樊志剛　王東

[摘 要] 背景：目前臨床治療帕金森病以藥物為主，細(xì)胞移植治療逐漸成為一種趨勢(shì)，基因修飾過(guò)的臍血干細(xì)胞能否改善癥狀鮮見報(bào)道。目的：觀察TH修飾的HUMSCs移植對(duì)帕金森病大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響。方法：將酶切鑒定后的新構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP-C2-TH經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)第4代HUMSCs，注射到PD大鼠模型右側(cè)腦室，觀察大鼠行為學(xué)變化，移植細(xì)胞在大鼠腦組織內(nèi)的遷移。結(jié)果與結(jié)論：質(zhì)粒pEGFP-C2-TH轉(zhuǎn)染HUMSCs移植后8周，細(xì)胞逐漸向腦室轉(zhuǎn)移，PD大鼠癥狀顯著改善（P<0.05），移植細(xì)胞可以在PD大鼠腦內(nèi)存活。TH修飾的大鼠HUMSCs經(jīng)腦室移植對(duì)PD大鼠具有明顯治療作用，為臨床中干細(xì)胞移植的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 基因治療；臍血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞；帕金森??；大鼠；酪氨酸羥化酶

中圖分類號(hào)：R394 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）03-030-05

帕金森?。≒arkinsondisease，PD）的病因尚未明確，與遺傳在內(nèi)的多種因素有關(guān)[1] 。其病理特征為黑質(zhì)致密部的色素脫失和多巴胺神經(jīng)元的大量死亡[2]。好發(fā)于中老年人，平均始發(fā)年齡為57歲，60歲以上患病率達(dá)1%～2%。目前，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上約有500萬(wàn)名帕金森病患者[3]，其中170萬(wàn)在中國(guó)[4] 。隨著人口老齡化，患病率和發(fā)病率呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)[5]。雖然近年來(lái)藥物治療[6]方面的研究使帕金森病癥狀得到有效控制，但仍有許多問(wèn)題亟待解決，比如：藥物不良反應(yīng)、藥效降低、癡呆、平衡障礙等，如何進(jìn)行個(gè)性化治療[7] 給現(xiàn)有藥物治療提出了巨大挑戰(zhàn)。帕金森病的外科治療主要包括蒼白球損毀術(shù)、腦深部電刺激等，應(yīng)用受限于手術(shù)的適應(yīng)證、手術(shù)技術(shù)的高要求、并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)[8]、昂貴的醫(yī)療價(jià)格等。

目前，細(xì)胞治療成為新方向，主要是將各種多巴胺能細(xì)胞移植入紋狀體，多年來(lái)人們嘗試各種細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行研究。干細(xì)胞移植和基因治療為帕金森病[9-11]臨床治療開拓了廣闊前景，PD也是公認(rèn)的適合進(jìn)行細(xì)胞移植和基因治療的病種之一[12-15]。細(xì)胞治療比藥物治療更接近于患者生理模式。干細(xì)胞因其具有向多巴胺能神經(jīng)元分化的潛能而成為細(xì)胞治療中極為常用的種子細(xì)胞，主要包括胚胎干細(xì)胞[16]、成人神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。但是它們面臨道德倫理、來(lái)源受限、免疫排斥等棘手問(wèn)題，臨床研究發(fā)展受到極大限制。

臍血是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)和胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液。臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells.MSCs）[17]，是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類具有與骨髓干細(xì)胞相同的多向分化潛能的原始祖細(xì)胞，并且來(lái)源豐富，免疫排斥低。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)即多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素生物合成過(guò)程所需的限速酶，也是DA能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，它以四氫生物喋呤啶（BH4）為輔酶，催化酪氨酸的羥化而生成多巴（DOPA）。

本實(shí)驗(yàn)將大鼠酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxy-lase，TH）基因修飾的人臍血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)（Humanumbilical cord blood -derived mesenchymal stem cell，HUMSCs）立體定向注射到PD大鼠腦室內(nèi)，觀察經(jīng)TH修飾后的HUMSCs在大鼠腦內(nèi)的存活、遷移情況，以及移植后對(duì)帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為影響，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床移植途徑選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2012年3月至10月在鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心完成隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～400g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理符合科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。主要試劑：6-羥基多巴胺、阿樸嗎啡購(gòu)自Sigma公司；小鼠抗酪氨酸羥化酶購(gòu)自Gibco公司；DMEM購(gòu)自天津TBD公司；淋巴細(xì)胞分離液（1. 077 g/cm3）購(gòu)自北京中杉公司；NucleofectorTM 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀購(gòu)自德國(guó)Amaxa公司。

1.2 方法

pEGFP-C2-TH構(gòu)建：將pGEM—TH-3在引物1：5ˊ-TACTTGAGCGCCCACCCC-3ˊ，引物2：5ˊ-GTGTCTACTTAATGGCACTCA-3ˊ擴(kuò)增后的TH基因與pEGFP-C2連接，引入XhoⅠ和SaⅡ雙酶，行酶切電泳檢測(cè)。

