吳 涌

暨南大學(xué)附屬深圳市寶安區(qū)婦幼保健院婦幼醫(yī)學(xué)研究所 (廣東 深圳 518101)

血友病A(hemophilia A, HA)是由于人凝血因子VIII基因(F8)缺陷導(dǎo)致的X連鎖出血性遺傳病，在活產(chǎn)男嬰中的發(fā)病率約為1/10000-1/5000。臨床上根據(jù)凝血因子VIII活性，可將其分為重度(活性＜1%)、中度(1%～5%活性)和輕度(5～30%活性)患者[1]。血友病A可因反復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)出血而導(dǎo)致不同程度殘疾，重型患者甚至可能由于顱內(nèi)自發(fā)出血而危及生命[2-3]。目前尚無成熟的根治療法，臨床上主要通過定期輸注血液來源的或者重組的凝血因子VIII行替代治療。大部分嚴(yán)格接受替代療法的患者可以享受正常人的生活質(zhì)量，但此療法價(jià)格昂貴，在中國這樣的發(fā)展中國家甚至有大量血友病A患者終身未接受過任何治療。

由于HA是一種循環(huán)系統(tǒng)單基因遺傳病，在正常人體內(nèi)，凝血因子Ⅷ的含量也不需要很精確的調(diào)控。針對重度HA患者，僅需將凝血因子含量提高到可檢測水平(1%)以上，就能將其轉(zhuǎn)變成中度患者，大幅提高生活質(zhì)量。由于這些特性，導(dǎo)致HA成為了基因治療研究的經(jīng)典疾病模型[4]。甚至早在世紀(jì)初的基因治療研究熱潮中，就有研究者開展了HA的基因治療人體試驗(yàn)[5]。

F8于1984年被成功克隆，在過去的近四十年中， HA的基因治療研究取得了巨大進(jìn)展[6]。但是絕大部分研究采取的策略都是將治療F8表達(dá)框?qū)爰?xì)胞[4]。治療基因多隨機(jī)插入到基因組當(dāng)中，也有以不整合的附加體形式游離存在于細(xì)胞中。這樣的選擇一定程度上取決于技術(shù)以及效率的限制，其不足之處也是顯而易見的。治療基因的表達(dá)受到整合位點(diǎn)染色質(zhì)環(huán)境的影響，由于整合位點(diǎn)是不確定的，所以治療基因的表達(dá)強(qiáng)度并不能得到保證。更嚴(yán)重的情況是治療基因有一定幾率會(huì)插入原癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，這在早期的基因治療研究中已有前車之鑒。而對于不整合的方案，附加體在細(xì)胞增殖中并不會(huì)像染色體那樣倍增，因此會(huì)隨著時(shí)間而被稀釋，從而無法獲得長期治療效果[7]。

隨著各種人工核酸酶(artificial nucleases)技術(shù)的興起和成熟，同源重組的效率可以獲得指數(shù)級的提高[8-10]。近年來有一些學(xué)者開始嘗試基因打靶的方式來定點(diǎn)整合治療基因或者直接修復(fù)缺陷的內(nèi)源F8。HA的定點(diǎn)基因治療有不同的技術(shù)路線，本綜述將分別介紹目前該研究方向所取得的一些進(jìn)展。

1 定點(diǎn)基因添加這類策略適用于所有突變類型的HA患者，就是將完整的治療基因表達(dá)框通過基因打靶的方式定點(diǎn)整合至預(yù)先設(shè)計(jì)好的基因組位點(diǎn)。這類策略一方面避免了隨機(jī)整合的不安全因素，另一方面由于一般會(huì)選擇轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域，可以確保治療基因整合后有一定的轉(zhuǎn)錄活性。另外，可以通過使用比較強(qiáng)的啟動(dòng)子，以進(jìn)一步增強(qiáng)治療基因的表達(dá)[11]。比如，2006年劉雄昊等就報(bào)道了將CMV-BDDF8表達(dá)框定點(diǎn)整合至人核糖體DNA區(qū)。由于該區(qū)域是轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，并且人正常二倍體細(xì)胞有數(shù)百個(gè)核糖體DNA拷貝，因此這個(gè)策略可以同時(shí)獲得較高的定點(diǎn)整合效率以及基因表達(dá)強(qiáng)度。定點(diǎn)整合后，治療基因可以在細(xì)胞系中長期表達(dá)[12]。

