合，進(jìn)而使體內(nèi)的乙酰膽堿積聚而產(chǎn)生毒性[20]。因此，動(dòng)物肝酯酶與西維因的結(jié)合屬于同位抑制作用。

不同質(zhì)量濃度西維因?qū)Σ煌瑒?dòng)物肝酯酶的抑制率如圖4所示。由圖4可知，3種動(dòng)物肝酯酶的抑制率均隨西維因質(zhì)量濃度的增加而升高，其中雞肝酯酶最敏感，鵝肝酯酶次之，豬肝酯酶最弱。通過函數(shù)擬合可進(jìn)一步計(jì)算西維因質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值與不同動(dòng)物肝酯酶抑制率的擬合曲線Y=a+blgX,其參數(shù)見表4。由表4可知，在西維因質(zhì)量濃度為0.5～10.0 mg/L時(shí)，3種動(dòng)物肝酯酶的抑制率與西維因質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值均存在較好的線性關(guān)系(R2>0.90)，這與徐斐等[8]選擇游離雞肝酯酶和固定化雞肝酯酶檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥得到的擬合結(jié)果一致。與鵝肝酯酶和豬肝酯酶的線性范圍相比，雞肝酯酶的線性范圍更低，且其檢測(cè)下限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鵝肝酯酶和豬肝酯酶，這表明雞肝酯酶中富含對(duì)西維因敏感的蛋白組分。本研究提取的雞肝酯酶的檢測(cè)下限為0.29 mg/L，低于徐斐等[8]研究報(bào)道的游離雞肝酯酶檢測(cè)下限(2.52 mg/L)和離子交換色譜固定化的雞肝酯酶檢測(cè)下限(0.78 mg/L)。

圖4 不同質(zhì)量濃度西維因?qū)Σ煌瑒?dòng)物肝酯酶的抑制率Fig.4 Inhibition rate of esterases obtained from different animal liver esterases with various concentration of carbaryl

表4 西維因質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值與不同動(dòng)物肝酯酶抑制率的擬合曲線參數(shù)Table 4 The parameters from each fitting curve between the logarithm value of carbaryl mass concentration and the inhibition rate of different animal liver esterases

在食品毒理學(xué)中，酯酶的IC50與農(nóng)藥敏感性緊密相關(guān)，IC50越小，表明其對(duì)該農(nóng)藥越敏感[21]。3種動(dòng)物肝酯酶中，雞肝酯酶的IC50為7.74 mg/L，遠(yuǎn)低于鵝肝酯酶(28.40 mg/L)和豬肝酯酶(33.79 mg/L)，表明雞肝酯酶中對(duì)西維因敏感的蛋白組分及其相對(duì)含量更多，且與抑制速率和檢測(cè)下限的趨勢(shì)一致。但與美洲蟑螂頭部乙酰膽堿酯酶對(duì)西維因的IC50(0.29 μmol/L)[22]相比，本研究中雞肝酯酶的IC50(約38.47 μmol/L)明顯偏高，這可能與不同來源酯酶在分子結(jié)構(gòu)和蛋白組分上具有顯著差異有關(guān)。

3 結(jié)論

本文通過硫酸銨分級(jí)鹽析后透析的方法分別從鵝肝、雞肝和豬肝中提取和純化酯酶，定性和定量分析了3種動(dòng)物肝酯酶的蛋白組分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，進(jìn)而研究了其對(duì)西維因的抑制響應(yīng)。3種動(dòng)物肝酯酶的得率和蛋白質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)顯著差異，其中鵝肝酯酶得率最高(14.58%)，豬肝酯酶的蛋白質(zhì)量濃度最高(12.47 mg/mL),即鵝肝和豬肝更適合作為動(dòng)物肝酯酶提取的原料；3種動(dòng)物肝酯酶的蛋白分子質(zhì)量均為30～110 kDa，且主要蛋白成分的分子質(zhì)量均為55 kDa；3種動(dòng)物肝酯酶蛋白的顆粒形態(tài)均一且以片狀結(jié)構(gòu)為主，表面較光滑；雞肝酯酶的熱穩(wěn)定性最好，且當(dāng)西維因質(zhì)量濃度為0.5～10.0 mg/L時(shí)，其線性范圍(0.5～5.0 mg/L)、檢測(cè)下限(0.29 mg/L)和IC50(7.74 mg/L)均最低，可作為西維因快速檢測(cè)的潛在敏感酶源。酯酶純化工藝優(yōu)化、最佳酶活反應(yīng)條件和固定化酯酶應(yīng)用將是下一步值得探索的研究方向。