PD模型的建立：用35g/L水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉SD大鼠后，將大鼠固定于立體定向器上，以前囟為零點(diǎn)，參照包新民等[18]的《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠右側(cè)MFB和VTA兩點(diǎn)坐標(biāo)（MFB為前囟后4.0mm，矢狀縫右側(cè)1.8mm，顱骨下7.9mm；VTA為前囟后4.6mm，矢狀縫右側(cè)1.4mm，顱骨下7.9mm）。向每點(diǎn)用微量進(jìn)樣器注射新鮮配置的6-OHDA溶液6 μL（3g/L，溶于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 g/L抗壞血酸的生理鹽水中），注射速度為0.5μL/min，留置空針10 min，以1mm/min的速度緩慢退針。1周后腹腔注射阿樸嗎啡（1.0mg/kg）以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)將26只造模成功大鼠分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組13只。

pEGFP-C2-TH轉(zhuǎn)染 HUMSCs：臍血來(lái)源于鄭州市婦幼保健醫(yī)院產(chǎn)科，參照文獻(xiàn)[19]分離并純化HUMSCs，取第三代MSCs，在NucleofectorTM儀 A=31程序下進(jìn)行轉(zhuǎn)染.然后繼續(xù)培養(yǎng)3d，進(jìn)行TH免疫組化，計(jì)算轉(zhuǎn)染率和融合蛋白表達(dá)率。

HUMSCs的移植：將調(diào)整細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×105μL-1，立即進(jìn)行細(xì)胞移植。將帕金森病模型大鼠麻醉后固定于立體定位器上，以前囟為零點(diǎn)，定位右側(cè)紋狀體2個(gè)移植點(diǎn)：前囟前1.2 mm，矢狀縫右2.8mm，顱骨下5.2 mm；前囟前1.2 mm，矢狀縫右2.8mm，顱骨下7.2mm。實(shí)驗(yàn)組每點(diǎn)注射6μLHUMSCs，注射速度0.5μL/min，注射完畢后留針10min，以1mm/min的速度緩慢退針。對(duì)照組按上述方法和坐標(biāo)，注入6μL的PBS。

1.3 觀察指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)分析

①移植后每周1次腹腔注射阿樸嗎啡（1.0 mg/kg）觀察帕金森病大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改善。②移植后8周、12周取腦制作冰凍切片。用熒光顯微鏡觀察HUMSCs細(xì)胞的存活與遷移情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS11.0版軟件包對(duì)帕金森病大鼠移植前后旋轉(zhuǎn)次數(shù)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量

30只實(shí)驗(yàn)大鼠，造模成功的26只全部進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 HUMSCs的分離和純化

HUMSCs接種后第1天，細(xì)胞基本呈圓形，懸浮狀；3天后貼壁，原代細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)型，圓錐狀，散在分布，數(shù)目稀少，消化后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，1周后，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合，多數(shù)HUMSCs細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型，貼壁牢固，排列緊密，取第三代細(xì)胞備用。（圖1-圖3）

2.3 質(zhì)粒pEGFP-C2-TH的酶切鑒定

電泳結(jié)果中，質(zhì)粒pEGFP-C2-TH在雙酶切后表達(dá)的目的片段及質(zhì)粒pGEMTH-3經(jīng)PCR擴(kuò)增后的DNA片段與質(zhì)粒pGEMTH-3酶切下釋放的TH基因（1.77kb）大小一致。（圖4）

1：XhoⅠ和SaⅡ雙酶切后4.8kb和1.8kb產(chǎn)物 2：BamHⅠ單酶切Pgemth-3后1.7kb和2.7kb片段 3：以Pgemth-3為模板的PCR產(chǎn)物1.7kb目的片段 4：DNA Marker

圖4 質(zhì)粒pEGFP-C2-TH的酶切電泳圖

2.4 質(zhì)粒pEGFP-C2-TH轉(zhuǎn)染 HUMSCs后的表達(dá)

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)4h后，開始貼壁，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%左右瓶底覆蓋率時(shí)，計(jì)算轉(zhuǎn)染率為（56.2±6.8）%，TH細(xì)胞免疫組化計(jì)算表達(dá)率為（88.6±5.9）%（圖5-圖6）

2.5 移植后PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改變

（1）30大鼠中，共有26只成為PD大鼠模型，成功率為87%，主要表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩，少動(dòng)，豎毛，躬身，尾僵以及頭偏斜、嗅探等。注射6-OHDA后1周5只成功（占16.7%），第3周18只成功（占60%），成功PD大鼠逐漸增多，而4～8周成功PD穩(wěn)定在26只。

（2）實(shí)驗(yàn)組PD在移植后2周，活躍度較對(duì)照組增高，活動(dòng)范圍開始增大，自主覓食行為增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 PD大鼠APO誘發(fā)后均出現(xiàn)恒定旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)次數(shù)分別為（15.7±1.9 ）r/min和（15.6±3.3） r/min，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。移植后4周，旋轉(zhuǎn)次數(shù)均出現(xiàn)減少，分別為（12.6±1.8 ）r/min和（10.5±2.3） r/min，功能行為得到好轉(zhuǎn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。移植后8周和12周，旋轉(zhuǎn)次數(shù)繼續(xù)減少，分別為（11.4±1.9 ）r/min、（6.8±1.9） r/min和（10.8±1.5 ）r/min、（4.6±0.8） r/min，均表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較對(duì)照組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見下表1。