2 利用內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子

如果以單拷貝的形式整合到細(xì)胞中，治療基因的表達(dá)量一般都比較有限。因此大量研究的焦點(diǎn)都是想方設(shè)法提高治療基因的表達(dá)。其中一個(gè)效果顯著的策略就是使用強(qiáng)啟動(dòng)子，代表性的方法是將無啟動(dòng)子的治療基因定點(diǎn)整合到肝細(xì)胞白蛋白(Alb)啟動(dòng)子的下游。因?yàn)楦闻K每天合成多達(dá)12～20g的白蛋白，占血漿總蛋白的50%，因此Alb顯然是一個(gè)很強(qiáng)的肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，同時(shí)肝細(xì)胞還具有其他細(xì)胞無法比擬的蛋白分泌能力。因此，上述策略理論上可以獲得較高的治療基因表達(dá)及產(chǎn)物分泌效率。

這個(gè)策略最早是斯坦福大學(xué)的Kay課題組在血友病B的基因治療研究中使用的[13]。費(fèi)城兒童醫(yī)院的High課題組在HA模型鼠中測試了這一策略，可以糾正HA小鼠的臨床表型[14]。

這種方法雖然整合效率不高，但是治療基因的蛋白表達(dá)量相當(dāng)可觀，是一個(gè)很有前景的方案，后續(xù)也有其他課題組發(fā)表了一些跟隨研究[15]。

雖然已發(fā)現(xiàn)的F8致病突變類型已超過3000種，但在重度HA患者中約有一半都是由兩種大片段染色體倒位突變所致，分別是22號內(nèi)含子倒位和1號內(nèi)含子倒位。這兩種倒位的機(jī)制比較類似，都是由于F8內(nèi)部以及外部存在同源序列，在雄性配子生成過程中，同源序列會(huì)誘發(fā)重組進(jìn)而導(dǎo)致染色體倒位。兩種染色體倒位的結(jié)果都是將186kb的F8分成了方向相反的兩段，完全破壞F8導(dǎo)致重度HA表型[16-18]。由于這兩種倒位的患者數(shù)量在HA中占比最高，并且都是重度表型，本課題組研究了這兩種突變的特點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了針對性的基因修復(fù)策略。

在22號內(nèi)含子倒位突變中，倒位的片段長達(dá)600kb，將F8分成了141kb和45kb的兩段。由于基因內(nèi)的斷裂點(diǎn)位于22號內(nèi)含子，因此F8的26個(gè)外顯子中有22個(gè)都包含在141kb部分，而另外長達(dá)45kb的部分僅包含627bp的編碼序列。因此我們將這627bp和一個(gè)外源polyA元件通過基因打靶的方式定點(diǎn)整合至22號外顯子下游，從而完全修復(fù)突變的F8。我們在HA患者來源的iPSCs中驗(yàn)證了這個(gè)策略，并使用TALENs來促進(jìn)基因打靶效率，可以獲得50%以上的相對打靶效率。進(jìn)一步將基因修復(fù)后的iPSCs定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，均可以檢測到這些細(xì)胞獲得了表達(dá)并分泌FVIII的能力[19]。

1號內(nèi)含子倒位的斷裂點(diǎn)位于1號內(nèi)含子，因此對于2～26號外顯子部分來說，僅缺少1號外顯子和啟動(dòng)子。而1號外顯子中僅包含146bp的編碼序列，此外再整合一個(gè)啟動(dòng)子即可完全修復(fù)F8。本課題組建立了一株模擬1號內(nèi)含子倒位突變的HA模型鼠，然后使用腺相關(guān)病毒將肝特異性強(qiáng)啟動(dòng)子和146bp的編碼序列定點(diǎn)插入到模型鼠肝細(xì)胞的2號外顯子上游。注射治療一個(gè)月之后，HA模型鼠的肝臟獲得了表達(dá)并分泌功能性FVIII的能力，并且HA疾病表型得到了有效糾正[7]。

3 其它策略

首爾國立大學(xué)的Kim課題組針對兩種倒位突變設(shè)計(jì)了特殊的治療策略。由于這兩類突變的直接原因都是特定染色體片段發(fā)生了倒位，因此Kim課題組通過使用CRISPR/Ca9來定點(diǎn)切割染色體以誘導(dǎo)倒位片段再次發(fā)生倒位，從而使F8能夠正常表達(dá)。針對1號內(nèi)含子倒位，作者直接在同源序列內(nèi)部切割，以誘發(fā)同源序列再次發(fā)生重組。對于22號內(nèi)含子倒位，則在倒位片段兩側(cè)分別切割，倒位的片段會(huì)有一定的概率以非同源末端連接的方式發(fā)生倒位。他們分別制備了兩種突變HA病人來源的iPSCs，通過上述方法誘導(dǎo)倒位，再把成功發(fā)生倒位的細(xì)胞克隆分化成內(nèi)皮細(xì)胞。修復(fù)后的內(nèi)皮細(xì)胞能夠表達(dá)F8，將內(nèi)皮細(xì)胞輸注到HA模型鼠體內(nèi)后，對HA疾病表型有一定改善，但治療效果非常有限，大部分小鼠仍然會(huì)在剪尾試驗(yàn)中死亡[20]。這種策略目前還停留在概念階段，因?yàn)橐謩e促使140kb、600kb的片段發(fā)生倒位，雖然在實(shí)驗(yàn)室中確實(shí)能成功獲得這樣的細(xì)胞克隆，但是效率極其低下，對于臨床應(yīng)用來說還是不現(xiàn)實(shí)的。