2.6 TH修飾的HUMSCs在大鼠腦內(nèi)遷移情況

移植4周后實(shí)驗(yàn)組處死動(dòng)物做組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)HUMSCs在注射點(diǎn)附近散在分部（圖7），8周時(shí)，可見植入的細(xì)胞逐漸向外遷移，分布于腦室前1.7mm、腦室后3.3mm，以及腦室膜下（2.7±0.2）mm范圍內(nèi)，呈帶狀分布（圖8）。12周時(shí)見向皮質(zhì)遷移（圖9），免疫組化顯示移植的細(xì)胞TH表達(dá)陽(yáng)性（圖10）。實(shí)驗(yàn)組健側(cè)和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞。

3 討論

PD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)變性疾病，主要是黑質(zhì)紋狀體區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元的減少或消失。目前，干細(xì)胞生物學(xué)的研究與應(yīng)用日益受到關(guān)注，干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能[20]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研（Bone mesenchymal stem cells.BMSCs）研究較多[21-23]，有實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs在體外純化后，移植入PD大鼠腦內(nèi)，可在腦內(nèi)分化為多巴胺能神經(jīng)元，明顯增加多巴胺含量[24]，可改善癥狀，但臍血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞較少報(bào)道，臍血作為一種新的可靠干細(xì)胞來(lái)源，有自身很多優(yōu)點(diǎn)，尤其是HUMSCs在適當(dāng)條件下具有向神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞等組織細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能[25-27]，并且HUMSCs容易獲取、能有效表達(dá)外源基因。體外研究中，HUMSCs可在多種因子的共同誘導(dǎo)下表達(dá)TH[28]，而TH陽(yáng)性的表達(dá)正是多巴胺能神經(jīng)元的基本特征，在體內(nèi)定向分化的報(bào)道不是很多。和其他來(lái)源干細(xì)胞相比，臍血來(lái)源廣泛，臍血中淋巴細(xì)胞的免疫功能不夠成熟，免疫原性較弱，移植物抗宿主病發(fā)生率較低；臍血中間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離[29]。本研究以HUMSCs為種子細(xì)胞，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

質(zhì)粒pEGFP-C2-TH修飾后的HUMSCs表達(dá)TH及增強(qiáng)型綠色熒光蛋（EGFP），TH是DA合成的限速酶，在PD患者腦內(nèi)TH蛋白質(zhì)含量與細(xì)胞內(nèi)THmRNA含量是同步降低的，有實(shí)驗(yàn)表明未修飾的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞植入紋狀體內(nèi)可顯著提高中腦內(nèi)DA的含量[30]，但并不穩(wěn)定，且提高的含量有限。因此，本實(shí)驗(yàn)采用TH基因修飾的干細(xì)胞植入紋狀體內(nèi)，使其表達(dá)TH基因，使HUMSCs具有DA能神經(jīng)細(xì)胞的部分特征；另一方面，共表達(dá)EGFP作為指示劑，是TH基因表達(dá)及移植細(xì)胞遷移的客觀觀察指標(biāo)，本研究中TH和EGFP的共表達(dá)率為88.6%，使HUMSCs在PD大鼠移植后的追蹤及TH的表達(dá)更為直接和可視化。

本研究移植TH修飾的HUMSCs后，熒光顯微鏡下觀察顯示4周時(shí)，外源性細(xì)胞主要分布注射點(diǎn)附近，8周時(shí)，開始向周圍遷移，12周時(shí)遷移至皮質(zhì)周圍。PD組模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為在4周時(shí)，與對(duì)照組相比，下降了約16%，統(tǒng)計(jì)顯示P>0.05，8周時(shí)，下降了45%，12周時(shí)，下降了60%，統(tǒng)計(jì)顯示均P<0.05，與免疫組化結(jié)果相一致。熒光顯微鏡下觀察提示了HUMSCs在大鼠冠切面上可以在室管膜下沿腦室呈帶狀分布。由此初步認(rèn)為HUMSCs可以穿過(guò)血腦屏障而在腦組織內(nèi)存活，與此前研究中發(fā)現(xiàn)骨髓源及胎源干細(xì)胞可以通過(guò)血腦屏障相類似[9]，但是其通過(guò)血腦屏障機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)對(duì)于單純的臍血腦內(nèi)移植治療PD[31]，經(jīng)基因TH修飾的細(xì)胞活動(dòng)范圍更大，存活時(shí)間更長(zhǎng)。

TH基因修飾的HUMSCs可以通過(guò)腦室移植途徑對(duì)PD大鼠起到一定的治療作用，為基礎(chǔ)研究和臨床治療提供了依據(jù)，HUMSCs雖然在腦內(nèi)可以表達(dá)TH抗原，但是否能分泌多巴胺，除了表達(dá)TH外，是否能分化為其他相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)類細(xì)胞，如：腎上腺能，膽堿能神經(jīng)元等，都有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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