另外，也有一些針對F8散發(fā)突變的基因治療研究。例如F8中的B區(qū)功能并不重要，理論上B區(qū)部分缺失不會(huì)影響FVIII功能，因此在大多數(shù)HA基因治療中使用的都是B區(qū)缺失的F8。在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中已報(bào)道的發(fā)生在B區(qū)的突變有近500種，但是其中約90%會(huì)導(dǎo)致移碼突變導(dǎo)致嚴(yán)重的HA表型[16]。本課題組在臨床中就發(fā)現(xiàn)了一例14號外顯子發(fā)生了4bp缺失的HA重度患者，我們培養(yǎng)了該患者的尿液上皮細(xì)胞并將其誘導(dǎo)成iPSCs。再使用CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合單鏈寡核苷酸(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN)在突變位點(diǎn)附近再切除14bp。這樣F8在B區(qū)總共缺少了18bp的編碼序列，可以糾正移碼突變。糾正后的iPSCs分化成內(nèi)皮細(xì)胞后可以表達(dá)并分泌功能性的FVIII蛋白，并且移植到HA模型鼠體內(nèi)可以糾正HA表型[21]。

4 展 望

在HA基因治療中，以往的完整F8表達(dá)框替代的策略最顯著的優(yōu)點(diǎn)是適用于任何F8突變類型的患者。其不足之處一方面是隨機(jī)整合導(dǎo)致的安全性擔(dān)憂和表達(dá)強(qiáng)度的不確定性。附加體方案又存在長期療效的問題。而且由于F8太大，全長186kb，即使使用B區(qū)缺失的BDD-F8， 編碼序列也有約4.4kb，過大的基因表達(dá)框勢必會(huì)降低導(dǎo)入效率。

而定點(diǎn)基因編輯技術(shù)，特別是直接修復(fù)突變的基因具有諸多優(yōu)點(diǎn)?；虬l(fā)生了突變，猶如人的一個(gè)肢體受傷，只要把損傷處修復(fù)好即可，理論上另外安裝一個(gè)完整的肢體當(dāng)然可以替代功能，但并不能說是完美的策略。

定點(diǎn)基因治療可以很大程度上規(guī)避安全性和基因沉默的問題。如果突變的基因拷貝能夠在原位得到修復(fù)，則理論上可能得到跟正常人類似的結(jié)果。另外，如果能夠充分利用患者已突變的基因拷貝，則可能通過較小的序列改動(dòng)就可以修復(fù)嚴(yán)重的突變。序列改動(dòng)越小，則基因編輯的效率越高，這更增加了這一策略的可行性。

F8的突變類型已超過3000種，但約一半的重度患者都是由兩種倒位突變導(dǎo)致[16]。由于80%以上的血友病患者為HA，僅15%左右為HB，而50%～60%的HA為重度患者，據(jù)此推算僅僅兩種突變的HA的患者數(shù)量就和HB的患者總數(shù)相當(dāng)。筆者認(rèn)為專門針對這兩種倒位突變設(shè)計(jì)合理、高效的基因治療策略是非常有價(jià)值的。因此本綜述花費(fèi)了較多篇幅進(jìn)行講述。這兩種突變倒位的片段分別長達(dá)140kb和600kb，而本課題組設(shè)計(jì)的定點(diǎn)修復(fù)策略僅通過定點(diǎn)整合幾百bp的小片段就可原位修復(fù)這類大片段倒位。

早幾十年的HA基因治療幾乎全部使用隨機(jī)整合策略。近些年才逐漸有一些定點(diǎn)基因治療的研究。唯一的瓶頸就是基因定點(diǎn)整合的效率還有待提高。但是基因編輯技術(shù)目前正處于黃金發(fā)展期，相信最終的突破很快就會(huì)來到。因此筆者認(rèn)為，HA定點(diǎn)基因治療是一個(gè)非常有前景的研究方向。